无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达PPRVH/F蛋白疫苗的构建的制作方法

本发明涉及一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，还涉及由此系统构建得到的双表达小反刍兽疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus，pprv)h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗及其构建方法和应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术：

小反刍兽疫(pestedespetitsofruminants，ppr)和山羊痘(goatpox，gp)是分别由副黏病毒科(paramyxoviridae)麻疹病毒属(morbolivirus)的小反刍兽疫病病毒(pestedespetitsofruminants，pprv)和正痘病毒科(orthopoxvirus)山羊痘病毒属(capripoxvirus)的山羊痘病毒(goatpoxvirus，gpv)引起的危害绵羊和山羊等小反刍动物的2种重大疫病。其中ppr长期以来一直在非洲、中东、中亚、南亚及东南亚地区流行，该病作为一种危害巨大的跨国动物疫病，2007年传入我国西部边境地区并导致疫情发生。2013年12月至2014年，我国15个以上省份发生小反刍兽疫疫情造成重大的经济损失。同时，山羊痘多年来在世界和我国大部分地区表现为地方流行性，由于其降低产奶量、导致流产、损坏羊毛等，也造成了严重的经济损失。其和小反刍兽疫都是oie必须通报的重大疫病。

pprv结构蛋白中的血凝蛋白(h)蛋白和融合蛋白(f)是病毒两个重要的糖蛋白，介导病毒传染及激发宿主的免疫保护作用。其中h蛋白作为病毒和宿主细胞膜结合过程中的受体，具有调节病毒吸附并渗入寄主细胞的作用，并刺激机体产生中和抗体，参与体液免疫，是机体主要的保护性抗原，也是引起宿主细胞发生病变的主要决定因素。f糖蛋白具有细胞融合活性，是决定病毒感染成功与否的关键因素，能够引起病毒诱导的细胞病变，还具有病毒诱导细胞溶血素、细胞溶合和启动感染等其他生物学活性，也是pprv诱导中和抗体形成的主要免疫原。f蛋白诱导的中和抗体水平较h蛋白低，主要参与细胞免疫，即使很低的中和抗体水平也能够提供ppr强毒攻击保护。因此，能够同时表达pprvh/f蛋白的重组山羊痘病毒免疫羊可以提供更加全面的免疫保护。但是之前构建的小反刍兽疫重组病毒，一般只表达h或f其中一种蛋白，或将h和f蛋白进行融合(可能会导致抗原性发生变化)提供的免疫保护并不全面，增加病毒在免疫压力不足情况下产生变异突变的概率，从而产生新的免疫逃避机制。

山羊痘病毒弱毒疫苗预防gp安全有效。目前，山羊痘病毒已被广泛用作活疫苗载体，其具有以下优点：基因组庞大约150kb，遗传稳定；其胸苷激酶(tk)基因编码区为复制非必需区，可允许大容量的外源基因插入和表达(至少25kb)；gpv感染宿主谱狭窄，只感染羊等小反刍动物；生产成本低廉、储藏运输无需冷冻、使用方便；特别重要的是，采用gp弱毒疫苗为载体构建ppr-gp重组二联活疫苗，可同时预防gp、绵羊痘和ppr，实现一种活毒疫苗预防多种烈性传染病，而且能够作为diva(differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals)疫苗使用来区分自然感染和疫苗免疫感染，对中国广大非疫区的ppr血清学监测极为重要。目前，羊痘病毒作为载体已经用于构建重组疫苗，如狂犬病重组疙瘩皮肤病病毒疫苗(疙瘩皮肤病为羊痘病毒一个亚型)、牛瘟重组山羊痘病毒疫苗、蓝舌病毒重组山羊痘病毒疫苗、小反刍兽疫重组山羊痘病毒疫苗等，都显示了良好的免疫效果。

虽然传统的ppr弱毒疫苗能够提供充分的保护效力，但是其由于不能够作为diva疫苗区分自然感染和疫苗接种感染，干扰该病的血清学监测，影响该病的净化和根除。针对ppr，已有诸多报道采用各种病毒载体ppr重组疫苗，如分别表达pprv全长融合蛋白(f)和血凝蛋白(h)的重组牛痘病毒疫苗(mva-h,mva-f)，表达pprvh蛋白的重组羊痘病毒疫苗，以腺病毒为载体表达pprvh和f蛋白的重组病毒疫苗(rad-h,rad-f,rad-f-h)等，这些都是单基因表达，或者将h和f蛋白融合后表达(可能会影响蛋白结构进而影响抗原性)，不能提供天然、全面的免疫保护。其中羊痘作为载体的时候，由于其容易聚集、不易分散，需要复杂的纯化过程，包括反复药物筛选、噬斑克隆、超声分散等方法综合使用。在之前本发明发明人构建的表达pprvh或f蛋白的重组山羊痘病毒的过程中，进行了10代次以上的纯化，工作量巨大。同时，为了易于纯化，使用了绿色荧光蛋白(gfp)作为示踪标签和gpt作为药物筛选基因，使得插入序列更长，额外增加了不必要的免疫原，这对重组病毒疫苗将来的临床应用埋下潜在的不利影响。

为了克服山羊痘重组病毒构建方法的缺点，并同时构建提供更全面免疫原性的同时表达小反刍兽疫h和f蛋白的重组山羊痘病毒，本发明在世界范围内首次建立了无需噬斑克隆和无筛选标记的创新的重组山羊痘病毒构建系统，并利用其构建了双表达pprvh和f蛋白的重组山羊痘病毒，最后对其免疫原性进行了评估。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统。

本发明的目的之二在于提供由所述系统构建得到的双表达小反刍兽疫病毒h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗及其构建方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统，包括以下部分：

(1)重组山羊痘病毒：

所述的重组山羊痘病毒的tk基因中依次插入有apai酶切位点、egfp基因、ires序列、gpt基因、p11启动子序列、p7.5启动子序列以及noti酶切位点，命名为rgpv-na；

(2)用于插入外源基因的双表达质粒载体：

所述的双表达载体按照以下方法构建得到：以tk-f和tk-r为引物，以提取的gpv基因组为模板，扩增tk基因，并克隆至xhoi和ecori双酶切的psp72质粒，命名为psp72-tk；以p7.5-4-f和p7.5-4-r为引物、质粒ptk-gpt-ires-egfp为模板pcr扩增p7.5启动子片段，命名为p7.5-4；同时以psp72-tk-f和psp72-tk-r为引物，以psp72-tk质粒为模板，pcr扩增出psp72-tk片段；将psp72-tk片段和p7.5-4片段分别用nhei和saci双酶切并连接，获得质粒psp72-tk-p7.5-4；以p7.5-interval-f和p7.5-interval-r为引物，以pprv基因组全长cdna克隆为模板，扩增用于隔开两个p7.5启动子的间隔序列p7.5-interval；以p7.5-5-f和p7.5-5-r为引物，质粒ptk-gpt-ires-egfp为模板，pcr扩增p7.5启动子片段，命名为p7.5-5；以psp72-tk-p7.5-4-f和psp72-tk-p7.5-4-r为引物，以质粒psp72-tk-p7.5-4为模板，pcr扩增出psp72-tk-p7.5-4片段；采用一步克隆法试剂盒将以上p7.5-interval、p7.5-5和psp72-tk-p7.5-4连接到一起，获得用于插入外源基因的双表达质粒载体，命名为ptk-p7.5-4-5-double质粒；

(3)用于病毒重组的宿主细胞。

在所述的山羊痘病毒重组系统中，优选的，所述的重组山羊痘病毒通过以下方法制备得到：

(1)穿梭质粒ptk-na的构建：

以na-f和na-r为引物和质粒ptk-gpt-ires-egfp为模板，扩增gpt-ires-egfp序列，并在两端分别引入noti和apai酶切位点；以ptk-f和ptk-r为引物和ptk-gpt-ires-egfp为模板，扩增包含质粒和tk基因的pcr片段，命名为ptk；用一步克隆试剂盒将含有noti和apai酶切位点的gpt-ires-egfppcr片段和ptkpcr片段连接，获得穿梭质粒，命名为ptk-na；

(2)重组山羊痘病毒的构建

lt细胞生长于6孔板中，至细胞长至密度80％，接种gpv病毒液，37℃感作1h后，转染穿梭质粒ptk-na，联合gpt、gfp和噬斑克隆等筛选方法，最终获得纯化的含有noti和apai的重组gpv，命名为rgpv-na。

在所述的山羊痘病毒重组系统中，优选的，所述的pprv基因组全长cdna克隆为pprv/n75/1疫苗株的全长cdna克隆。

在本发明的一个具体实施例中，所述的pprv/n75/1疫苗株的全长cdna克隆记载在申请号为201010559545.8，发明名称为“小反刍兽疫病毒反向遗传操作系统及其应用”的中国专利申请中，在该申请中记载了pci-pprv的质粒序列(从5′端到3′端)，其中1154-17101为pprv/n75/1基因组序列，即pprv/n75/1疫苗株的全长cdna克隆。

进一步的，本发明还提出了所述的山羊痘病毒重组系统在构建同时表达1个或两个以上外源基因且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗中的用途。

其中，优选的，所述的山羊痘病毒重组系统用于构建同时表达1-4个外源基因且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗。

在本发明的一个具体实施例中，所述的重组山羊痘病毒疫苗为双表达小反刍兽疫病毒h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒疫苗。

一种使用所述的山羊痘病毒重组系统构建双表达小反刍兽疫病毒h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒的方法，包括以下步骤：

(1)以f-double-f/f-double-r和h-double-f/h-double-r为引物，以pprv基因组全长cdna克隆为模板，扩增出的pprvf和pprvh片段分别以xbai/spei和pmei/hindiii双酶切，依次克隆至ptk-p7.5-4-5-double质粒的xbai/saci和smai/hindiii位点，最终获得质粒ptk-p7.5-double-double-pprv-h/f；

(2)双表达小反刍兽疫病毒h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒的拯救

lt细胞生长于6孔板中，至细胞长至密度80％，接种禽痘病毒，37℃感作1h后，转染ptk-p7.5-double-pprv-h/f及noti/apai酶切后的rgpv-na基因组，转染后观察绿色荧光蛋白表达及细胞病变，待试验孔出现cpe及绿色荧光噬斑时，同时阴性对照孔没有绿色荧光噬斑时，收获细胞及其培养上清，反复冻融3次，于-80℃保存，获得双表达小反刍兽疫病毒h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒，命名为rgpv-pprv-h/f。

其中，优选的，步骤(2)中ptk-p7.5-double-pprv-h/f及noti/apai酶切后的rgpv-na基因组的质量比为1:3。

进一步的，本发明还提出了按照所述的方法构建得到的双表达小反刍兽疫病毒h和f蛋白且无筛选标签的重组山羊痘病毒及其在制备预防或治疗小反刍兽疫和山羊痘药物中的用途。

山羊痘病毒gpv具有较强的细胞结合特性，难以分散，使重组型病毒与野生型紧密相伴，又由于缺失了tk基因，亲本毒的复制能力比重组型较强，进一步给重组病毒的克隆纯化带来了更大的困难。山羊痘病毒为双链dna病毒，其基因组dna没有感染性，但是在禽痘的辅助下就能够在体外成功拯救出病毒，这为重组痘病毒的改造和构建提供了新的策略。为了提高重组痘病毒的构建效率，本发明首先在gpv基因组中引入noti和apai这两个酶切位点，并通过这两个酶切位点切断基因组，这样可以彻底避免亲本毒被拯救出来，从而避免最繁琐的纯化工作。然后通过与含有同源臂的质粒同源重组，将断裂的gpv基因组连接起来，同时引入外源基因，从而实现重组病毒构建的目的。这个策略与以前表达pprvh或f蛋白的重组山羊痘病毒研究相比较，只需要一步就能够拯救出不含有亲本毒的重组山羊痘病毒，节省了繁杂耗时的克隆、筛选和纯化过程，大大节约试验时间和劳力。此外，本发明建立的新型gpv重组系统获得的重组病毒，不需要任何筛选标签(如egfp或gpt等)，避免了筛选标签对疫苗使用中可能存在的一些潜在不利影响，例如增加重组病毒的不必要的表达负担，减少标签基因在自然界重组导致散播的风险等。

之前本发明发明人构建了分别单表达pprvh或f蛋白的重组山羊痘病毒[chenw,hus,qul,huq,zhangq,zhih,etal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010；28:4742-50.]，并且其他研究者也采用了该策略，这是由于目前的构建策略的缺陷造成的，筛选基因占用了表达资源。虽然h或f单个抗原已经能够提供足够的免疫效力，但是如果能够同时表达两个免疫原，那么将提供更全面的免疫保护，并且可以减少免疫剂量，减少成本。其中h能够诱导较高的中和抗体而有利于免疫效力监测，而f抗原能够提供更高的病毒攻击保护。因此，本发明利用前面建立的高效的无筛选标记的羊痘病毒重组系统，尝试构建双表达h和f的重组山羊痘病毒。为此，我们首先构建双p7.5启动子(背靠背连接)的重组质粒。但是，在构建psp72-tk-p7.5-h/f双表达质粒时，尝试将p7.5启动子背靠背直接连接在一起时，始终无法获得稳定的质粒(结果未显示)。因此，在这两个启动子之间插入了pprv基因组中的一段序列(3298-4315)，最终将两个启动子以背靠背的方式连接在一起。pprvh基因与f基因分别在p7.5启动子的作用下转录表达，可以达到该启动子的最大启动效率，而使用ires连接两个基因时，ires后面的基因的表达效率降低几倍，导致疫苗免疫效力的下降，这也是为什么传统的采用筛选基因的系统一般不采用ires双表达两个抗原的原因。

由于pprv是oie规定的必须通报的烈性传染病，强毒病原操作需要严格的生物安全设施，该病在我国作为新发传染病，攻毒试验是不被允许的，因此采用中和抗体效价评价疫苗的免疫效力符合我国国情。oie也推荐采用中和抗体检测为pprv疫苗保护效力评价指标，中和抗体效价大于等于10则表明抗体转阳。rgpv-pprv-h/f在第二次免疫免疫14天，所有羊的pprv中和抗体转阳率即达到100％(10/10)，表明其具有良好的免疫效力。同时，gpv中和抗体效价转阳率也达到100％，与之前报道的结果相似。综合法国和我们的

综上，本发明在世界范围内首先建立了无筛选标签的羊痘重组病毒构建的方法，并在该方法的基础上构建了双表达pprvh和f蛋白的、无筛选标签的重组山羊痘病毒，研究结果表明，该无标签、双表达的重组病毒能够诱导比单抗原表达更全面的细胞和体液免疫，应该具有对pprv强毒攻击的完全免疫保护作用，可以同时预防ppr和羊痘两种重大疫病，同时诱导的足够高的中和抗体有利于免疫血清学监测，因此该方法和重组疫苗都具有良好的应用前景。

附图说明

图1为ptk-na质粒示意图；

图2为ptk-p7.5-4-5-double双表达质粒载体示意图；

图3为rgpv-na的鉴定；

a:rgpv-na感染lt细胞表达绿色荧光蛋白，而gpv感染lt细胞显示绿色荧光阴性(negativecontrol)；b:pcr鉴定外源基因插入，m为5000dnamarker，泳道1为以tk为引物、rgpv-na基因组为模板，泳道2为以tk为引物、gpv基因组为模板；c:泳道1为未酶切的rgpv-na基因组，泳道2为noti和apai双酶切的rgpv-na基因组，m为lowrangepfgmarker；

图4为rgpv-pprvh/f的pcr鉴定；

a：m为dnamarker，泳道1为pprvf基因特异引物鉴定gpv，泳道2为pprvf基因特异引物鉴定rgpv-pprvh/f，泳道3为pprvh基因特异引物鉴定gpv，泳道2为pprvh基因特异引物鉴定rgpv-pprvh/f；b：m为dnamarker，泳道5为tk特异引物鉴定gpv，泳道6为tk特异引物鉴定rgpv-pprvh/f；

图5为免疫荧光检测rgpv-pprv-h/f感染lt细胞表达pprvh蛋白和f蛋白。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1双表达pprvh和f蛋白重组山羊痘病毒疫苗的构建

1材料和方法

1.1病毒株与细胞

pprv弱毒疫苗株(nigeria/75/1)和gpv温度敏感弱毒疫苗株(cvccav41)为中国兽医药品监察所提供；原代羔羊睾丸细胞(lambtestis,lt)用1月龄公绵羊睾丸经常规方法制备，采用含10％胎牛血清的mem培养；vero细胞用含有10％胎牛血清的dmem培养。gpv或重组gpv的扩增与滴定均采用含2％胎牛血清的mem和在lt细胞上进行。pprv弱毒疫苗株(nigeria/75/1)的扩增与滴定采用含2％胎牛血清的dmem在vero细胞上进行。

1.2主要试剂与仪器

各种限制性内切酶、phantadna聚合酶、同源重组酶购自vazyme公司，t4dna连接酶购自thermo公司；预染蛋白marker、dnamarker购自takara公司；ptk-gpt-ires-egfp质粒[曲林茂,陈伟业,胡倩倩,胡森,张倩,支海兵等.表达小反刍兽疫病毒f蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究.中国预防兽医学报.2009；31:415-20.]由本实验室构建并保存；荧光倒置显微镜为zeiss公司产品，dmem、mem细胞培养基购自hyclone公司，胎牛血清购自excell公司,tritc和fitc分别标记的羊抗鼠igg、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg都购自sigma公司；脂质体3000转染试剂盒购自invitrogen公司。

1.3质粒构建

以na-f和na-r为引物(表1)和质粒ptk-gpt-ires-egfp为模板，采用高保真phantadna聚合酶扩增gpt-ires-egfp序列，在两端分别引入noti和apai酶切位点。以ptk-f和ptk-r为引物(表1)和ptk-gpt-ires-egfp为模板，采用高保真phantadna聚合酶扩增包含质粒和tk基因pcr片段，命名为ptk。用一步克隆试剂盒(onestepcloningkit，vazyme)将含有noti和apai酶切位点的gpt-ires-egfppcr片段和ptkpcr片段连接，获得ptk-na质粒(图1)。

以tk-f和tk-r为引物(表1)，以血液/细胞/组织基因组提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)提取的gpv基因组为模板，扩增tk基因，并克隆至xhoi和ecori双酶切的psp72质粒，命名为psp72-tk。以p7.5-4-f和p7.5-4-r为引物(表1)、质粒ptk-gpt-ires-egfp为模板pcr扩增p7.5启动子片段，命名为p7.5-4；同时以psp72-tk-f和psp72-tk-r为引物(表1)，以psp72-tk质粒为模板，pcr扩增出psp72-tk片段；将psp72-tk片段和p7.5-4片段分别用nhei和saci双酶切并连接，获得质粒psp72-tk-p7.5-4；以p7.5-interval-f和p7.5-interval-r为引物(表1)，以pprv基因组全长cdna克隆[huq,chenw,huangk,baronmd,buz.rescueofrecombinantpestedespetitsruminantsvirus:creationofagfp-expressingvirusandapplicationinrapidvirusneutralizationtest.vetres.2012；43:48.，申请号为201010559545.8，发明名称为“小反刍兽疫病毒反向遗传操作系统及其应用”的中国专利申请]为模板，扩增用于隔开两个p7.5启动子的间隔序列p7.5-interval(由于经过反复试验尝试，两个p7.5启动子直接背靠背连接得不到稳定的质粒，因此插入间隔序列提高质粒稳定性，数据未显示)；以p7.5-5-f和p7.5-5-r为引物(表1)，质粒ptk-gpt-ires-egfp为模板，pcr扩增p7.5启动子片段，命名为p7.5-5；以psp72-tk-p7.5-4-f和psp72-tk-p7.5-4-r为引物，以质粒psp72-tk-p7.5-4为模板，pcr扩增出psp72-tk-p7.5-4片段；采用一步克隆法试剂盒(onestepcloningkit，vazyme)将以上p7.5-interval、p7.5-5和psp72-tk-p7.5-4连接到一起，获得ptk-p7.5-4-5-double质粒(图2)；最后分别以f-double-f/f-double-r和h-double-f/h-double-r为引物，以pprv感染性克隆为模板，扩增出的pprvf和pprvh片段分别以xbai/spei(其中spei需平滑化)和pmei/hindiii双酶切，依次克隆至ptk-p7.5-4-5-double质粒的xbai/saci(其中saci需平滑化)和smai/hindiii位点(其中spei和saci的平滑化采用takara公司的dnabluntingkit进行处理)，最终获得质粒ptk-p7.5-double-pprv-h/f。

1.4插入na酶切位点的重组gpv的筛选和鉴定

lt细胞生长于6孔板中，至细胞长至密度80％左右，按0.1感染复数(moi)值接种gpv病毒液，37℃感作1h后，再根据脂质体3000转染试剂盒(invitrogen)的操作说明书转染穿梭质粒ptk-na。联合gpt、gfp和噬斑克隆等筛选方法[chenw,hus,qul,huq,zhangq,zhih,etal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010；28:4742-50.]，最终获得纯化的含有noti和apai的重组gpv，命名为rgpv-na。将rgpv-na在细胞工厂(鼎昊源dhs)中大量扩增，收获的细胞和培养上清液反复冻融3次；3000g高速离心20min后，弃沉淀，收获的上清液经90000g超速离心2h后，取沉淀并已发表参考文献的方法[liuj,chenp,jiangy,wul,zengx,tiang,etal.aduckenteritisvirus-vectoredbivalentlivevaccineprovidesfastandcompleteprotectionagainsth5n1avianinfluenzavirusinfectioninducks.jvirol.2011；85:10989-98.]提取完整的病毒基因组。之后，以rgpv-na的基因组为模板，以tk-f和tk-r为引物[表1]为引物，进行pcr鉴定外源基因的插入，同时设gpv为阴性对照。接着用noti和apai双酶切上述纯化的基因组，并纯化酶切的病毒基因组，最后进行脉冲场凝胶电泳电泳分析。

表1.引物设计

1.5rgpv-pprv-h/f病毒的拯救

lt细胞生长于6孔板中，至细胞长至密度80％左右，按感染复数(moi)为1值接种禽痘病毒，37℃感作1h后，根据脂质体3000转染试剂盒(invitrogen)的说明书转染ptk-p7.5-double-pprv-h/f质粒(1μg)及noti/apai酶切后的rgpv-na基因组(3μg)，同时设未酶切的rgpv-na基因组作为阳性对照，设酶切后的rgpv-na基因组作为阴性对照。转染后观察绿色荧光蛋白表达及细胞病变(cytopathiceffect,cpe)。待试验孔出现cpe及绿色荧光噬斑时，同时阴性对照孔没有绿色荧光噬斑时，收获细胞及其培养上清，反复冻融3次，于-80℃保存，获得的重组病毒命名为rgpv-pprv-h/f。

1.6重组病毒pcr鉴定

用血液/细胞/组织基因组提取试剂盒提取rgpv-pprv-h/f基因组，分别用pprv-h引物和pprv-f引物通过pcr鉴定h及f基因的插入，以tk-f和tk-r为引物[表1]，通过pcr和测序鉴定插入序列，同时设亲本毒为阴性对照。

1.7间接免疫荧光试验

参考之前发表文献[chenw,hus,qul,huq,zhangq,zhih,etal.agoatpoxvirus-vectoredpeste-des-petits-ruminantsvaccineinduceslong-lastingneutralizationantibodytohighlevelsingoatsandsheep.vaccine.2010；28:4742-50.]中的方法进行操作，即将rgpv-pprv-h/f感染lt细胞后，待cpe达到约20％时，分别以pprvh单抗[huq,chenw,huangk,baronmd,buz.rescueofrecombinantpestedespetitsruminantsvirus:creationofagfp-expressingvirusandapplicationinrapidvirusneutralizationtest.vetres.2012；43:48.]和鼠源pprvf多抗为一抗[曲林茂,陈伟业,胡倩倩,胡森,张倩,支海兵,etal.表达小反刍兽疫病毒f蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究.中国预防兽医学报.2009；31:415-20.]，绿色荧光素(fitc)标记的山羊抗鼠igg为二抗进行免疫荧光检测，最后在荧光倒置显微镜下观察结果。

1.8动物免疫试验

选用15只6个月到1周岁绵羊，其小反刍兽疫和山羊痘病毒中和抗体都为阴性，随机分为2组，其中第一组(1-10号)经皮内注射途径接种10⁴tcid50的rgpv-pprv-h/f，，第二组(11-15号)接种gpv为阴性对照。首次免疫后第21天以相同剂量和相同免疫途径进行二次加强免疫。分别于免疫前及二次免疫后两周采集静脉血并分离血清，于56℃30min灭活后，进行pprv和gpv中和抗体效价检测。

1.9病毒中和试验

pprv中和试验和gpv中和试验分别参照之前发表的文献进行，中和抗体效价≥10判断为阳性。

2.结果

2.1rgpv-na的鉴定

rgpv-na接种lt细胞5-8天后，显示绿色荧光阳性，而只接种gpv的细胞，显示绿色荧光阴性(图3a)，表明rgpv-na能够正确表达egfp。同时，采用针对tk同源臂的引物进行pcr鉴定，结果显示rgpv-na扩增出的目的条带为约3000bp，为tk同源臂与插入片段的总和，与预期相符(图3b)，而gpv扩增片段仅为tk基因序列(736bp)，无插入序列。同时测序结果也证明插入序列正确(数据未显示)。rgpv-na基因组以noti和apai进行双酶切后的脉冲场凝胶电泳结果显示，未酶切的基因组大小为152kb(图3c，泳道1)，双酶切的基因组出现93kb和56kb两条条带(图3c，泳道2)，与预期结果相符。综上，成功构建引入noti和apai两个酶切位点的重组gpv。

2.2rgpv-pprvh/f的pcr鉴定

提取rgpv-pprvh/f和亲病毒gpv的基因组dna，用特异扩增pprv-h基因和f基因的引物鉴定插入的目的基因，同时以亲本毒gpv作为对照。结果表明，rgpv-pprvh/f分别扩出了1650bp(f基因，图4a泳道2)和1839bp(h基因，图4a泳道4)的条带，而亲本毒gpv都未扩增出相应条带(图4a泳道1和3)。另外，为了鉴定h和f基因是否正确地插入tk基因中间，用tk-f和tk-r为引物进行pcr，同时以亲本毒gpv作为对照。结果显示，rgpv-pprvh/f扩增出5955bp(图4b泳道6)的条带，而亲本毒gpv仅扩增出736bp的tk基因序列(图4b泳道5)，表明已经成功构建了插入pprvh和f基因的重组gpv，命名为rgpv-pprv-h/f。

2.3间接免疫荧光试验

为了验证rgpv-pprv-h/f是否能够成功表达h和f蛋白，分别以鼠源pprvh单抗和鼠源pprvf多抗为一抗，以绿色荧光素(fitc)标记的山羊抗鼠igg为二抗，进行间接免疫荧光试验检测。结果表明，rgpv-pprv-h/f感染细胞分别与h单抗和f多抗发生绿色荧光阳性反应，而亲本毒gpv感染细胞和空白对照细胞则显示绿色荧光阴性(图5)，表明重组病毒能够同时表达pprvh和f蛋白。

2.4病毒中和试验

以10⁴tcid50rgpv-pprv-h/f和gpv分别免疫绵羊。二免14天，rgpv-pprv-h/f免疫组所有的免疫绵羊的pprv中和抗体效价均转阳(≥10)(表2)，所有免疫羊的gpv中和抗体也转为阳性(≥10)(表2)。

表2重组病毒免疫后pprv特异性中和抗体检测结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达pprvh/f蛋白疫苗的构建

<130>klpi170047

<160>20

<170>patentin3.5

<210>1

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

taagaatagttaaaaggtaccgggccccccgggctgcagttacttgtacagctc54

<210>2

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tatactgcgctatttggtaccgcggccgcgtcgaccggggatccgtcactgttctttatg60

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggtaccaaatagcgcagtataaatgttgtg30

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggtaccttttaactattcttatcaattcag30

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tttctcgaggaatcaccagagccga25

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cccgaattcaactcgtgtctgataccca28

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cccgctagaaatagcgcagtataaatgttgtgtag35

<210>8

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgagctcggtaccttttaactattcttatcaattcagtac40

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cccgctagccatctatatactata24

<210>10

<211>64

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tttccgcggggtaccgagctcctgcagtctagacggggatccgtcactgttatccgtcac60

tgtt64

<210>11

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

tactatatagtatatagatggctaattccacaagatgctaac42

<210>12

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

ggccgtagttgaacaccaccgctagccttggggtactgatg41

<210>13

<211>76

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

acagccatcagtaccccaaggctagcggtggtgttcaactacggccatgggggatctctg60

tgcatctatatactat76

<210>14

<211>

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

acatttatactgcgctatttggtaccaagcttcccggggtcgaccggggatccgtcactg60

tt62

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

ccaaatagcgcagtataaatg21

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ctatatagtatatagatggc20

<210>17

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ttttctagagccgccaccatgacacgggtcgcaac35

<210>18

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

ggcgggactagtataaaaattaattaactacagtgatctcacg43

<210>19

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

aatgtttaaacgccgccaccatgtccgcacaaagg35

<210>20

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ggcgggaagcttataaaaattaattaatcagactggattac41