一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒全序列的分子生物学方法及其引物与流程

本项发明主要涉及到植物病毒全序列的快速扩增及DNA重组技术，具体涉及朱顶红褪绿环斑病毒全序列的扩增、克隆转化及其专用引物。

背景技术：

朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)是2013年在中国云南发现的番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的新种，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)。该病毒危害极为严重，能够侵染朱顶红(Hippeastrum rutilum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、喜林芋(Philodendron bipinnatifidum)、烟草(Nicotiana tabacum)、蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis)、君子兰(Clivia miniata)等经济作物，引起染病植物出现坏死、坏死斑、同心环纹、叶片畸形等症。目前已在中国南部地区如云南、广东、广西、福建和海南等地鉴定出该病毒，危害极为严重。

HCRV病毒粒子呈球形，直径为80-120nm。其核酸为三分体基因组，从大到小分别为L，M，S序列，S RNA序列长约2745nt，正向编码一个非结构蛋白NSs(Non-structural protein by the small RNA)，反向编码核壳体蛋白NP(Nucleocapsid protein)。M RNA序列长约4762nt，正向编码一个非结构蛋白Nsm(Non-structural protein by the middle RNA)，反向编码糖蛋白前体Gn/G(Glycoproteins)。L RNA序列长约8908bp，编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。

基于HCRV病毒基因组序列比较长，目前还没有一种快速获得该病毒全序列的方法。正是因为该病毒序列较长，对该病毒序列进行克隆转化较为困难，导致NCBI数据库中公布的HCRV S，M和L序列各自分别仅有一条。而与HCRV同属于Tospovirus的番茄斑萎病毒(TSWV)，在NCBI数据库中已公布了上百条序列。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒全序列的分子生物学方法及其专用引物。

本发明的技术方案如下：

1.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒S序列的专用引物HCRV-S，该专用引物HCRV-S由HCRV-S前引物和HCRV-S后引物组成，所述HCRV-S前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述HCRV-S后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为2745bp。

2.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒M1序列的专用引物HCRV-M1，该专用引物HCRV-M1由HCRV-M1前引物和HCRV-M1后引物组成，所述HCRV-M1前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述HCRV-M1后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为2558bp。

3.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒M2序列的专用引物HCRV-M2，所述专用引物HCRV-M2由HCRV-M2前引物和HCRV-M2后引物组成，所述HCRV-M2前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述HCRV-M2后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为2383bp。

4.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L1序列的专用引物HCRV-L1，所述专用引物HCRV-L1由HCRV-L1前引物和HCRV-L1后引物组成，所述HCRV-L1前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述HCRV-L1后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，目标产物片段长度为3115bp。

5.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L2序列的专用引物HCRV-L2，所述专用引物HCRV-L2由HCRV-L2前引物和HCRV-L2后引物组成，所述HCRV-L2前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述HCRV-L2后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：10所示，目标产物片段长度为3337bp。

6.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L3序列的专用引物HCRV-L3，所述专用引物HCRV-L3由HCRV-L3前引物和HCRV-L3后引物组成，所述HCRV-L3前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，所述HCRV-L3后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：12所示，目标产物片段长度为3206bp。

7.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L4序列的专用引物HCRV-L4，所述专用引物HCRV-L4由HCRV-L4前引物和HCRV-L4后引物组成，所述HCRV-L4前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：13所示，所述HCRV-L4后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，目标产物片段长度为673bp。

8.一组快速获得朱顶红褪绿环斑病毒全序列的专用引物，它是由专用引物HCRV-S、专用引物HCRV-M1、专用引物HCRV-M2、专用引物HCRV-L1、专用引物HCRV-L2、专用引物HCRV-L3和专用引物HCRV-L4组成；

所述专用引物HCRV-S由HCRV-S前引物和HCRV-S后引物组成，所述引物HCRV-S前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述引物HCRV-S后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为2745bp；

所述专用引物HCRV-M1由HCRV-M1前引物和HCRV-M1后引物组成，所述HCRV-M1前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述HCRV-M1后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为2558bp；

所述专用引物HCRV-M2是由HCRV-M2前引物和HCRV-M2后引物组成，所述HCRV-M2前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述HCRV-M2后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为2383bp；

所述专用引物HCRV-L1由HCRV-L1前引物和HCRV-L1后引物组成，所述HCRV-L1前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述HCRV-L1后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，目标产物片段长度为3115bp；

所述专用引物HCRV-L2由HCRV-L2前引物和HCRV-L2后引物组成，所述HCRV-L2前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述HCRV-L2后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：10所示，目标产物片段长度为3337bp；

所述专用引物HCRV-L3由HCRV-L3前引物和HCRV-L3后引物组成，所述HCRV-L3前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，所述HCRV-L3后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：12所示，目标产物片段长度为3206bp；

所述专用引物HCRV-L4由HCRV-L4前引物和HCRV-L4后引物组成，所述HCRV-L4前引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：13所示，所述HCRV-L4后引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，目标产物片段长度为673bp。

9.一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒全序列的分子生物学方法，包括提取感染朱顶红褪绿环斑病毒样品的总RNA，RT-PCR，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆转化，测序和序列拼接；其特征在于：在对朱顶红褪绿环斑病毒进行序列扩增时，分别所用的引物是技术方案8所述的一组快速获得朱顶红褪绿环斑病毒全序列的专用引物。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明根据NCBI数据库中最早公布的HCRV-HLS1-2的S segment(GenBank登录号：JX833564.1)、M segment(GenBank登录号：JX833565.1)、HCRV L segment(GenBank登录号：HG763861.1)序列设计了7对特异性引物，其中针对HCRV的S序列设计了1对引物HCRV-S，可以直接扩增出HCRV S RNA的全序列(扩增片段长度：2745bp)。针对HCRV的M序列设计了2对引物，分别为HCRV-M1(扩增片段长度：2558bp)和HCRV-M2(扩增片段长度：2383bp)。针对HCRV的L序列设计了4对引物。分别为HCRV-L1(扩增片段长度：3115bp)，HCRV-L2(扩增片段长度：3337bp)，HCRV-L3(扩增片段长度：3206bp)，HCRV-L4(扩增片段长度：673bp)。扩增出这7个片段的PCR产物后，将其连接到T载体上，转化至感受态细胞中，通过菌液PCR筛选出阳性重组子后，每个片段送三个阳性重组子到测序公司进行测序。待测序公司返回的每个重组子的测序结果后，人工去掉序列上的载体序列，并利用NCBI将去掉载体序列的HCRV各片段进行Blast，确保序列是我们所需的目的序列，同时确保序列的方向是从5’到3’。然后利用DNAstar软件的Seqman程序对M1和M2进行序列拼接，获得HCRV的M全序列。对L1，L2，L3和L4进行序列拼接，获得HCRV的L全序列。目前，通过克隆转化的方法获得某基因组序列，一般都是克隆1000bp左右的序列，然后通过拼接的方法获得全序列，导致工作量极为巨大，试剂成本高昂。本发明具有快速，工作量小，可靠的特点，仅用7对引物就扩增出HCRV三条序列共16415bp的全序列，克隆转化所需载体及感受态细胞少，从而减少了获取病毒全序列所需要的时间以及成本，可以帮助快速的获取HCRV病毒的全基因组序列，方便研究人员对想要获得的HCRV病毒分离物进行全基因组分析。

因此，本发明不仅准确，可靠，特异性高，而且能够节省时间和成本。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是HCRV-S前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是HCRV-S后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是HCRV-M1前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是HCRV-M1后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是HCRV-M2前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是HCRV-M2后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：7所示的是HCRV-L1前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：8所示的是HCRV-L1后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：9所示的是HCRV-L2前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：10所示的是HCRV-L2后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：11所示的是HCRV-L3前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：12所示的是HCRV-L3后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：13所示的是HCRV-L4前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：14所示的是HCRV-L4后引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：15所示的是引物TSWV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：16所示的是引物TSWV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：17所示的是引物HCRV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：18所示的是引物HCRV-NP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：19所示的是引物CCSV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：20所示的是引物CCSV-NP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：21所示的是引物TZSV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：22所示的是引物TZSV-NP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：23所示的是引物INSV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：24所示的是引物INSV-NP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：25所示的是引物CaCV-NP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：26所示的是引物CaCV-NP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：27所示的是通用引物的前引物J13的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：28所示的是通用引物的后引物UHP的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：29所示的是HCRV-S全序列。

序列表中SEQ ID NO：30所示的是HCRV-M全序列。

序列表中SEQ ID NO：31所示的是HCRV-L全序列。

序列表中SEQ ID NO：32所示的是通用引物M13前引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：33所示的是通用引物M13后引物的碱基序列。

附图说明

图1：提取的葱莲样本总RNA电泳检测图，M泳道为2000bp分子量的marker，RNA泳道表示提取的葱莲总RNA。

图2：对采集到的葱莲样本进行病毒PCR鉴定的电泳图，泳道1到6为番茄斑萎病毒属病毒的特异性引物扩增产物，其中泳道1为HCRV-NP引物扩增条带，泳道2为CCSV-NP引物扩增条带，泳道3为TZSV-NP引物扩增条带，泳道4为CaCV-NP引物扩增条带，泳道5为TSWV-NP引物扩增条带，泳道6为INSV-NP引物扩增条带，泳道7是番茄斑萎病毒属通用引物扩增产物，M泳道是2000bp分子量的marker。

图3：本发明所设计的7对HCRV序列扩增引物：专用引物HCRV-S,专用引物HCRV-M1，专用引物HCRV-M2，专用引物HCRV-L1，专用引物HCRV-L2，专用引物HCRV-L3，专用引物HCRV-L4进行RT-PCR扩增，PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中泳道M为10000bp分子量的marker，S泳道为专用引物HCRV-S经PCR扩增的条带，M1为专用引物HCRV-M1经PCR扩增的条带，M2为专用引物HCRV-M2经PCR扩增的条带，L1为专用引物HCRV-L1经PCR扩增的条带，L2为专用引物HCRV-L2经PCR扩增的条带，L3为专用引物HCRV-L3经PCR扩增的条带，L4为专用引物HCRV-L4经PCR扩增的条带。

图4：专用引物HCRV-S经PCR扩增的HCRV-S产物经过克隆转化，挑取单菌落摇菌后的菌液PCR电泳图。M是10000bp的marker，其余泳道为挑取的20管HCRV-S片段的单菌落摇菌后的菌液PCR。

图5：专用引物HCRV-M1经PCR扩增的HCRV-M1产物经过克隆转化，挑取单菌落摇菌后的菌液PCR电泳图。M是10000bp的marker，其余泳道为挑取的20管HCRV-M1片段的单菌落摇菌后的菌液PCR。

图6：专用引物HCRV-L3经PCR扩增的HCRV-L3产物经过克隆转化，挑取单菌落摇菌后的菌液PCR电泳图。M是10000bp的marker，其余泳道为挑取的17管HCRV-L3片段的单菌落摇菌后的菌液PCR。

图7：专用引物HCRV-L4经PCR扩增的HCRV-L4产物经过克隆转化，挑取单菌落摇菌后的菌液PCR电泳图。其中M是10000bp的marker，其余泳道为挑取的20管HCRV-L4片段的单菌落摇菌后的菌液PCR。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明作进一步阐述，以便于更好地理解本发明。

下列实施例中实验方法无特殊说明的为常规方法，所用试剂、材料，均能从生化试剂公司等购买到。

实施例1本发明所用到的实验材料的采集及鉴定方法。

①样品的采集

本发明所用带毒植物样品采集自云南省昆明市具有坏死、褪绿、叶片畸形等HCRV病毒典型症状的葱莲(Zephyranthes candida)植株。

②RNA的提取

应用植物总RNA提取试剂盒(购置于北京全式金公司)从上述步骤①中取得的新鲜植株组织中提取RNA，操作步骤根据北京全式金公司植物总RNA提取试剂盒提供的使用说明操作(RNA电泳图见附图1)。

③RT-PCR鉴定该样品

本实验用大连宝生物工程有限公司(大连TaKaRa公司)提供的反转录试剂盒完成RT反应(反应体系见表1和续表1)，获得感病样本的cDNA。然后利用SuperMix酶(北京全式金公司)，以cDNA为模板，利用6对特异性引物和1对通用引物(引物信息见表3)进行扩增(反应体系见表2)。如果对应引物扩增出目的条带，则说明样品中有该病毒侵染。

表1 RT反应体系

置于PCR仪65℃孵育5min，置于冰上。

续表1 RT反应体系

RT反应程序：30℃10min，42℃30-60min，95℃5min。

表2 PCR反应体系

PCR反应条件：94℃5min，从94℃30sec，55℃30sec至72℃1min，35个循环，72℃10min。

表3葱莲样本鉴定所用引物信息

表3中：HCRV-NP表示扩增朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)的核壳体蛋白基因(Nucleocapsid protein，NP)的特异性引物，CCSV-NP表示检测马蹄莲褪绿斑病毒(Calla lily chlorotic spot virus，CCSV)NP基因的特异性引物，TZSV-NP表示扩增番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus，TZSV)NP基因的特异性引物，CaCV-NP表示扩增辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)NP基因的特异性引物，TSWV-NP表示扩增番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)NP基因的特异性引物，INSV-NP表示扩增凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)NP基因的特异性引物，J13表示番茄斑萎病毒属的通用引物的前引物，UHP表示番茄斑萎病毒属的通用引物的后引物。

④电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出对应引物目的条带的片段即为对应病毒侵染。本发明所用实验材料鉴定结果电泳图见图2，电泳结果显示特异性引物中仅有HCRV-NP引物能够扩增出目的条带，证明样品是HCRV侵染的。

实施例2本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒S序列的专用引物HCRV-S的设计和用该专用引物HCRV-S快速获得朱顶红褪绿环斑病毒S序列的方法。

①用引物HCRV-S及其设计与合成

专用引物HCRV-S是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒HLS1-2株系的S序列(GenBank登录号：JX833564.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-S，它是由HCRV-S前引物和HCRV-S后引物组成，所述HCRV-S前引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述HCRV-S后引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，该专用引物HCRV-S的目标产物是HCRV S RNA的全长即HCRV-S全序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，扩增片段长度为2745bp。

上述专用引物HCRV-S由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-S的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的专用引物HCRV-S进行PCR扩增。PCR反应体系见表4。

表4专用引物HCRV-S进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，从95℃20sec，50℃20sec至72℃1min30sec 40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出2745bp左右的片段即为HCRV的S片段。本实施例HCRV S片段扩增电泳图见图3中的S泳道。

实施例3本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒M1序列的专用引物HCRV-M1的设计和用该专用引物HCRV-M1快速获得朱顶红褪绿环斑病毒M1序列的方法。

①用引物HCRV-M1及其设计与合成

专用引物HCRV-M1是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒HLS1-2株系的M序列(GenBank登录号：JX833565.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-M1，它是由HCRV-M1前引物和HCRV-M1后引物组成，所述HCRV-M1前引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述HCRV-M1后引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，该专用引物HCRV-M1的扩增范围是HCRV M片段的1-2558bp，扩增片段长度为2558bp。

上述专用引物HCRV-M1由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-M1的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的专用引物HCRV-M1进行PCR扩增。PCR反应体系见表5。

表5专用引物HCRV-M1进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，从95℃20sec，50℃20sec至72℃1min15sec40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出2558bp左右的片段即为HCRV的M1片段。本实施例HCRV M1片段扩增电泳图见图3中的M1泳道。

实施例4本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒M2序列的专用引物HCRV-M2的设计和用该专用引物HCRV-M2快速获得朱顶红褪绿环斑病毒M2序列的方法。

①引物HCRV-M2及其设计与合成

专用引物HCRV-M2是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒HLS1-2株系的M序列(GenBank登录号：JX833565.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-M2，它是由HCRV-M2前引物和HCRV-M2后引物组成，所述HCRV-M2前引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述HCRV-M2后引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，该专用引物HCRV-M2的扩增范围是HCRV M片段的2380-4762bp，扩增片段长度为2383bp。

上述专用引物HCRV-M2由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-M2的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的专用引物HCRV-M2进行PCR扩增。PCR反应体系见表6。

表6专用引物HCRV-M2进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 15sec40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出2383bp左右的片段即为HCRV的M2片段。本实施例HCRV M2片段扩增电泳图见图3中的M2泳道。

实施例5本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L1序列的专用引物HCRV-L1的设计和用该专用引物HCRV-L1快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L1序列的方法。

①用引物HCRV-L1及其设计与合成

专用引物HCRV-L1是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒的L序列(GenBank登录号：HG763861.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-L1，它是由HCRV-L1前引物和HCRV-L1后引物组成，所述HCRV-L1前引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，所述HCRV-L1后引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，该专用引物HCRV-L1的扩增范围是HCRV L片段的1-3115bp，扩增片段长度为3115bp。

上述专用引物HCRV-L1由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-L1的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的专用引物HCRV-L1进行PCR扩增。PCR反应体系见表7。

表7专用引物HCRV-L1进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 30sec 40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出3115bp左右的片段即为HCRV的L1片段。本实施例HCRV L1片段扩增电泳图见图3中的L1泳道。

实施例6本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L2序列的专用引物HCRV-L2的设计和用该专用引物HCRV-L2快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L2序列的方法。

①用引物HCRV-L2及其设计与合成

专用引物HCRV-L2是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒的L序列(GenBank登录号：HG763861.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-L2，它是由HCRV-L2前引物和HCRV-L2后引物组成，所述HCRV-L2前引物的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，所述HCRV-L2后引物的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，该专用引物HCRV-L2的扩增范围是HCRV L片段的2654-5990bp，扩增片段长度为3337bp。

上述专用引物HCRV-L2由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-L2的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的专用引物HCRV-L2进行PCR扩增。PCR反应体系见表8。

表8专用引物HCRV-L2进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，从95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 45sec40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出3337bp左右的片段即为HCRV的L2片段。本实施例HCRV L2片段扩增电泳图见图3中的L2泳道。

实施例7本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L3序列的专用引物HCRV-L3的设计和用该专用引物HCRV-L3快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L3序列的方法。

①用引物HCRV-L3及其设计与合成

专用引物HCRV-L3是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒的L序列(GenBank登录号：HG763861.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-L3，它是由HCRV-L3前引物和HCRV-L3后引物组成，所述HCRV-L3前引物的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，所述HCRV-L3后引物的碱基序列如SEQ ID NO：12所示，该专用引物HCRV-L3的扩增范围是HCRV L片段的5631-8836bp，扩增片段长度为3206bp。

上述专用引物HCRV-L3由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-L3的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的HCRV-L3引物进行PCR扩增。PCR反应体系见表9。

表9专用引物HCRV-L3进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 45sec40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出3206bp左右的片段即为HCRV的L3片段。本实施例HCRV L3片段扩增电泳图见图3中的L3泳道。

实施例8本发明快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L4序列的专用引物HCRV-L4的设计和用该专用引物HCRV-L4快速获得朱顶红褪绿环斑病毒L4序列的方法。

①用引物HCRV-L4及其设计与合成

专用引物HCRV-L4是以在NCBI上公布的朱顶红褪绿环斑病毒的L序列(GenBank登录号：HG763861.1)为模板，使用Primer 6.0设计的，将其编号为专用引物HCRV-L4，它是由HCRV-L4前引物和HCRV-L4后引物组成，所述HCRV-L4前引物的碱基序列如SEQ ID NO：13所示，所述HCRV-L4后引物的碱基序列如SEQ ID NO：14所示，该专用引物HCRV-L4的扩增范围是HCRV L片段的8236-8908bp，扩增片段长度为673bp。

上述专用引物HCRV-L4由北京擎科生物技术有限责任公司合成。

②专用引物HCRV-L4的扩增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以实施例1中获得的cDNA为模板，利用本发明所设计的HCRV-L4引物进行PCR扩增。PCR反应体系见表10。

表10专用引物HCRV-L4进行PCR的反应体系

PCR反应条件：95℃1min，从95℃20sec，50℃20sec至72℃30sec 40个循环，72℃5min。

③琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.2％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出673bp左右的片段即为HCRV的L4片段。本实施例HCRV L4片段扩增电泳图见图3中的L4泳道。

实施例9PCR产物的纯化，克隆转化，测序及序列拼接

①PCR产物胶回收纯化

利用胶回收纯化试剂盒(北京百泰克公司)将实施例2-8中扩增出来的PCR产物进行胶回收纯化。若扩增得到的PCR产物在电泳检测结果显示目的条带单一且明亮，可以省去这一步。

②PCR产物克隆转化

利用pEASY T1载体(全式金生物技术有限公司，北京)对上一步骤①获得的条带单一且明亮的HCRV 7个片段的PCR产物进行克隆，具体步骤如下：

a.克隆体系的建立

在PCR管中依次加入已纯化的PCR产物4μL，pEASY T1Cloning Vector 1μL，轻轻混合。7个片段中S,M1，M2，L1，L2，L3都是25℃反应20min，L4片段是25℃反应10min。反应结束后，将离心管置于冰上。

b.转化

1.将连接产物加入50μL Trans T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。

2.42℃热激30s，立即置于冰上2min。

3.加250μL LB液体培养基，200r/min，37℃孵育1h。

4.准备好含有千分之一氨苄青霉素的LB固体培养基，制备平板，待其凝固。

5.每块平板上加入20μL的X-gal(20mg/mL)以及8μL的IPTG(25mg/mL),均匀涂布后置于37℃恒温培养箱30min。

6.取100μL的菌液均匀涂布在LB平板上，37℃倒置过夜。

③挑取单菌落培养

从过夜培养的平板里挑取白色的单菌落，置于5mL的液体LB培养基中，置于37℃，200r/min的摇床中培养8h。

④菌液PCR及电泳检测

通过菌液PCR的方法对挑取的菌进行筛选，利用T载体的通用引物M13F/R对各自片段对应的菌液进行菌液PCR扩增，如果电泳检测条带大小正确，则说明是阳性菌液。菌液PCR是利用保真酶Primerstar Max进行PCR的，PCR反应程序及体系见表11。

表11菌液PCR反应体系

⑤将阳性重组子菌液送到测序公司测序

将上一步④中筛选出来的阳性重组子，送三个到铂尚生物技术有限公司进行测序。测序的引物是用的T载体的通用引物M13。

⑥对测序公司返回的菌液送测结果进行处理得到S,M1，M2，L1，L2，L3，L4。

序列处理主要是有两个方面，第一是去掉载体序列；第二是确保序列的方向是从5’-3’的。

⑦序列拼接及病毒全序列的获得

步骤⑥中去掉载体序列后的S序列即为朱顶红褪绿环斑病毒的S全序列，该朱顶红褪绿环斑病毒的S序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，该序列全长2745nt。

利用DNAstar(http://www.dnastar.com/)软件中的Seqman程序对步骤⑥中得到的M1，M1进行序列拼接处理，从而得到了朱顶红褪绿环斑病毒的M全序列，该朱顶红褪绿环斑病毒的M序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示；该序列全长4762nt。

利用DNAstar软件中的Seqman程序对步骤⑥中得到的L1，L2，L3，L4进行序列拼接处理，从而得到了朱顶红褪绿环斑病毒的L全序列,该朱顶红褪绿环斑病毒的L序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示；该序列全长8908nt。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种快速获得朱顶红褪绿环斑病毒全序列的分子生物学方法及其引物

<130> /

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 1

agagcaatcg aggtataaac aaataatcat acac 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 2

agagcaatcg aggtataaaa cataaattct gaac 34

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 3

acaattaaat atctaaaaca gcttc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 4

gaactaggtt gccttgctat aaatg 25

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 5

tgtattggga ctctatctg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 6

agagcaatcg gtgcaataa 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 7

agagcaagtc gagcaacga 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 8

cagcaggaac attcagtaag g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 9

attgtccctc taatctact 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 10

ttcaacccta actctact 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 11

aaaactggct ctggatag 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 12

cttaggcttc tcgattgt 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 13

agagcaagtc gagcaacg 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 14

atgacattaa gggcaagt 18

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus）

<400> 15

cacacttaag caagcacaag ca 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus）

<400> 16

accctaagaa acgactgcgc 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 17

cacaataaac acacaaaca 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 18

cttcctaagt aaacaccat 19

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 马蹄莲褪绿斑病毒（Calla lily chlorotic spot virus）

<400> 19

ttcaacaaat gcggcta 17

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 马蹄莲褪绿斑病毒（Calla lily chlorotic spot virus）

<400> 20

tgcaaagtgg ctaaagt 17

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus）

<400> 21

tggttaaaaa gacagatcat tgct 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus）

<400> 22

ctacttgcca acatgtctaa cgtc 24

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus）

<400> 23

cccaaaatca atagtagc 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus）

<400> 24

aggagaacat agtcaagc 18

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus）

<400> 25

acgcgtcgac tcacacttct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus）

<400> 26

cgggatccat gtctaacgtc 20

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒属（Tospovirus）

<400> 27

cccggatcca gagcaat 17

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒属（Tospovirus）

<400> 28

cactggatcc ttttgttttt gttttttg 28

<210> 29

<211> 2745

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 29

agagcaatcg aggtataaac aaataatcat acacagctgg aatcacaata agcaagaaat 60

actaattcag ccatgtctac cgttaaaaca acagcagttg aattcttctc caactacggg 120

ttatcttgcg attcccgttc aatcaatgac tgttacaggg tattctctag cagaggagaa 180

accctcatgg atgtctttat gcactcaact attggcatca aatctgcttt cagtataact 240

ggacttggag aaagtgagga cataaagact catgaagcag aaatcattga tgaacatcac 300

aattataatg tctttgagaa gtttggctta gacatgaatt tctgcaacca ccttttggag 360

ataactgtaa agaaaccatc tgtaaaaaac tatgagacaa aattccaaat gcacaatcaa 420

atatttgagc cttcagaaca gctgattagc tatggtatgg gtaaaatagc agagaaagat 480

ttttacaact gttctgagat ctctcctgaa gacatatacc caagtgattg gtttatcaat 540

gaagctaaga aaaagaactt ttacatggcc gacatctctg ggttcagcat ggactggggt 600

ttttctgtaa tgggaaggac aacatcttac tggaaagaaa acatggaaaa aacatcactg 660

gtttctgtgg agcagaaatc agcagctttt ccttcagtgc ctacaaacag agtactatct 720

gtttccacaa tcaaagcggt tgaaatagcc tctaaaattg catgtgataa atcaactatc 780

ctctcagtca ggcaagactt gagatcagat ctgagaactc aattcaggat ctcactgcct 840

ggagaataca gcgatgctag tgttgccaga acctacttgc ttcatcaggg cagtaaaggg 900

cagtatatat gcatttatgc aagaactact atggacagtc ctaatgagag aactacattg 960

ataataaaaa tcttcactca aagcaaacca ggtagtttca ccacaacact tcttccaaat 1020

gatcactcca actgtagaaa aatggttgga gctagttttg gcatagttga acaaagaatg 1080

acagatccta attacaataa aataattgct catgagctat tgtctgtgca cacaaacttt 1140

gctttaaaaa tatcaaaagt tttacaaaag cctgtgatag tgtacaaagt ctatgagaaa 1200

gaactccttc caaagagagt ggaaatagac ggcagaacgt tcaactacca agaagacatt 1260

gatggtaatg tttactttct gtcaacaact ttggcaattt tgcctctatc tctttctgtt 1320

ttgtcctatc tggattctgc ctccccaccc tgttggaagg agtctaaagg tttgggccac 1380

ttcactgtag aggagatcca gtaaatttaa ttataactag ctttttaaga tattagagtt 1440

atatcaacct aatccactct caatgtatgt aaataaatcg tttaaatata agccaataaa 1500

tcaaaaacaa aaaaatcaaa ttttaaatta aaaaaccaaa aaaccaaaaa aaccaaaaaa 1560

accaaaaaaa ccaaaaagag ccttcgggcc gattgtggtt tccttaccta ttacaagcat 1620

cagtaagaaa accatgattt gcccgaaggc tttttttgtt tgttttttgg ttttttggtt 1680

tttttgggtt ttgtttattt atttattttt atttctttta tttattattg ttttgagttt 1740

ttatttttta gttttatttt atttaaggtt ttttatgaaa cacaataaac acacaaacat 1800

ttgcaagcta tataacgcac aaatcatcaa ccaagaatta agagatcaat cagaatcctt 1860

gattcttctt agaagcagac ctaggttttg aagaactagc ttcattatca tcaacaattt 1920

taccaaaagc attctccaga gctttaatct gctcattgaa tttgttcaat gaagcagcac 1980

cagttgtccc gggagtgcag tcattcagaa tttttatggt ctcttcaaaa atctctttag 2040

cagttccagt gaaaacaaat tcttttgttg ccataactct ggctatttta catagctgct 2100

cataagtaga gaatttgttg atgcccagag cctctttttt aacattctgg aaatatgcca 2160

gcgggaatgc agctgcagca aatttgtcta agcttgccat tagggggaga ggaccaccta 2220

atgttagcat tactcttgca gtggttgcat caaatctggg gctaggtttt aagccatatg 2280

cattgaccat agggaggtca cacagttttt catacatttt ttgctgctca gttgaactct 2340

ctacagcaag cagttccata aacattttgg ctctaatgaa accctccaat ctcctgaacg 2400

tccaatcttc ttgtccaggg ttggaagtaa cattgggaac cacaatgggt ttcccttgga 2460

atttaaaatt ccctgctttc accattttgt aaatggcagc tctatttctc aaaatggtgt 2520

aaccgttgtt aaaagtcatt ttcacgttgc cattagccaa tacaaattcc ttgaagttga 2580

atcctgtggt ttcttcagct tcaatctcta catctgcttc gccacctgca agaagcttct 2640

caacgttcac tttgctcaac cttgcggtag tcatggtgtt tacttaggaa gctgcttact 2700

tggctgaagt tgttcagaat ttatgtttta tacctcgatt gctct 2745

<210> 30

<211> 4762

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 30

acaattaaat atctaaaaca gcttctgcca agtgattcgt aaccagtatg tctcgcataa 60

ctaacgtgtt tgaaaacttc ggcaaaagtg aaggcaaaga aatgattcct gcaattaaga 120

aagctgaaac agacaacaga ctcgttttga gcaggaaagt gacaagcaaa gatgtgagtg 180

atgccatgaa gaaaaaagct tctacattta atggcaatca atacatctct gcttctgaca 240

aaactgtttt gggttcctat gaaagtggtc aatctataga gaacagttca gatgatatct 300

tgtccaggct tatagtcgag aaaagcactc atctgagtaa ttggaaagat gattctcttg 360

ttggcaatgg agaggaaaaa gtgagctgta caataaacat cattccaaca tgggacagca 420

agaagaaata catgcatata tcaaggctga ttgtgtgggt tgttcccaca ataccggact 480

ctaaaggatt tgtgaaagca acaataatag atcaaaacaa gctgactcct aaagaaaagc 540

taatcattgg caagcaagga acacttgaga accctttgtg ttttgttttc catctgaact 600

ggtcttttaa caaagacaga aatgtaccaa agagatgcat gcagctcaat ctaacgagca 660

atgaaaaata tgcaaaagga gtttcctttg catcagttat gtattcttgg gtgaagaatt 720

tctgtgatac agctatagct tctgacagca acacatgtga tttgattcct atcaatagag 780

ctaaagcaat caaatctgct gctctaattg aagcatgcaa actcatgatc ccgaaaggaa 840

ctacaggaaa ggctataaag aaccagatag tgtctctcca aaaaattgct gagaaagtag 900

cattagaaga tgatgctgat gaaagtacag aaattgtaga gatagatata gatgatccta 960

ataatcaatt ttaaaagaac taaagatctt tcatatgtct atctttatta aataaaatcg 1020

taaaacaaac aaaacaaaaa taaagaagaa aagaacaaaa raagagaaaa agaaaaagaa 1080

aaaacaaaaa aaagagaaaa aagaagaaaa caaaaaagaa aaaagaaaaa gaaaaaagaa 1140

aaaggaaaaa caaaaagaaa agaaaagaat gtatataaat aaggccaagg ccaactttgg 1200

cctttttagg ctctttttgt tttattttat ttctatttta ttttattttt aattttattt 1260

ttattttatt tttttgtttt tgtttcattt atttatttta tctgcatttg aatacttcat 1320

ctggtctaga actctagagg aaattcaaat gtttttggcg ggcttcttct tctaggttct 1380

ccatctctct ttgacatagt caaaagagat tgactgactt cttcaaggtc gaactccatt 1440

ttccttttcc ttttttcttt ataataacta aaagataagt tatagatata actgattatg 1500

taaattccta cacagacagc taaaatcact aaaagtaccc tcactacatc aaagaaacta 1560

ccgaaaaatg aggctaccca attgaaagga gcttttatcc aatcccacaa tgtagccaac 1620

cctgtgtcag catgatgtat gttctcgtca tgagcgctct tatcatcata actaattata 1680

gtgtcttggt ctataacatc cacttgatcg attttcagct caattgacaa ttcatcttga 1740

tcctctgcaa tcattttgat gcttttatct tttagactgt ctgaacaata tgccttgaac 1800

tttttcttat taggaccaat gtaactgcct aattggtcag atttaaatga acaaccttca 1860

atctccaacc tagaagagaa tgtagtgtca gaagtatatt ctatgtcaca ttctaaaccc 1920

atagcacatt taaaacagcc tgtgcagcta acttttgttt cgctaagcac tggtttgctt 1980

gatggctttt taaacatctc tttgggcata tcaataacaa cttttaattt ccctacaaga 2040

aaatctttag tcatgtaaag cttgttttga tcttcactga ggatagaaaa gtcttttgat 2100

tgggtcaatg catatatcat attgtaacta aatattccgc attgccttat attgactgat 2160

ttggcaccaa ctgcagaaca actccaagaa aaatgatctc gaggtatcat agctggtact 2220

gatagtaaag ttccatctgc atttatttga ggatgaccaa aagcacctga cgagaagtca 2280

cctaagtctg agatacttcc tgtaagaact ttttgttgct tgttgatagc aaacagtttg 2340

tcggtgctca tgaagtcatt atgaagatcc acagacatgt ctaactgata atactcagtt 2400

tgtattggga ctctatctgt gtgcttcctg cagtcatatc cattaagaga cttgatgcat 2460

atctctgcag tgacatrgct ttgaacaacc tgataaacat taaccagtgt gctaagatca 2520

aaaacatttg tgcaatgtcc gcagatagca ccttcattta tagcaaggca acctagttct 2580

tcgcagcccc accaggatgt aggttggaca caaaaatcat ttttccctgc aggagctttc 2640

aactttctac aatcattgca gttgcctgta caggttgaga ggtaatctgt cactgtcgtg 2700

tccacttttg ctgttgaata tttgtatctg atatcatatt ctacacctac acttttaaca 2760

taaatcatga attccatagg tatgtgtgag ctgtcatcat ttagcaaaaa gacagaccca 2820

gtctctttct ttatgtccat ttcaatcaag tatctgtatt tcccatcaac ttctgttgag 2880

aagactaaag attgtctagg cattagattt tctggaggaa tgtcatctac cttcaagctc 2940

ttgaagtata ctagttcttt ggaaactcta gattctaaat ttctgacatc agcctggtta 3000

tcgacaaatc ctttcctaag cctattagct atttttagca cagttaagtt accagaatat 3060

tctgttcctc tgtaaccatt actgtattct actctgggta tcttttccag tgctactaaa 3120

gcattgcaac cattcctgca tgcaaaaaga tttttagctt gattgaggct ggtgaggcat 3180

gtagaagatg ataaaacaca attgttcttc gtagctgctc tagatacagg agtaccgtct 3240

ctataaacag tttctgttat tagttctccg attgaacact cacatgtgtc tacggcattt 3300

tttgatgagc catctttgtc ggtagtcagt ctttcgagat ctttgctata ataacatttt 3360

tccacgcaaa cattctttcc tatagaaagc gctaagctgg atggtatgta agaaatcaaa 3420

atagcagcta taagcatttt tgtcaagaaa acaagaaatt cagagctgat ttttgtgttg 3480

atagtgaatt gaaagtgatc aatcagagac aaacttttcc atttttttgt atcctttgag 3540

aacaaatagc attctttagc atgttcttta gatggctcac attggttgca aacacataac 3600

ttggaacatg tgtgagtgag gaaagacaag tttccacaca atctacatct gaatggaaag 3660

tacaaccata cataatttaa taggatgaga accggataag tcaaaatccc tagaacgtca 3720

taccaaacag aaaaagcatt ttttgtcttc cagagcatcc atgtgacagg gaaagctatt 3780

aacaaaaata tgaaaatcca tttgaagtat gagaaattgg cacagaagaa aattttcttt 3840

ggttcatttg tgtatttaga aacacaattt ctcactggaa tgtctacttt ctttataaag 3900

ctggatttgt ctccacaaag aaagaaatgg tttccatcta gttcctgggt tttgaagtag 3960

acagatctct caccagaagt tgtttgaaag ttaacagctt gaggatctct tatgttctta 4020

acagcaaatc ctatattttc attggatttg attttaatca tataaggtgt tgacattgac 4080

acttgactta taacacagtc accagaaagc ctaacagaaa gtctggagat tgttggcttc 4140

agcatgcttg aggcaggatc agacaggatt ggattgttag atgaatctac aaagaagaac 4200

ttagagccaa cctcaaggac tctcttgttt tccaacttta gaacaggaac aacaggcatt 4260

ttaaggaagt ctcttctttt gatctctgga tcgaacaaac atgaatcaaa tattttctct 4320

gagtcagtta agcaagcaaa aactgagtca gagatcttta tttggtaatg agcattgaaa 4380

tcacttacac ctttgatcat gcagctagat ttagtgaaac tgtcacaaga aaaaacactt 4440

tcttgtagtt tggaatttgc gggatcaatt gttgtagcct ctctagaaat cctacccgga 4500

gtctttgagt ccaaagacgg gtgagtgcta gaggctgtaa tttcatactc aaaaagatct 4560

cgtggatcgt catttttgta tctatctttt aacttcttca actcaatctt ggtgtcttcg 4620

ttgtcttctg catagttcac caggaacact tctgttacag tgaacatcag gtatatacca 4680

agacagtaga gtagtagata gtgtcgattc atcataggct gcctgtttag ggagagtttt 4740

taattattgc accgattgct ct 4762

<210> 31

<211> 8908

<212> DNA

<213> 朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 31

agagcaagtc gagcaacgaa attaaaatcc aaaatgaatc ttcaaaatgt acatagcttc 60

ctagaaatca caggccaaat tactgtcttt ctaaatgagt tacgagagaa acttatgatt 120

ctgtccaatg ttatacaaag gaggtataaa gatggatcag aatctatctc atcagggctt 180

agggcaataa tgagcatgtc atgtactatt gatgaaatag tagacatgaa agccacttat 240

taccaaagca caatgtcaat tgaccaaaaa gaaatggaga agaagatatt catatttata 300

gatagatata aagagctaga gttaatgagg catgatttat ttggggtttt agcaagctcc 360

aaattacatt ttgctcctag gcataggcat gatgtggtta tgaaagactg catcttgagt 420

tatttggagt actgctccga gacacaagat ataagcaaca agatagaaaa tctgaatgaa 480

ttaacttctc agttagtttt ccagcatcag acaccagata attatgttat ttataaagaa 540

acaacaggag aaaaagcatg cctgatgatc tatgattgga aagtctcagt tgacaccatg 600

acagaaaaca aaacttctga gaattattac acgagtatat ggaaaacatt caaagatata 660

aagattgacg atgagccatt cctgtctaag tttcccatct ttgtaactat tgtgattcta 720

caacccttga acttcatgcc aattgtggca actacttgcc gggtcttaga ggagatgagg 780

aactccccat acagaacttt tgtagacaga aagaatgcag catccagagc taaattgatt 840

tctactaggt gcctgaaaga tttagctggt caagacggat caaagttcac tgcattctac 900

tcggagtgcc aagctttcaa aaatcttcta atgtcaaaca ttggggatta catgaacaga 960

actgatgagg tttttttcag tcactggtca catgaatata aagaaacatc acttaaggac 1020

aacttgatga gccaagatgt catagaaata atcaagtctc taccagacaa aactataggg 1080

aaagaattaa taacaaactt catttttggc aattacgtct tttacagtaa aacaatgagt 1140

gaccttcata gaaaagacag gtttgaaggt tataaatcca attgcaagct gctaaagatc 1200

aagccaaaaa agacagaaga agatttaaaa gtctatctgg aaaacaatga agcccgattt 1260

gagagtttgt attcaaagca tatggataag attagaacag acatgctgct aaagaagagc 1320

caagagaagg agattaaatc tattgaagaa tcattcaaca gaaatgctga aaattatcaa 1380

gctgaatacc ctggatgttt tacaaatgat ctccaagaaa ctaaaaccaa tttttcagtg 1440

tgttggtctc cgtcaacaga gaaacttcca gtaaaggaaa tgaatttcaa caacagcatt 1500

attgacagta ttaggaaatg ttttgatgga gaagaaacac tcatacacaa taagagctat 1560

ggagggaaga ctgttcaaag agagttctcc aatactttgt ttagattagt caaagcatgt 1620

ataaaggacc taagttgtga cacaacagga cacaacaaaa ttagagccga agatgtagtg 1680

gacattaaag acggaagcat caagatatct agagaaagca aagagaaggg ctggaaagaa 1740

atgaaggaca tcaagaccag aaatgggaat gagtttacaa tcagtgataa aaccaacaga 1800

gaagtcagat caaatttttt taaaggtctg aacctaatga atatagatat gggcaagaaa 1860

aggaaaaatg accataaact agaactgata gataaattga aacaatctag ggtagctaat 1920

gaagagcaag caatcaaaga aggcgaatat gatgtgtctg ctaacaaaga agctgcaagt 1980

attgctgtgg gatcagtctc acacaacaaa aaattgataa ggcatgacaa cccagatata 2040

agatactggt gtgattcaat gatacaaagc atgtatgcat tacatggatt tgacattaga 2100

gataaagact ctgggaaaat aaactcagtg tattctgaat attgcagcga gccagagaaa 2160

tacttctcta aagggaagct cattgaaaca gagacaaatg tttctaagaa cttgcataaa 2220

gtatctcagt ctctggcagt gttttcttac agtgaagaca tgatgcagtt ggcaaaaggt 2280

ctgatggtgg ccgataggtt catgagaaag acagatttca aaatcttgac atgtgccaac 2340

acaagcatgc tctgtttggc ttttaaagga gatggattga atacaggaaa atctggagtt 2400

ccgtacataa cagtgcataa agtatcagag ctacttcaac catactttac atctttatac 2460

actaaagagc ttgttgtgtc atttaaatca ggtgactttt tcattaacat aatgagaccc 2520

cagaggctca atcaggttag gttactcagc ttgtttaaag ctcctagcaa agtgccaatc 2580

tgcttctccc aatactgcct tcttagcacg gaagtgaaaa gatgggtttc taaaaaagat 2640

attgacatac tagattgtcc ctctaatcta cttccttttt tgaaaaatat attattttca 2700

tctgtagtta taggcacagt gacaaaactc agcagaatgg gaatttttga tttcatgagg 2760

tatgctggat tcctacctct gtctgattat tccaatataa aagaatatat agcagaaaaa 2820

tttgatccag atataaccaa tgtagtagat tgttactttg tgactggaat caaaaatctg 2880

cttttgaaga tggaaggcat caatctaagc aacagcatta agccgctgac tatagatcaa 2940

gaaaatgata tgtctggtgg aataagtgat ttgaacataa tatgtcctat aacaggatct 3000

actttgaaaa ctatagaatg tttgtacaat aatgtgtatt tggccatata catgatgcca 3060

aaatccctcc acacacatat acataatctg acatctttac tgaatgttcc wgctgaatgg 3120

gaggtcaaat tcagagaaaa aatgggattt ggtataaatg aagaaatcat gccaaagaaa 3180

gaaatgttta atgattctgg accgttctct gtaaatggca ccttaaatgt aaaaacactt 3240

tttgattact atcttaagac cgtagacaat gttagctcga caaggtctaa catcgagtct 3300

aaagaagatt tcctttccac tccttacaag ataaaaactc taacatcttc aaaaaagtgc 3360

tctaaagcag aaataataaa aaactctgag atcatacatt ccttatccaa tagtctaggg 3420

aaagatcctg agaaaattac tggaaaagat gaatacatcc tcaaaggagt tttaaagtgt 3480

tttgttgaag acaaagacgc gttaaagaat tttatggcct tggaagaatt ggacgagtcc 3540

gactacttcc attattttag tagactgaca tctggagaaa acaaagcatt gatgaagact 3600

agttacgata agttttatta taacagccat ccaacaacag tagaaacctt cataaaagtg 3660

agatatggtc acatgtcaac tactactgtg ctgaaatcta agaaagtaag tgaagagctt 3720

tatgatctaa tcaaagagta caacaaaatc actgagttgg atctagatgc tctggaaaat 3780

atgggtagag gattatctgg aagtaagatg actttcatgc aactacttga gtttgtttta 3840

ctcaaaacaa gaacaaatgc aggaaacaca gattttttag tttctgtatt tgaaaagatg 3900

caaagaacaa aaatggatag agagatatac cttatgagca tgagaattaa aatgatgcta 3960

tactttgtag aacacacata caagcacata gctcaatcag atccttctga agctatatcc 4020

atatctggag attacaaaat aaaaacacta gcttcattgt cttatgatac aatcactaat 4080

tataacacat cactgcaaaa aggcctggaa tgcaaaatgg cttttctttc tgccgatcag 4140

tccaagtggt ctgcttctga tttaacatat aaatatgttt tggccatatt aatgaaccct 4200

gttctgacaa caggggagat caacatgatg tgtgagtgca tactgatgta tgttaagcta 4260

aagagggtat gtatacctac agatgtattt ttgaacttga aaagagggca gtctacatat 4320

ggttcccatg gaactgctat atctgcatta acagacaatt tagagaccaa cactttccct 4380

gtgtctatga attggctaca aggaaatctg aattacttat cttcggttta tcattcttgt 4440

gccatgctag gttatgagaa ggctctaaaa acaaacagcg attttgagtt cactgtgaga 4500

tggatggttc actctgacga taatgctact tctgttgttg caaagggtga cataaagaag 4560

tttttatcaa aattcaactg tgcaaatcta tctgaattcc tctttagaag catccaatcc 4620

cattttaaga gttattgtat tactctaaat cctaagaaaa gttatgcctc agaatcagag 4680

gtggagttca tatcagaaag aataataaat ggagctgtca taccactata ttgcagacat 4740

ttagcaaact gttgtacaga atcatctcac aacagttact ttgatgatct aatgtcacta 4800

tctacccata taacaatgct gctgcgcaaa ggttgtccta atgagcttat aacatttgct 4860

tatgcagcta tacagtgcca agcacttagt atctactcta tgattcctgg ggaagaaaat 4920

gatatcgtct ccataggaaa agaagttgga ctccctctcg aaaaggaaga aataccaaca 4980

tgcgcaggag gctggatgag agcacctgtt gagatgttgt ctatcttggg tccatcatca 5040

aatgatcaat atatttatta caagattctg atagaattct ttaagcaaaa agattttact 5100

tctcttaaaa cccaggtgaa tagtttggga tatgtacccc aaaggatcaa tgatctaaac 5160

aaaagggtag ctagagacac gctcaccaaa gaagatgtta aaatgatatg catggtcaat 5220

ttgtttaaaa ctagcttaat atctgaagat agtgacagtc tcaacattgg aatgaagttc 5280

caaacgatga tgacacagat aataaaatta cctagttatg ttagtgaggg atcattgatg 5340

aaaaattcca gcttccagga cttttgtaag cttttcccta acctaaaaag aaactctgat 5400

ctgttggatt ccctgaaaca gcctcaaatt gatgaagata atgcaggcaa cttctctgag 5460

gataactcta tattatctag aatacaaatg gaggagctat ataaacatat gtccaagcat 5520

ccagaggccc tcttaatagc accaatgaat gataaagact atatccttgc taacctctat 5580

acctacagta gtattagtaa aagaaaccag atgtcgaacc aatcaacaga aaaactggct 5640

ctggatagaa tactaagatc caaagcaaaa acttttgttg atcccaattc aaggcagatg 5700

atgacctata gagagaatat gtcatcaaaa ttaagagaga ttatggacaa atctgcaaat 5760

gattacaaaa tcatttctac catttctgac atgatggtta aagacatgaa ttttgaaatg 5820

atcatagctt tgatggagaa ctctgttgcc aatgcttcca tccctaaagc taattataac 5880

ttcagatggt ttgttacaga aaaagtccct agtgctatag aagggtctcc tggtttgatt 5940

gtgatgtcag caatatatgg gatggaatat ctagtagagt tagggttgaa gaagttgcct 6000

ttaacagaaa actctatctg catacttcac gatatatttg gcaacagaaa gacatttgat 6060

gatgtgaaaa cacatctgac atcaggagaa agagaaatga agacagatga attcataatg 6120

gctgatgacc taaagagaac agttctatct ctgaattaca tgatacaatc tcaaaacaaa 6180

ctgttatctc taaacacatg tttctccaga aagaatttcc ctttttattc taagtacaat 6240

ctagggaaaa cattcataac aaatacatta gcattgtgga gcaccatata cagtagaacc 6300

accaacataa atttttatac taatctgaat ttcatcatcg acagaaactc aagaatgata 6360

gtttctttgc agagagacat gagcttggaa aagctactag attgctgttc atatgtttca 6420

gacaggatac aaagtctatt tccagacatt caaatagaag atgttaggag tatcttgtcg 6480

agattgaatt tcaattcagt gaatcttctt caaaaggttt catctgaact aaaatctgta 6540

aaaagagcta tatctcagat aaagactgca agtcatgtta ctttatcata cagaccacag 6600

ctcatggcca tgagcagata tgcagcatgg ctgtacaact ttggctatat aaatgaaaga 6660

gaattcaagt ttgtgataga gcaagttagg caaagtgaag taaattacat aaaaactgat 6720

gagcaagaca ctcgtgggta ttatgtctcg ggtatttctt acaaaatagg aattaagact 6780

ttgcacaatt atgcccagct agagatgaca aacaaagaca ttgcaattca tttaaattca 6840

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tacaagctac ttcaaaagct gcttatagac aaacaaagtg tcttgaagac tttcttaaat 6960

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ttaatatata taaatgaaac caatagagta gtaactctag acagagtcaa attcaaaggg 7080

aaagtgaagt acaattattc caatgaattc acttggtccc tcatggaaaa taactataat 7140

tacatgctaa ggaaagcaga gactggagaa tgcttctcag aattgtacaa gacaatagac 7200

agtggaagta gcctaatgga aaatatatta aggaatctca aatctagtct gatttataat 7260

tcagacatgg agaacatggt agcgaatgct gttgacggca ttgatgatga ggaaaataga 7320

gacatattca taaattctct agagcagatc tatgacctag cctacaaagg cttaaaagaa 7380

tgtaaatcat ctgaagagtt cgaagcatat ctgagagaca acgaatttga cgatctagtt 7440

gacacacaca aagaaatgtt agaaacgatc tgtcaagagc tatcagacac agactcaaga 7500

attcaatctg tagtagatag attgaaggtg tggtcaagta gtctatcgaa atttggtgac 7560

ctgtgcgtga tgctcaaatt ctccatgata aatgattcaa aagggatcaa aacatacaaa 7620

gccacaggtg ttgactttca ttcactttca tctagtgaat ctataatatg ttctggttat 7680

gatgtctttg aaatgctgaa gctcattaaa gcttgtgaag cttgccatac tagcaattca 7740

actcttaact tagcagcttt ccgagacatc aaaaataaca aatacattcc accacacaaa 7800

agatggtatg gtggaattgt acatttccgt tatcctttaa aactgaataa tgatgtcatg 7860

tctagattct atgagcacaa aacaatatca ttgagtgaca tagaaataac agaatctgtc 7920

agagaaatct tgaaacagaa tgggttcaca atcacaggtt ctaacattaa attagaatcg 7980

gatatgctgg agttgaaccc tataactata accgatgagc atagcacttt tgacagtgtc 8040

tcaaggcaaa tgagactcac aaagaagaag agttcacatt tgataccagc taacactctc 8100

cttcttggag agctgatgaa gtttttgatg ctatgtataa aaggaaatga atatgatgtt 8160

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tcaaacccac atggagattt tgtggaacca tttgatgcac aaaaactaat taaatcttct 8400

ctaacagaga agaataaaga caaaaagctg aagatacttc taaggataag atcatacata 8460

tcatctaagc tggattattt aaatgagcaa tgtatataca gaaacacaac taatcttgaa 8520

ataaatgatt taatattcag ctcaataaat catatagata aagagatatc cgagttaaga 8580

acttttgata agactgttta ccatgatgaa ttcaacgaat atttgwagac tgcagaagga 8640

gcaaattcag agtaaataga aggcaagtgt tagagtatta aaataaataa attgagaatc 8700

aatgtcaact ataccagcaa aggagaaatg ctgaatgtta gamcaaatca tagcatttag 8760

aagtttgata ggttgcttga agatgaaagt caataagcaa caaaaaagat ggrgaaaaca 8820

rtcgagaagc ctaarttagt atttctgaaa acatccttta tagttcagca tagctgaaga 8880

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<212> DNA

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cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

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agcggataac aatttcacac agga 24