一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法与流程

背景技术：
：禽结核病(Aviantuberculosis)由禽分枝杆菌感染引起禽的一种慢性传染病。该病呈世界性分布，多呈散发性。该病主要通过消化道和呼吸道感染，呈慢性经过，渐进性消瘦、贫血、鸡冠萎缩、跛行以及产蛋减少或停止。潜伏期约2个月至1年，病禽因衰竭或肝破裂而突然死亡，无明显的季节性和地区性。该病主要特征是禽类肝、脾和肠道等组织器官形成肉芽肿和干酪样结节。一旦传入养禽场，则长期存在，很难根除。世界动物卫生组织将其列为非法定报告动物疫病，我国定为三类动物疫病(关冬梅主编，畜禽结核病及其防制，金盾出版社，2009.6)。禽结核病的诊断一般通过临床症状、剖检变化和涂片出现抗酸染色可作出初步确诊；但抗酸染色敏感性差，检出率约30％，因此具有一定局限性(Gargetal.,2003)。现最常用的办法是通过选择培养基分离分枝杆菌，再通过生化试验确定，本法结果可靠，但周期较长，生化试验涉及的反应程序较多(陆承平，2001)。常规单基因PCR方法是近年来兽医及生物学领域最有价值的研究手段，技术并不复杂，但技术含量较高。不过，在实际操作中由于扩增因子气溶胶污染产生假阳性(Suetal.,2002；Ritellietal.,2003刘思国等，2006)。结核菌素皮内变态反应试验(TST)是诊断禽结核病的方法之一，但该法受到PPD的剂量和注射方法的影响大，而且无法区分感染动物与免疫动物(何昭阳等，1994)。禽结核分枝杆菌种可分为4个亚种，包括禽型分枝杆菌亚种(M.aviumsubsp.Avium)、人/猪型分枝杆菌亚种(M.aviumsubsp.Hominissuis)、林鸽型分枝杆菌亚种(M.aviumsubsp.Silvaticum)及副结核分枝杆菌亚种(M.aviumsubsp.Paratuberculosis)。禽结核病主要由禽型分枝杆菌亚种(血清型1，2，3型；其含有特异性基因片段IS901和非特异性基因片段IS1245)引起；也可能由两个禽结核杆菌复合体成员(人/猪型分枝杆菌亚种，血清型1-6，8-11和21；其缺少IS901，含有IS1245)以及禽胞内分枝杆菌(血清型7，12-20和22-28；均缺少IS901和IS1245)引起，或者含有上述菌种的复合感染(OIE，Chapter2.3.6Aviantuberculosis)。而对于PCR方法，IS901基因片段主要用于检测与毒力有关的禽型分枝杆菌亚种(1、2、3型)及林鸽型分枝杆菌亚种；IS1245是禽结核分枝杆菌4个亚种中均含有的片段；而DanJ是能够感染多种动物及人的禽分枝杆菌复合体成员及禽胞内分枝杆菌种(M.intracellulare)所含有的片段。因此在疑似病变组织及其分离菌体中能同时扩增出这3条典型带(IS901、IS1245和DanJ)说明该菌种系禽分枝杆菌禽亚种(MAA)/禽分枝杆菌林鸽型亚种(MAS)，由于林鸽型亚种主要引起林鸽(woodpigeon)的结核病，因此对于家禽疑似病料组织，一旦多重PCR扩增出3条特异性带，即可判定为禽结核病。技术实现要素：本发明的目的主要针对当前传统诊断家禽结核病方法的缺点，如敏感性差(临床症状及染色法)，操作繁琐及时间长(培养及生化试验法)，影响因素多，主观判定影响大(变态反应法)，特异性差(常规单基因PCR法)，发明了一套快速诊断家禽结核病的多重PCR方法检测试剂盒和检测方法，从而实现家禽结核病的快速确诊，及时防控。本发明技术方案1.一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有多重PCR引物组、2×PCR核心试剂预混物PremixTaq反应液、阳性对照、阴性对照和DL1000分子量标准溶液。2.根据权利要求1所述一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒中的多重PCR引物组为：扩增序列3的DnaJ基因片段的引物对序列1和序列2，引物工作浓度为20pmol/μl；扩增序列6的IS1245基因片段的引物对序列4和序列5，引物工作浓度为10pmol/μl；扩增序列9的IS901基因片段的引物对序列7和序列8，引物工作浓度为10pmol/μl。3.权利要求2所述的一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)提供临床疑似家禽样品DNA，并同时设立阴性对照ddH2O及阳性对照禽结核参考菌株CVCC68201的DNA；(2)配制20μL多重PCR反应体系：1)模板：样品DNA/阳性对照/阴性对照1μL；引物组：DnaJ、IS1245和IS901基因的上下游引物各1μL；2×PCR核心试剂预混物PremixTaq反应液10μL，ddH2O1μL。(3)采用如下PCR反应程序：第一步，96℃2min；第二步，96℃10s，56℃～60℃10s，72℃1min，35个循环；第三步，72℃2min；(4)PCR反应结束后，取10μL产物及5μLDL1000分子量Marker进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察结果；(5)结果判定如DNA分子量Marker出现标准条带，空白对照无条带出现，阳性对照有DnaJ、IS1245和IS901基因相符的特异扩增条带，说明实验成立；否则，此次实验视为无效。在实验成立的条件下，多重PCR检测试剂盒检测的疑似临床样品DNA，如扩增条带呈现579bp的IS901基因片段、387bp的IS1245基因片段和142bp的dnaJ基因片段三条带，则可直接判为禽结核病阳性。本发明具体实施方式1.确定了诊断禽结核病多重PCR方法的3个基因(DnaJ、IS1245和IS901基因)，设计了3对引物组(见表1)，优化了多重PCR试剂盒反应条件(特别是退火温度Tm)，确定了反应体系和程序。表1基因引物及扩增序列(1)对比文献报道，最终筛选出多重PCR方法的3个基因(DnaJ、IS1245和IS901基因)，通过对比NCBI公布的基因序列，设计3对特异性的引物对(见表1)。(2)根据生物信息学软件对各对引物的Tm(退火温度)评估值不同，设计了温度梯度PCR方法，优化确定了最适Tm为56℃～60℃。确定了反应体系和程序。(3)确定20μL多重PCR反应体系，含模板(样品DNA/阳性对照/阴性对照)1μL，引物组共6μL(含DnaJ、IS1245和IS901基因的上下游引物各1μL)，2×PCR核心试剂预混物(PremixTaq反应液)10μL，ddH2O1μL。采用如下PCR反应程序：第一步，96℃2min；第二步，96℃10s，56℃～60℃10s，72℃1min，35个循环；第三步，72℃2min。2.运用禽结核病参考菌株明确了实验成立的条件，确定了多重PCR试剂盒的敏感性。(1)运用禽结核病参考菌株CVCC68201提取的DNA作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照，以及标准的DNA分子Marker明确了试验成立的条件，即DNA标准Marker出现标准条带，空白对照无条带出现，阳性对照有DnaJ、IS1245和IS901基因相符的特异扩增条带，说明实验成立；否则，此次实验视为无效。(2)将阳性对照DNA测定浓度后，用ddH2O作梯度稀释后，然后再用建立的多重PCR体系检测，明确其灵敏度(最小检测量)，结果最小检测量可达0.38ng。3.确定多重PCR试剂盒的特异性：运用建立的多重PCR试剂盒对牛结核病参考菌株，以及引起可能引起禽结核病的禽分枝杆菌各个亚种的代表株的基因组DNA进行检测，发现仅有禽型亚种/林鸽型亚种可同时扩出3条带，由于林鸽型亚种主要引起林鸽(woodpigeon)的结核病，因此一旦家禽疑似病料组织DNA中经多重PCR扩增出3条特异性带，即可判定为禽结核病。4.运用国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽结核病分离冻干菌株对多重PCR试剂盒检测效果进行验证。所涉及的16株禽结核分枝杆菌菌种均为禽结核分枝杆菌禽亚种，可扩增出142bp、387bp、579bp条带。该结果与菌种目录(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p81-84)中收载结果一致。5.运用典型家禽结核病的不同组织临床病料，确定多重PCR试剂盒实际检测能力。对临床禽结核病的鸡肝、脾、肺、肠提取的DNA中均扩出579bp(IS901基因片段)、387bp(IS1245基因片段)和142bp(dnaJ基因片段)，符合典型的禽结核病特点。6.对临床送检疑似家禽结核病的50份样本分别运用多重PCR试剂盒、抗酸染色法、细菌分离及生化试验法、单基因PCR法进行检测，确定试剂盒与传统方法的符合率。对临床送检疑似家禽结核病的50份样本，多重PCR试剂盒共检测确诊禽结核病39份，与传统诊断禽结病的“金标准”方法(细菌分离培养及生化试验法)结果一致。附图说明图1：多重PCR方法退火温度敏感性测定其中：1-7为退火温度依次为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃，M:Marker。图2：多重PCR方法敏感性检测结果其中：M为Marker,1-7为标准菌株CVCC68201基因组浓度梯度依次为:1.5ng/μL、0.75ng/μL、0.38ng/μL、0.19ng/μL、0.09ng/μL和0.05ng/μL。图3：标准菌株DNA的多重PCR扩增结果其中：1为CVCC68001，2为CVCC68002，3为CVCC291，4为CVCC68201，5为CVCC323，6为CVCC281，7为空白对照,M为Marker。图4：23株标准菌株的多重PCR扩增结果其中：1为CVCC281，2为CVCC274，3为CVCC283，4为CVCC1610，5为CVCC1607，6为CVCC1601，7为CVCC1602，8为CVCC279，9为CVCC1608，10为CVCC1609，11为CVCC1604，12为CVCC1603，13为CVCC277，14为CVCC278,15:CVCC1605,16为CVCC284,17为CVCC280,18为CVCC282，19为CVCC1606，20为CVCC275，21为CVCC276，22为CVCC1646，23为CVCC1625，24为空白对照，M为Marker。图5：临床病料中多重PCR鉴定，图中：1为阳性对照；2为空白对照；3为鸡肝；4为鸡脾；5为鸡肺；6为鸡肠。本发明涉及微生物资源信息本发明涉及的微生物资源信息，请见表2.表2本发明涉及的微生物资源表上述菌株均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应请见《菌种目录》(中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录2002年，第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p81-84,p86)。本发明的积极效果禽结核病诊断主要通过临床症状、剖检变化及抗酸染色进行初诊，通过细菌培养分离后进行生化实验进行确诊，仅分离培养需要2～3周时间，而生化试验至少涉及4个项目，操作繁琐、周期长；而通过常规的单对引物PCR方法特异性差，只能辅助诊断。本发明的目的主要针对当前传统诊断家禽结核病方法的缺点，如敏感性差(临床症状及染色法)，操作繁琐及时间长(培养及生化试验法)，影响因素多，主观判定影响大(变态反应法)，特异性差(常规单对PCR法)，发明了一套快速诊断家禽结核病的多重PCR方法检测试剂盒和检测方法，从而实现家禽结核病的快速确诊，及时防控。实施例以下实施例为进一步说明本发明，不对本申请的请求保护的技术方案构成限制。实施例1——多重PCR建立及退火温度的优化以提取的禽结核病参考菌株(CVCC68201)全基因组DNA为模板，参考NCBI公布的DnaJ、IS1245和IS901的序列，设计3对引物进行扩增，将退火温度设计成不同温度梯度。反应体系为20μL：基因组1μL，DnaJ引物(20pmol/μL)、IS1245引物(10pmol/μL)、IS900(10pmol/μL)和IS901(10pmol/μL)的上下游引物各1μL，2×PCR反应液PremixTaq10μL，灭菌双蒸水1μL。反应程序：第一步，96℃2min；第二步，96℃10s，50℃(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃)10s，72℃1min，35个循环；第三步，72℃2min。PCR反应结束后，取10μL产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察结果。由图1可知，禽结核病参考菌株(CVCC68201)全基因组DNA均可扩出579bp(IS901基因片段，序列9)、387bp(IS1245基因片段，序列6)和142bp(dnaJ基因片段，序列3)的三条特异性条带；当退火温度设定为50℃～62℃时，利用多重PCR检测体系均能有效扩增出该目的基因，但以56℃～60℃的退火温度最佳。序列3(DanJ)142bp序列6(IS1245)387bp序列9(IS901)579bp实施例2——多重PCR试剂盒灵敏度(基因组DNA最小检测量)的确定运用Nanodrop微量测定仪将提取的禽结核分枝杆菌参考菌株(CVCC68201)基因组DNA测定浓度后，用双蒸水梯度稀释成1.5ng/μL、0.75ng/μL、0.38ng/μL、0.19ng/μL、0.09ng/μL和0.05ng/μL，用建立的多重PCR试剂盒进行检测和电泳，确定其对DNA的最小检测量。由图2可知，随着反应体系中模板浓度的降低，多重PCR试剂盒的最低检测限度为0.38ng/μL，即20μL反应体系中0.38ng。实施例3——多重PCR试剂盒特异性检测提取禽分枝杆菌各亚种代表菌株CVCC68201(禽亚种)、CVCC323(副结核亚种)、CVCC280(人猪亚种)的基因组DNA，并选择牛分枝杆菌标准菌株CVCC68001、CVCC68002、CVCC291的基因组DNA作为对照，运用建立的多重PCR反应体系检测和电泳，确定特异性检测结果。由图3看出，牛分枝杆菌及副结核亚种仅能扩增出142bp条带，禽分枝杆菌各亚种代表菌株均能扩增出142bp条带，其中禽型亚种扩增出142bp、387bp、579bp条带，人猪型亚种扩增出142bp、387bp条带。实施例4——多重PCR试剂盒对保存的禽分枝杆菌菌种鉴定提取国家兽医微生物菌种保藏中心保存的23株禽分枝杆菌基因组DNA，运用建立的多重PCR反应体系检测和电泳，由图4看出，所涉及的23株禽分枝杆菌中，菌株CVCC281、CVCC283、CVCC284、CVCC280、CVCC282为禽结核分枝杆菌人猪型亚种，可扩增出142bp、387bp条带；菌株CVCC1646和CVCC1625为副结核亚种，可扩增出142bp条带；其他16株菌株均为禽结核分枝杆菌禽亚种，可扩增出142bp、387bp、579bp条带。该结果与菌种目录[14]中收载结果一致。实施例5——多重PCR试剂盒对临床病料中样品DNA的检测验证1.临床家禽结核病病变组织DNA提取：取适量病变(肝、脾、肺、肠)组织样品(剔除脂肪、被膜)，剪碎，按1∶5(W/V)的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液(例：1g组织样品，加入5mL缓冲液)，充分研磨；加等量4％NaOH溶液，继续研磨5min～10min，使组织液化；移入离心管，充分振荡，75℃温浴0.5h～1h；取上清液(避免吸取粗渣)，15000g离心10min，弃上清液。沉淀加入与上清等量的0.01mol/LpH7.6PBS，充分悬浮并振荡混匀，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤1次；收集沉淀物，在沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液(100mmol/LTris-HCL(pH8.0)，0.01％TritonX-100，200μg/μL蛋白酶K),充分振荡混匀，56℃温浴30min，98～100℃加热10min，瞬时离心，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，取上清液，直接用于PCR或贮存于-80℃备用。2.运用多重PCR试剂盒对临床家禽结核病的鸡肝、脾、肺、肠提取的DNA进行检测，结果如图所示，肝、脾、肺、肠DNA均扩出579bp(IS901基因片段)、387bp(IS1245基因片段)和142bp(dnaJ基因片段)，符合典型的家禽结核病特点。实施例6——多重PCR试剂盒与常规方法的比较结果对50份疑似家禽结核病料样本，分别运用抗酸染色法、细菌分离培养及生化试验法、常规单基因PCR法以及本试剂盒方法进行检测，具体结果如下表2。从表中结果看出多重PCR特异性强，与诊断“金标准”(细菌分离培养进行生化试验检测法)的结果一致。表2本发明的多重PCR试剂盒与常规方法的比较结果总样本个数抗酸染色细菌分离培养及生化试验单基因PCR多重PCR试剂盒5030394339序列表<110>中国兽医药品监察所<120>一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法<130><160>9<170>Patentinversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增DnaJ基因的上游引物<400>1AGACTTCTACAAGGAGCTGGG21（序列1）<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增DnaJ基因的下游引物<400>2GGAGACCGCCTTGAATCGTTC21（序列2）<210>3<211>142<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增的DnaJ基因<400>3AGACTTCTACAAGGAGCTGGGCGTCTCCTCTGACGCCAGTCCCGAAGAGATCAAACGCGC060CTACCGCAAGCTGGCGCGCGATCTACACCCGGATGCCAATCCCGACAATCCCGCTGCCGG120CGAACGATTCAAGGCGGTCTCC142扩增IS1245基因的引物对<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增IS1245基因的上游引物<400>4GGAGTTGACCGCGTTCATCG20（序列4）<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增IS1245基因的下游引物<400>5GCGTCGAGGAAGACATACGG20（序列5）<210>6<211>387<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增IS1245的基因<400>6GGAGTTGACCGCGTTCATCGGGGCTTCTCCCCATGAGCGCACCGAGACCCGCTCCAATCA060GCGCAACGGCTCGCGTCCGCGCACGCTGTCCACGGTCGCAGGGGACCTGGAACTGCGGAT120TCCCAAGCTGCGCACCGGGTCATTTTTCCCGGCGTTGTTGGAGCGGCGTCGCCGGGTCGA180TCAGTGCTTGTTCGCGGTGGTGATGGAGGCCTACCTGCACGGCACCTCCACCCGCAAGGT240CGACGATCTGGTCAAGGCACTGGGTACCGATACCGGGATCTCCAAAAGCGAGGTCAGCCG300GATCTGCAAAGACCTCGACACCGAGGTCGCGGCCTTCCGGGACCGGCCGTTGGGTGATCA360GCGCTTTCCGTATGTCTTCCTCGACGC387<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增IS901基因的上游引物<400>7CGGATTGCTAACCACGTGGTG21（序列7）<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增IS901基因的下游引物<400>8TGCGAGTTGCTTGATGAGCG20（序列8）<210>9<211>579<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：扩增IS901的基因<400>9CGGATTGCTAACCACGTGGTGTGGGCGATCGATTTGACCTCGCGCCGGCGGCGGCTGCTG060ATCGCCGTACTGCTGAGCGCGAAAGCCGAGGTGGTGTATGTGCCGGGCCGCACGGTTAAC120ACGATGAGTCATGCGTTCCGCGGCGAAGGCAAGACCGACGCCAAAGACGCGCGGGTAATC180GCCGAAACCGCTCGGCACCGACGAGATCTGTCCCCGGTCGTACCCGGCGAAGACCTGGTT240GCCGAATTGCGGTCGCTGACCGCATACCGGTCGGATCTGATGGCTGACTGGGTGCGAGGC300GTGAACCGCGTGCGCTCGATGCTCACCGCCATCTTCCCTGCTCTGGAAGCTGCGTTCGAC360TACTCCACCCGCGCGCCGTTGATCCTGGTATCCGCTATGTGCACTCCGGGCGAAATCCGG420TCGGCAAAAAGAGCTGGCGTGATCAAGCACCTTCGGAAAAACCGGGCATGGCCCAACAAC480ATCGACACGATCGCCGACAAGGGCCTCGCCGCGGCAGCAGGCCAGATAATCACCCTTCCC540GGCGAAGCCGGAACCGCCGCGCTCATCAAGCAACTCGCA5793当前第1页1 2 3