用于病毒性脑炎快速诊断的多重PCR试剂盒的制作方法

本发明属于基因检测领域，具体设计一种用于病毒性脑炎快速诊断的多重PCR试剂盒，可检测6种常见病毒性脑炎病原体。技术背景多重PCR是在普通PCR的基础上，于同一个反应体系中利用多对引物同时扩增多段靶序列的PCR技术。自多重PCR报道以来，由于其高效性、灵敏性和经济简便性，已广泛应用于核酸诊断的多个领域，如遗传疾病诊断、突变和多态性分析、转基因鉴定、病原体检测等；多重PCR体系，一般包括以下试剂：PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、引物、模板和去离子水。病毒性脑炎（Viralencephalitis，VE）是指由一种或几种病毒感染脑实质或脑膜的一种中枢神经系统疾病，四季均可发生，其发病率约为（3.5-7.4）/10万，为比较常见的中枢神经系统感染疾病，该病往往缺乏特异性临床表现，VE患者在延误治疗的情况下，71%留下持久后遗症，死亡率达到7.4%。据世界卫生组织(WHO)估计，全球每年约20万例VE患者，美国每年报告的VE达2万余例，而中国在这些方面的报道较少，这与我国目前病毒性脑炎的检出率低有关，同时，由于不同国家和地区VE发病率存在较大差异，因此，急需建立我国常见VE可推广应用的快速诊断方法。此外，VE的早期诊断能有效减轻脑组织损伤，降低后遗症发生率及死亡率，对疾病的治疗和预后至关重要。引起VE的病毒包括单纯疱疹病毒（Ⅰ、Ⅱ型）、肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、麻疹病毒等，其中肠道病毒和疱疹病毒感染率最高，分别是74.51%、15.38%。目前我国临床上VE的传统验室检测包括脑电图、影像学、病毒培养、酶联免疫吸附等方法，该类方法操作过程冗杂繁复、耗时长，难以在疾病早期做出诊断并延误治疗，同时存在特异性差、敏感性低、假阳性和假阴性高的缺点。因此，开发高敏感性的多重PCR检测技术和相应的检测试剂盒对脑膜炎的诊断、治疗及预后具有重要的价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于病毒性脑炎快速诊断的多重PCR试剂盒，用于六种常见病毒的多重PCR检测，通过设计特异性引物，结合多重PCR检测体系和条件，利用操作简单的mPCR方法可以同时或者单独快速检测单纯疱疹病毒1型（HSVⅠ）、单纯疱疹病毒2型（HSVⅡ）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、EB病毒（EBV）、肠道病毒71型（EV71）及巨细胞病毒（CMV）这6种发病率高的VE病毒，该方法可用于临床标本的检验。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种用于病毒性脑炎快速诊断的多重PCR试剂盒，包括针对病毒性脑炎的特异性引物对；所述针对病毒性脑炎的特异性引物对包括如下引物对中的一种或几种：上述技术方案中，检测病毒性脑炎的多重PCR试剂盒还包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水。上述技术方案中，进行PCR反应的条件是，95℃预加热4min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。本发明公开的各引物间Tm保持一致，设计和选用的6对引物之间避免和减少二聚体的形成。本发明在同一PCR反应管内可同时检出多种病毒基因，有效的节省时间和试剂成本，该方法对于VE诊断具有高效性和经济简便性。上述技术方案中，进行PCR反应时，由于不同引物的扩增效率不同，针对病毒性脑炎的每条特异性引物的终浓度为0.5μM/μl～0.8μM/μl；优选的，进行PCR反应时，针对HSVⅠ、CMV、EV71、VZV和EBV病毒检测的每条特异性引物的终浓度均为0.5μM/μl；针对HSVⅡ病毒性检测的每条特异性引物的终浓度为0.8μM/μl。本发明公开的检测病毒性脑炎的多重PCR试剂盒中，多重体系扩增后产物通过凝胶电泳条带判断病毒类型，扩增产物片段间大小一般需超过30bp，扩增HSVⅠ、HSVⅡ、CMV、EV71、VZV、EBV各自对应的条带分别为114bp、219bp、293bp、442bp、552bp和679bp，通过采用多模板单引物的方法检测每条引物特异性，均可扩增出特异条带，且未出现杂带，如附图1；6对引物同时具有高敏感性，HSVⅡ、CMV、EV71、VZV、EBV的敏感性均达到10个拷贝数，HSVⅠ的敏感性达到102个拷贝数，如附图2。6对引物建立的多重PCR体系，HSVⅠ、CMV、EV71、VZV、EBV检测敏感性达到102个拷贝，HSVⅡ检测敏感性达到103个拷贝，该多重体系敏感性可用于临床检测，如图3。本发明还公开了一种病毒性脑炎的多重PCR扩增的方法，包括以下步骤，以病毒性脑炎病毒基因为靶标序列，在针对病毒性脑炎的特异性引物对存在下，进行一次多重PCR扩增，即完成病毒性脑炎的多重PCR扩增，实现6种常见病毒性脑炎的诊断；所述针对病毒性脑炎的特异性引物对包括如下引物对中的一种或几种：上述病毒性脑炎的多重PCR扩增的方法中，多重PCR扩增采用25μL反应体系；多重PCR扩增的条件是，95℃预加热4min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。上述病毒性脑炎的多重PCR扩增的方法中，针对病毒性脑炎的每条特异性引物的终浓度为0.5μM/μl～0.8μM/μl；优选的，进行PCR反应时，针对HSVⅠ针对HSVⅠ、CMV、EV71、VZV和EBV病毒检测的每条特异性引物的终浓度均为0.5μM/μl；针对HSVⅡ病毒性检测的每条特异性引物的终浓度为0.8μM/μl。本发明进一步公开了针对病毒性脑炎检测的引物，如下列核苷酸序列所示：编号引物序列（5’-3’）SEQIDNO.1ACCCTCAAGTTCTTCCTCACSEQIDNO.2CCAGTCCAGGCAAATCTTCTSEQIDNO.3ATGGCACGACCCACGGAAGASEQIDNO.4CGGAGCGGACGTAGGCGAATSEQIDNO.5TGAGCGTTGGACACGTGATASEQIDNO.6CGGAGCGGACGTAGGCGAATSEQIDNO.7CCTGAATGATGCTCGGGTAGSEQIDNO.8GACCTCAGCGTGGAGATTGTSEQIDNO.9GCGCAAATGCGTAGAAAGGTSEQIDNO.10GAGGTATCCATGCCCTGACGSEQIDNO.11CCTTCCCTAAGACCACCAATSEQIDNO.12TAAGACATAGCAGCACAGCA同时本发明还公开了上述针对病毒性脑炎检测的引物在制备检测病毒性脑炎的多重PCR试剂盒中的应用。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点：（1）本发明公开的检测病毒性脑炎的多重PCR试剂盒，可同时或者单独检测六种常见病毒，比如单纯疱疹病毒1型（herpessimplexvirustype1，HSVⅠ）、单纯疱疹病毒2型（herpessimplexvirustype2，HSVⅡ）、水痘带状疱疹病毒（varicellazostervirus，VZV）、EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）、肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）及巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV），不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，同时提高了检测效率，具有灵敏度高，经济、快速、操作简单等优点；（2）本发明公开的6对引物能够特异性扩增HSVⅠ、HSVⅡ、EBV、CMV、EV71、VZV，引物之间互不干扰，构建的mPCR体系敏感性达到103拷贝；针对临床疑似病毒性脑炎患者15例脑脊液标本，本mPCR体系检测检出6份阳性标本，其中HSVⅠ5例，CMV1例；本发明设计的mPCR体系具有高敏感性、特异性和稳定性及操作简单的优点，能同时快速检测6种常见病毒，有助于临床病毒性脑炎的快速诊断。（3）本发明公开的试剂盒中，对不同引物的浓度限定，使不同引物在同一体系内最终扩增产物量达到均衡，HSVⅠ、CMV、EV71、VZV、EBV检测敏感性达到102个拷贝，HSVⅡ检测敏感性达到103个拷贝，多重体系敏感性可用于临床检测；（4）本发明的多重PCR检测体系特异性高，通过采用多模板单引物的方法检测每条引物特异性，均可扩增出特异条带，且未出现杂带；6对引物同时具有高敏感性，HSVⅡ、CMV、EV71、VZV、EBV的敏感性均达到10个拷贝数，HSVⅠ的敏感性达到102个拷贝数，单管进行，操作简单，且具有灵敏度高、经济、快速等优点，能用于开发相关的检测试剂盒，具有临床应用价值。附图说明图1是实施例一中多重体系的特异性检测电泳图；图2是实施例一中引物的敏感性检测电泳图；图3是实施例一中多重体系的敏感性检测电泳图；图4是实施例二中临床标本的mPCR检测的电泳图；图5是实施例二中临床标本1号测序结果；图6是实施例二中临床标本4号测序结果；图7是实施例二中临床标本11号测序结果。具体实施方式下面结合实施例与附图对本发明作进一步的描述实施例一多重体系的特异性和敏感性检测1.多重体系的特异性检测检测病毒性脑炎的多重PCR试剂盒，包括常规多重PCR组件，还包括针对常见脑膜炎病毒的特异性引物，序列见表1，常规多重PCR组件包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水。表1针对病毒性脑膜炎的特异性引物多重体系的特异性检测：采用多模板单引物的方法，检测每条引物的特异性。PCR反应：反应体系为25μl，包括12.5μl的DreamTaqGreenPCRMasterMix（2×），2μl的引物（每条引物终浓度为0.8μM/μl），1.5μl的混合基因组模板（来源现有技术，每种模板浓度在10^4个拷贝数），去离子水补足到总体积25μl。循环条件：95℃预加热4min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。图1为多重体系的特异性检测，其中第1泳道和第8泳道分别是空白对照和阴性对照，第2泳道到第7泳道分别是HSVⅠ、HSVⅡ、CMV、EV71、VZV、EBV，目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的多重体系具有高特异性。2.多重体系的敏感性检测将现有技术构建好包含特异性引物的重组质粒从大肠杆菌中提取后以去离子水按10倍稀释梯度107到101拷贝，每个稀释度取1μl作为PCR反应体系的DNA扩增模板进行敏感性检测。引物敏感性检测采用单引物单模板的方法。PCR反应：包括12.5μl的DreamTaqGreenPCRMasterMix（2×），2μl的引物（每条引物终浓度为0.8μM/μl），1μl的质粒模板，去离子水补足到总体积25μl。循环条件：95℃预加热4min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。图2为6对特异性引物敏感性检测结果，a-f分别表示HSVⅠ、HSVⅡ、CMV、EV71、VZV、EBV病毒特异性引物的敏感性，1-8泳道表示浓度为10-108拷贝数；HSVⅡ、CMV、EV71、VZV、EBV的引物敏感性为10个拷贝数，HSVⅠ的引物敏感性为102个拷贝数。体系敏感性检测采用多引物单模板的方法。PCR反应：反应体系为25μl，包括12.5μl的DreamTaqGreenPCRMasterMix（2×），3μl的混合引物（共12条引物，HSVⅠ、CMV、EV71、VZV、EBV每条引物终浓度0.5μM/μl，HSVⅡ每条引物终浓度为0.8μM/μl），1μl的重组质粒模板，去离子水补足到总体积25μl。循环条件：95℃预加热4min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。图3为体系敏感性的检测结果，a-f分别是各个模板浓度在107、106、105、104、103、102个拷贝数下多引物单模板的电泳图，a-d6个泳道均能跑出清晰可辨目的条带；图中各产物条带大小分别为：HSVⅠ：114bp；HSVⅡ：219bp；CMV：293bp；EV71：442bp；VZV：552bp；EBV：679bp；HSVⅠ、CMV、EV71、VZV、EBV检测敏感性达到102个拷贝，HSVⅡ检测敏感性达到103个拷贝，可用于病毒性脑炎的临床检测。实施例二临床标本的检测在2014年到2015年间搜集到苏州大学第一附属医院的15例疑似VE但未明确诊断患者，其中男9例，女6例，年龄15-60岁，均出现不同程度的发热、嗜睡、呕吐、腹泻、精神萎靡、意识障碍等症状。将15例患者的CSF用基因组DNA提取试剂盒（QIAampDNAMiniKit）提取CSF中的DNA作为PCR模板。PCR反应：反应体系为25μl，包括12.5μl的DreamTaqGreenPCRMasterMix（2×），3μl的混合引物（共12条引物，HSVⅠ、CMV、EV71、VZV、EBV每条引物终浓度0.5μM/μl，HSVⅡ每条引物终浓度为0.8μM/μl），2μl模板，去离子水补足到总体积25μl。循环条件：95℃预加热4min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃延伸7min。15例临床标本中没有手足口病的患者，因此并未进行RNA病毒处理。图4为以15例临床疑似病毒性患者的CSF-DNA为模板进行mPCR检测的电泳图，1-15表示15名临床疑似病毒性患者，1号、4号、8号、10号、15号标本出现HSV1的目的条带，11号出现明亮的CMV条带。将出现目的条带的6个PCR原液测序，测序结果通过BLAST网站进行对比分析，其中1号，4号，11号测序图如图5-7。采用发明建立的mPCR方法，对15例疑似VE患者的CSF标本进行检测，共有6份检出病毒，总检出率40.00%（6/15），其中HSVⅠ最为常见，检出率为33.33%（5/15），而CMV的检出率为6.67%（1/15）。综上所述，本发明设计和建立的针对6种常见脑炎病毒的mPCR检测方法，较全面的涵盖了VE的病毒，该方法特异性、敏感性较好，且操作简单、快速，可在在VE早期对病原体进行鉴别，为VE的早期诊断和治疗提供依据，具有一定的临床推广应用价值。SEQUENCELISTING<110>苏州大学<120>用于病毒性脑炎快速诊断的多重PCR试剂盒<160>12<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1ACCCTCAAGTTCTTCCTCAC20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2CCAGTCCAGGCAAATCTTCT20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3ATGGCACGACCCACGGAAGA20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4CGGAGCGGACGTAGGCGAAT20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>5TGAGCGTTGGACACGTGATA20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>6CGGAGCGGACGTAGGCGAAT20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7CCTGAATGATGCTCGGGTAG20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>8GACCTCAGCGTGGAGATTGT20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>9GCGCAAATGCGTAGAAAGGT20<210>10<211>33<212>DNA<213>人工合成<400>10GAGGTATCCATGCCCTGACG20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>11CCTTCCCTAAGACCACCAAT20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>12TAAGACATAGCAGCACAGCA20当前第1页1 2 3