一种禽白血病病毒PCR检测引物组及包括该检测引物组的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种禽白血病病毒PCR检测引物组及包括该检测引物组的试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

随着养禽业规模化养殖的不断深入，禽病的威胁也日益凸显。禽白血病(AvianLeukosis，AL)因其具有高感染率，在水平方向(鸡群之间交互感染)和垂直方向(该病能遗传给下一代)均能传播的特性，该病能感染所有鸡种，感染鸡群呈渐进性发病，持续的低死亡率，是危害养鸡业的主要疾病之一，全球每年因为禽类疾病而造成的经济损失高达数百亿元。禽白血病是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。根据临床症状可分为淋巴细胞白血病、成红细胞白血病，成髓细胞白血病、结缔组织性肿瘤和骨硬化病等，其中以淋巴白血病最为常见。禽白血病病毒可分为A、B、C、D、E和J六个亚型。其中A、B、C、D和J亚型为外源性病毒，而C、D亚型在自然状态下很少存在，E亚型病毒为极普遍存在的内源性病毒，J亚型是90年代后在肉鸡中新发现的，是目前常见的具有致病性的病毒亚型。因此临床上检测A、B和J亚型具有重要的诊断价值。

至今人类对禽白血病的防治几乎还无计可施，既没有疫苗可以利用，也没有有效的药物可以治疗，控制禽白血病的主要方法是通过病原检测，淘汰阳性鸡，净化种群。目前，国际上检测禽白血病病毒抗原最为理想的检测方法是ELISA法，它具有敏感性高、简便、快捷和适用于大规模检测的特点。1979年以来，禽白血病的ELISA诊断试剂盒在国外已实现商品化，尤其近年来，我国陆续培养建立了数家SPF鸡场，今后还会不断增加，对SPF鸡群AL/SV-gs抗原检查目前主要依靠进口试剂盒，不仅价格昂贵而且不方便，由于ALV-J亚型病毒的抗原变异率很高，因此对于某株J亚型病毒具有结合作用的抗体并不能与所有ALV-J的其他分离株结合。因此，在使用ELISA方法进行感染诊断时，也容易出现假阴性结果，影响其准确性。研制较先进的国产试剂盒是我们当前急需要解决的问题。

目前对于禽白血病病毒鉴定及血清分型的方法包括：病毒的分离与鉴定、ELISA方法和PCR技术等，采用病毒分离鉴定方法是诊断禽白血病最为有效的技术，将被检材料进行适当处理后，接种于DF-1细胞，由于只有外源性ALV在DF-1细胞生长，可用P27ELISA试剂盒来检测有无病毒生长，而内源性ALV不能在DF-1细胞上生长，从而可区分内源和外源病毒的感染。但该技术最大的缺点是费时、昂贵、不易对大量样品进行检测，临床检测也很难大量推广使用。采用ELISA试剂盒进行检测，其准确性较高，但有两大缺点：1)价格非常昂贵，不适用于养殖场全群检测；2)ELISA试剂只能检测出外源性的禽白血病病毒，并且不能区别病毒各亚型。PCR检测技术具有特异型好，操作简便，检测成本低廉等特点，适用于规模化种鸡场禽白血病病毒的分型研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种禽白血病病毒PCR检测引物组，能够快速、准确地检测禽类是否患有白血病该亚型病毒。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种禽白血病病毒PCR检测引物组，包括：引物P1、P2、P3和P4；其中P1为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物。

作为优选，引物P1、P2、P3和P4的核苷酸序列为：

P1:GGATGAGGTGACTAAGAAAG；

P2:GCATTACCACAGCGGTACTG；

P3:GTAAACGCCCGCCGGACT；

P4:CGAACCAAAGGTAACACACG。

作为优选，应用PCR检测引物组进行扩增的条件为：

采用20μL的反应体系，包括：PCR-Mix 10μL；ddH₂O 7μL；浓度10pmol/μL的上、下游引物各1μL；cDNA 1μL；

设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，53℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

本发明的第二个目的在于提供包括上述引物组的试剂盒，该试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化种鸡场禽白血病病毒进行分型检测，大大降低了全群检测鸡白血病的时间及成本。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种诊断试剂盒，包括：如上所述的禽白血病病毒PCR检测引物组、ALV-A亚型病毒阳性对照质粒、ALV-B亚型病毒阳性对照质粒、ALV-J亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照。

作为优选，ALV-A亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-A亚型病毒cDNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到838bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pM D18-T载体，即得。

作为优选，ALV-B亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-B亚型病毒cDNA为模板，以P1和P3为引物进行PCR扩增，得到638bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pM D18-T载体，即得。

作为优选，ALV-J亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-J亚型病毒cDNA为模板，以P1和P4为引物进行PCR扩增，得到545bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pM D18-T载体，即得。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明禽白血病病毒PCR检测引物组，能够快速、准确地检测禽是否患有白血病该亚型病毒；

2、本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化种鸡场禽白血病病毒进行分型检测，大大降低了全群检测鸡白血病的时间及成本。

附图说明

图1为对禽白血病病毒A亚型引物的灵敏性检测电泳图；

图2为对禽白血病病毒B亚型引物的灵敏性检测电泳图；

图3为对禽白血病病毒J亚型引物的灵敏性检测电泳图；

图4实施例6的检测电泳图。

具体实施方式

实施例1：PCR引物的设计

禽白血病病毒RNA基因组的两端为非编码区，中间部分为编码区，编码区有4个结构基因，本发明针对禽白血病病毒特殊的env基因序列设计引物。经过多轮筛选，发现以下引物能够快速、准确地对禽白血病病毒A亚型，B亚型和J亚型进行鉴别检测。通过PCR扩增，能获得该env基因序列片段长度大小来区分是哪一种亚型的禽白血病病毒。

本发明提供的检测禽白血病A、B和J亚型病毒的PCR引物组核苷酸序列如下：

P1:GGATGAGGTGACTAAGAAAG；

P2:GCATTACCACAGCGGTACTG；

P3:GTAAACGCCCGCCGGACT；

P4:CGAACCAAAGGTAACACACG。

上述引物组的核苷酸序列，P1为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物。

实施例2：阳性对照质粒的制备及阴性对照

ALV-A亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-A亚型病毒cDNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到838bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，即得。

ALV-B亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-B亚型病毒cDNA为模板，以P1和P3为引物进行PCR扩增，得到638bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，即得。

ALV-J亚型病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以ALV-J亚型病毒cDNA为模板，以P1和P4为引物进行PCR扩增，得到545bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，即得。

阴性对照为：pMD18-T空载体质粒。

实施例3：禽白血病毒RNA的提取

1、组织总RNA的抽提

分别取组织块各10mg至1.5mL Eppendorf微量离心管中，每管分别加入1mL Trizol LS Reagent，匀浆后室温放置5min；每管加入200μL氯仿，剧烈振荡30s，室温放置15min；4℃，12000r/min离心15min；然后将上层水相移到新的灭菌Eppendorf微量离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃放置10min以上，4℃12000r/min离心10min；弃上清液，沉淀加入1000μL预冷的75％乙醇洗涤一次，12000r/min离心10min；小心弃去上清液、风干沉淀，加入适量体积DEPC处理水溶解RNA，直接用于反转录或-20℃冻存备用。

2、RNA的反转录成cDNA

在20μL的反应体系中加入模板RNA 1μg；5×AMV Buffer 4μL；浓度2.5mmol/L的dNTP 4μL；浓度200U/μL的AMV 1μL；浓度25mmol/L的Oligo(dT)181μL，用DEPC水补至20μL；37℃水浴1h，95℃水浴5min灭活，-20℃冻存备用。

实施例4：PCR扩增方法的建立

1、PCR反应体系

以实施例3得到的cDNA为模板进行PCR扩增，20μL的反应体系包括：PCR-Mix(购于Takara公司)10μL；ddH₂O 7μL；从实施例1得到的浓度10pmol/μL的上、下游引物各1μL；cDNA 1μL。对照分别用实施例2得到的ALV-A亚型病毒阳性对照质粒(浓度为100ng/μL)、ALV-B亚型病毒阳性对照质粒(浓度为100ng/μL)、ALV-J亚型病毒阳性对照质粒(浓度为100ng/μL)和阴性对照(浓度为100ng/μL)，取样分别为1μL。

2、PCR反应条件

将装有反应体系的PCR管放入PCR仪后，设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，53℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

实施例5：PCR检测体系的灵敏度评价

进行了不同DNA浓度梯度对禽白血病病毒A，B和J亚型引物分别做灵敏性检测，将浓度为50ng/μL的禽白血病A,B和J亚型病毒DNA的阳性模板均按倍比稀释8次，浓度分别为50ng/μL、25ng/μL、12.5ng/μL、6.25ng/μL、3.13ng/μL、1.57ng/μL、0.78ng/μL和0.39ng/μL。分别通过实施例4的条件进行检测，对A、B和J亚型引物的灵敏性检测电泳图分别如图1-3所示，左右两端泳道均为Marker DL2000：结果显示浓度为0.78ng/μL以上的样本均有明显的目的条带，因此，本发明引物的最低检测浓度是0.78ng/μL，表明应用本发明引物建立的检测禽白血病A、B和J亚型病毒PCR反应具有较高的灵敏度。

实施例6：检测实例

某鸡场对禽白血病病毒进行病原检测，在脾脏提取6份待检组织样品，提取cDNA，按照实施例4的方法进行检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得扩增条带，如图4所示。

通过扩增条带的情况判断样品属性：若样品扩增条带出现838bp的片段，则样品为禽白血病A亚型病毒感染阳性样品；若样品扩增条带出现638bp的片段，则样品为禽白血病B亚型病毒感染阳性样品；若样品扩增条带出现545bp的片段，则样品为禽白血病J亚型病毒感染阳性样品；若扩增条带没有相应片段，则为阴性。

所以，从图4可以判断，显示检测样品为ALV-A，ALV-B和ALV-J混合感染。

将扩增产物回收纯化后，送生物公司测序，测序比对结果说明扩增的目的条带与其对应禽亚型白血病病毒的env基因一致。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。