一种选育小麦条锈病持久抗性材料的方法与流程

本发明属于小麦抗病育种领域，具体涉及一种选育小麦条锈病持久抗性材料的方法。

背景技术：

小麦条锈病是由小麦条形柄锈菌(pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的真菌性气传病害，可导致小麦区域性减产0.1-5％，严重时减产达5-25％。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，曾多次爆发条锈病大流行，据统计，2002-2012年我国条锈病平均发生面积约420万hm²/年，对小麦生产构成巨大威胁。小麦条锈菌夏孢子可随气流进行远距离传播的特性，使其能迅速引起病害垮地区循环流行，属大区流行病害。

利用抗条锈病基因选育抗病品种是控制条锈病最经济和环保的方式。基于对小麦条锈病的抗性反应，小麦条锈病抗性基因分为两类：全生育期抗性(苗期抗性)和成株期抗性。全生育期抗性(苗期抗性)通常持续整个生育阶段，该抗性基因具有小种专化性，抗性水平高，易于观察，属质量性状遗传。而成株期抗病基因一般对广泛的病原菌均有一定抗性，抗性水平低，不易观察，属数量性状遗传。由于在小麦条锈病育种中，育种者更加倾向于使用抗性水平高、易于观察的全生育期抗性基因，对小麦条锈菌施加了巨大的选择压，导致条锈菌优势生理小种变异快、新生理小种易出现，这是导致小麦条锈病抗性快速丧失的主要原因。开发利用抗性持久且不具小种专化性的成株期抗性基因，是控制条锈病的一个长治有效措施。但面临的问题是单个或少数成株期抗性基因或者qtl提供的抗性达不到生产中对小麦品种抗性水平的要求。

技术实现要素：

本发明的目的包括：

提供一种解决苗期抗性和成株期抗性基因单独利用局限的育种方法；

提供一种选育小麦条锈病抗性持久、稳定育种材料的方法。

具体的，本发明提供了一种选育小麦条锈病持久抗性材料的方法，包括以下步骤：

1)收集小麦条锈病菌种，接种鉴定筛选出全生育期抗性材料p1；

2)以p1为母本，以含yr18成株期兼抗型材料p2为父本，配置杂交，获得杂交种f1；

3)以f1为母本，以p1为轮回亲本，进行多代回交；从bc1f1至bc5f1，每代回交前，先选择回交后代中的全生育期抗病株，在抽穗前摘取单株叶片提dna，采用yr18成株期兼抗型共显性标记进行检测，确保所选母本含有yr18成株期兼抗型基因，至得到抗性稳定的材料。

优选的，步骤1)所述小麦条锈病菌种为cyr29、cyr30、cyr31、cyr32、cyr33、v26和/或水源14，所述鉴定为室温混合小种高压鉴定；

步骤1)所述接种的接种材料为10p4-8、13p2-7和/或14p532。

优选的，步骤2)所述含yr18成株期兼抗型父本材料为13kg458和/或13kg662。

优选的，步骤3)所述回交为采用夏繁加代技术回交；

步骤3)所述yr18成株期兼抗型共显性sts标记为cslv34；

步骤3)所述的检测方法为分子标记检测，其中pcr扩增体系共20μl,包括2μl10×buffer、1utaqdna聚合酶、0.4μldntps、0.5μl引物、50ng模板dna，其中4种dntp的浓度各为10mmoll^–1，taqdna聚合酶的浓度为2.5uμl^–1，正、反向引物的浓度均为4μmoll–1；pcr扩增程序为：94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸2min,5个循环；94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环；最后94℃变性1min,57℃退火30s,72℃延伸5min；

所述引物的序列为：

正向引物：5′-gttggttaagactggtgatgg-3′；

反向引物：5′-tgcttgctattgctgaatagt-3′。

进一步的，将步骤3)pcr扩增产物进行电泳检测，扩增产物中出现150bp的条带，则材料含有yr18成株期兼抗型基因。

本发明还公开了以上任一项方法选育出的材料作为小麦抗条锈病品系参加品系比较实验或作为育种中间材料的用途。

所述yr18成株期兼抗型基因的核苷酸序列，可参见文献:krattingersg,lagudahes,spielmeyerw,singhrp,huerta-espinoj,mcfaddenh,bossolinie,selterll,kellerb.aputativeabctransporterconfersdurableresistancetomultiplefungalpathogensinwheat.science,2009,323:1360–1363

所述yr18成株期兼抗型共显性sts标记cslv34，可参见文献：lagudahes,mcfaddenh,singhrp,huerta-espinoj,barianahs,spielmeyerw.moleculargeneticcharacterizationofthelr34/yr18slowrustingresistancegeneregioninwheat.theorapplgenet,2006,114:21–30。有益效果

本发明方法采用混合小种高压鉴定和多代回交技术，将苗期抗病基因与yr18等成株期抗病基因结合，可高效培育得到条锈病持久抗性育种材料，为抗锈育种提供优异中间材料。

附图说明

图1小麦条锈病持久抗性高效选择技术流程图

图2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图

其中，☆符号表示单株含有目的基因，可选择做回交母本。

具体实施方式

实施例一、室温混合小种高压鉴定选择全生育期抗性材料p1试验。

将所收集的cyr29、cyr30、cyr31、cyr32、cyr33、v26、水源14等菌种混合备用，在温室中采用盆栽方式种植待筛选材料，每个材料播种5-8粒，待生长至1心1叶期，采用涂抹法接种混合菌种，接种后用加湿器加湿24h，保持黑暗条件，室温控制在10-16℃，之后调节室温至20℃左右，光照时间12h，接种后15-20d，待感病对照川育12充分发病后，鉴定待测材料的苗期抗病性，筛选出10p4-8、13p2-7、14p532等苗期抗病性好的优异材料。

实施例二、p1×p2杂交获得f1代试验。

以实施例1所筛选出的优异材料(10p4-8、13p2-7、14p532等)为母本p1，以已知含yr18成株期兼抗型材料(如13kg458、13kg662等)为父本p2，进行杂交组合配置，获得f1材料。

实施例三、回交试验及田间鉴定

利用实施例二所获得的f1材料为母本，以实施例二所述的同一含yr18成株期兼抗型材料(如13kg458、13kg662等)p2为父本，杂交获得bc1f1种质；下一代又以bc1f1为母本，以p2为父本，杂交获得bc2f1；照此方式，直至bc6f1，得到抗病目标性状及农艺性状稳定的材料yrp。以上实施过程在田间优势多小种诱发条件下开展，所选择的回交母本单株苗期及抽穗后条锈抗性表型均为高抗。诱发材料与回交试验材料相间种植，分别于1心1叶期，3叶期和抽穗前采用涂抹法接种混合优势小种，苗期鉴定在第一接种后20-30d进行，成株期鉴定在抽穗后鉴定。正季世代在成都新都试验农场开展，夏季繁殖加代在西昌螺髻山进行。

实施例四、回交后代的全生育期抗病株yr18成株期兼抗型基因鉴定试验。

在实施例三所选择的母本材料杂交前先提取dna，利用共显性sts标记cslv34进行yr18成株期兼抗型基因筛选，pcr反应体系共20μl,包括2μl10×buffer、1utaqdna聚合酶(2.5uμl–1)、0.4μldntps(4种dntp的浓度均为10mmoll–1)、0.5μl引物(4μmoll–1)、50ng模板dna。pcr程序为94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸2min,5个循环；94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环；最后94℃变性1min,57℃退火30s,72℃延伸5min。pcr扩增产物通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，预期扩增产物为150bp(含目的基因)和229bp(不含目的基因)。选择含扩增产物为150bp的单株为实施例三中的回交母本。

6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试验：

1、玻璃板准备：将一块为平板和一块为凹槽板用清水充分冲洗干净，再用无水乙醇擦洗一遍，然后通风晾干。

2、涂板：待酒精干后，在凹槽板上均匀涂抹剥离硅烷，晾干；在平板上均匀涂抹亲和硅烷(亲和硅烷原液8ul+冰乙醇8ul+无水乙醇2ml)，晾干。

3、装板：玻板在下，电泳槽板在上，将边条置于2板之间的两侧，对齐后，用兰对夹子将波板与电泳槽板夹紧，水平放置。

4、灌胶；量取50ml6％的聚丙締酷胺凝胶溶液，加入350ulaps(即10％的过硫酸锭和28ultemed)，倒入灌胶器并混匀，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，然后将梳子的平直面插入胶口中，注意不要起汽泡，放置1小时左右。

5、预电泳：取下夹子，拔出倒插的梳子，将胶板放入电泳糟，卡紧，灌入缓冲液，即ixtbe。80w衡功率电泳半小时。

6、点样：拔出梳子，用移液枪吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，再用移液枪将毎个梳孔吹干净，开始点样。

7、电泳：80w衡功率电泳1小时左右。

8、银染：将胶板从电泳槽中取下，分开两玻璃板，将带胶的玻璃板胶面朝上放入银染15min，银染过程需要避光。

9、水洗：将玻璃板从银染液取出，用蒸链水快速水洗15s。

10、显影：将水洗完的玻璃板放入显影液，直至条带清晰。

11、再次水洗：用自来水轻接冲洗一会，将胶面上的naoh洗掉，放置晾干。

12、统计观察：将玻璃板放置在观片灯上可直接统汁条带数据；

部分回交后代的凝胶检测结果，如说明书附图2所示。

序列表

<110>四川省农业科学院作物研究所

<120>一种选育小麦条锈病持久抗性材料的方法

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gttggttaagactggtgatgg21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgcttgctattgctgaatagt21