一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法与流程

本发明涉及一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法，属于生物技术及发酵食品领域。

背景技术：

耐酸乳杆菌广泛存在于各种发酵食品酿造体系中，包括白酒、黄酒、食醋、泡菜、酱油、酸奶、干酪、酒酿、豆豉、乳腐、黄酒、啤酒、葡萄酒等，并且是发酵食品酿造体系中的优势微生物。通过高通量测序结果表明，在白酒酒醅发酵中后期细菌中有90％以上为耐酸乳杆菌，其优势阶段占据整个发酵阶段2/3的时间，这是由于耐酸乳杆菌能够耐受或适应于高酸度、高乙醇浓度、低含氧量等不利条件的特性所决定的。有研究发现，白酒发酵中后期是乙酸、乳酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯等重要风味物质形成的阶段，而耐酸乳杆菌被认为是生成这些风味物质的重要菌株，因此该菌对白酒的风味具有巨大的贡献。故而对于耐酸乳杆菌的分离鉴定非常重要。但是耐酸乳杆菌为兼性厌氧微生物，营养条件十分苛刻，且耐酸乳杆菌在菌落形态与理化性质上与多数乳酸菌间差异不显著，这给耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及定量工作带来了极大的困难，也是目前对于耐酸乳杆菌研究较少的主要原因。

由于常规培养基缺乏耐酸乳杆菌菌生长所需的独特生长因子，耐酸乳杆菌在常规MRS、番茄汁琼脂(TJA)等培养基上几乎不能生长；此外，目前对于耐酸乳杆菌的筛选鉴定，主要通过菌株的理化性质或16srDNA的方法。这种鉴定方法存在周期长、费用高、成功率低等问题。因此，在耐酸乳杆菌筛选鉴定方面存在很多亟待解决的问题，建立一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法是十分必要并且具有重要意义的。

技术实现要素：

为解决上述问题，弥补现有乳酸菌筛选、鉴定及定量技术的不足，首先，本发明提供了一种有效提高乳酸菌筛选、鉴定及定量效率的特异性引物。其次，本发明改良了传统的MRS培养，添加多种营养因子提高了乳酸菌的存活率，添加制霉素抑制杂菌的生长，添加溴甲酚绿能快速识别产酸乳酸菌。最后，利用特异性引物能够快速、准确地从产酸乳酸菌中筛选出耐酸乳杆菌。

本发明的第一个内容是提供了一种发酵食品中耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及其特异性定量方法，所述方法是以上述耐酸乳杆菌中糖基水解酶的编码基因的核苷酸序列作为模板设计引物对。

在本发明的一种实施方式中，所述糖基水解酶编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。

本发明的第二个内容是提供了一对特异性引物，以提高耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及定量效率，所述特异性引物对序列为LaF1:5′-AACATCCCCAGAGCGTCAAG-3′；LaR1:5′-GGCACTACCCCAAGCATCTT-3′。

本发明的第三个内容是该特异性引物对在耐酸乳杆菌筛选鉴定方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述样品为任意来源含有耐酸乳杆菌的菌体、菌落、菌液以及基因组样品。

在本发明的一种实施方式中，所述筛选是在每升MRS培养基主溶液的基础上，添加1～5mL副溶液混匀使用；副溶液的组成：指示剂溴甲酚绿0.01～0.02g/mL，营养因子D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐、甲瓦龙酸内脂和维生素B11，其中，D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.01～0.02g/mL、甲瓦龙酸内脂0.005～0.015g/mL、维生素B11 0.01～0.015g/mL，制霉素0.04～0.06g/mL，溶剂为二甲基亚砜，使用无菌滤膜过滤灭菌。

在本发明的一种实施方式中，所述MRS培养基的组分包括：胰蛋白胨8.0～15.0g/L、牛肉浸膏5.0～10.0g/L、酵母提取物2.0～6.0g/L、葡萄糖18.0～25.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.5～1.5mL/L、K₂HPO₄1.0～5.0g/L、三水合乙酸钠1.0～10.0g/L、柠檬酸三铵1.0～5.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.1～0.5g/L、MnSO₄·4H₂O0.01～0.1g/L、琼脂15.0～25.0g/L(液体培养基不添加)调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；溴甲酚绿0.01～0.02g/mL、D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.01～0.02g/mL、甲瓦龙酸内脂0.005～0.015g/mL、维生素B110.01～0.015g/mL和制霉素0.04～0.06g/mL，添加二甲基亚砜配制成副溶液，使用0.2μm无菌滤膜过滤灭菌；主溶液冷却至40～60℃时，添加1～5mL副溶液混匀使用。

在本发明的一种实施例中，所挑选的目的菌落为平板上单菌落周围培养基由蓝色变为黄色的菌落。

在本发明的一种实施方式中，所述特异性引物PCR，是指利用特异性引物对进行PCR，如果PCR产物检测，显示具有100～250bp之间的片段，则代表该菌落为耐酸乳杆菌。如果PCR产物不在100～250bp之间或者没有条带，则代表该菌落不含耐酸乳杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR反应体系为：总体系25～50μL：Prime STAR12.5～25μL，上下游引物各0.5～1.0μL，菌液1～2μL，超纯水11～22μL。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR反应条件为：预变性90～98℃2～10min，变性95～98℃5～15s，退火50～60℃0.5～1.5min，延伸68～75℃1～5min，共20～45个循环，68～75℃8～15min。

本发明的第四个内容是该引物对在利用荧光定量聚合酶链式反应(RTFQ PCR)对耐酸乳杆菌特异性定量方面的应用

在本发明的一种实施方式中，所述样品为任意来源含有耐酸乳杆菌的菌体、菌落、菌液以及基因组样品。

在本发明的一种实施方式中，所述RTFQ PCR反应体系为，总体系10～40μL：2×FastqPCR Master Mix(with loading dye)5～20μL，上下游引物各0.2～0.8μL，基因组0.5～1.5μL，超纯水4.1～16.4μL。

在本发明的一种实施方式中，所述RTFQ PCR反应条件为：预变性92～98℃3～8min，变性90～98℃5～15s，退火40～60℃15～40s，延伸65～75℃0.5～1.5min，共30～50个循环，65～75℃8～12min。

本发明的有益效果：

本发明所改良的MRS培养基能够提高发酵食品中耐酸乳杆菌的存活率、抑制杂菌的生长、便于识别产酸乳酸菌；

本发明所设计的引物对通过特异性引物PCR技术能够快速准确地从发酵食品中筛选鉴定出耐酸乳杆菌；

本发明所设计的引物对通过RTFQ PCR技术能够用于发酵食品中耐酸乳杆菌的快速、准确定量；

本发明所设计的引物对，用于耐酸乳杆菌的定性、定量时，具有速度快、准确度高和适用范围广的特点。

附图说明

图1：特异性引物对的PCR扩增产物电泳验证；

图2：目的菌株的特异性筛选PCR扩增产物电泳分析；

图3：目的菌株16sr DNA PCR扩增产物电泳分析；

图4：循环阈值与耐酸乳杆菌菌浓的标准曲线；

图5：耐酸乳杆菌荧光定量PCR的反应结果。

具体实施方式

实施例1：耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)特异性引物对的设计

特异性引物对的设计方法：

(1)汾酒发酵过程中主要的乳酸菌种属为耐酸乳杆菌(L.acetotolerans)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、干酵母乳杆菌(L.diolivorans)、香肠乳杆菌(L.farciminis)和清酒乳杆菌(L.sakei)(乳酸菌在酒醅中的存在率＞1％)；

(2)通过京都基因与基因组百科全书代谢通路(KEGG Pathway)寻找耐酸乳杆菌与其余6株乳酸菌之间的特异性酶—糖基水解酶(glycosyl hydrolase)，获取该特异性酶的2328bp 的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.1；

(3)将该核苷酸序列通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)使用局部序列排比检索基本工具(BLAST)进行比对，比对结果仅与耐酸乳杆菌(NBRC13120)的基因组序列具有100％的相似度，表明糖基水解酶所对应的2328bp氨基酸序列是L.acetotolerans的高度特异性序列；

(4)利用NCBI Primer-BLAST工具，设定引物参数(Primer Parameters)：聚合酶链式反应(PCR)产物长度(PCR product size)80～300；设定引物对特异性验证参数(Primer Pair Specificity Checking Parameters)：数据库(Database)nr；其余参数按照默认设定；

(5)从所获得的对引物对中，利用DNAMAN软件挑选不能够自身成环(self-complementarity)序列号为SEQ ID NO.2的上游引物LaF1：5’-AACATCCCCAGAGCGTCAAG-3’和序列号为SEQ ID NO.3下游引物LaR1：5’-GGCACTACCCCAAGCATCTT-3’作为可能性目的引物对，PCR产物长度151bp，Tm为60℃，GC％为55％；

(6)以可能性目的引物对为上下游引物在NCBI中进行BLAST，比对结果只与耐酸乳杆菌具有100％相似度，这表明所选LaF1/LaR1引物对可能性目的引物对为适于此环境下的特异性引物对。

实施例2：耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)特异性引物对的验证

特异性引物对的验证：

(1)选择两株目的耐酸乳杆菌(LA1、LA2)进行菌落PCR，阴性对照为白酒酒醅发酵过程中的优势微生物：短乳杆菌(LB)、干酪乳杆菌(LC)、戊糖乳杆菌(LP)、Lactobacillus diolivorans(LD)、Lactobacillus farciminis(LF)、Lactobacillus sakei(LS)、Pediococcus parvulus(PP)、Pseudomonas hunanensis(PH)、Pichia kudriavzevii(PK)、Geotrichum candidum(GC)、Naumovozyma castellii(NC)以及重蒸水(dd H₂O)；

(3)PCR反应体系为25μL：Prime STAR12.5μL，上下游引物各0.5μL，菌液1mL；

(4)PCR的反应程序：预变性94℃4min，变性98℃10s，退火55℃1min，延伸72℃2min，共30个循环，72℃10min；

(5)琼脂糖凝胶电泳：2％的琼脂糖凝胶，2μL染液，4μL PCR产物，Mark为DL2000，160V，20min；

(6)通过凝胶成像仪观察引物的特异性，LA1、LA2在151bp附近具有明显的目的条带，而其余阴性对照没有条带(如图1所示)，则表明所设计的特异性引物对具有对L.acetotolerans的特异性。

实施例3：耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans的筛选

在耐酸乳杆菌培养过程中，通过多次尝试发现添加一定比例的3种营养因子—D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐、甲瓦龙酸内脂和维生素B11能够极大地提高耐酸乳杆菌的存活率。此外，根据耐酸乳杆菌的产酸时间早于其它乳酸菌，且产酸能力要强于其他乳酸菌，针对乳酸菌的产酸特性设计有效的指示培养基非常重要。

培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K₂HPO₄2.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、MnSO₄·4H₂O0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；溴甲酚绿0.015g/mL、D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.01g/mL、甲瓦龙酸内脂0.01g/mL、维生素B110.01g/mL和制霉素0.05g/mL，添加二甲基亚砜配制成副溶液，使用0.2μm无菌滤膜过滤灭菌；使用时，主溶液冷却至50℃，添加2mL副溶液混匀使用。

样品前处理：称取10g发酵食品于已灭菌装有100mL无菌PBS缓冲液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯盐酸盐)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。

微生物培养：取10^-3、10^-4和10^-53个样品菌悬液稀释度涂布于上述MRS培养基平板中于37℃厌氧箱中培养84h，挑选挑取平板上周围培养基由蓝色变为黄色的单菌落并编号，使用特异性引物进行菌落PCR。PCR反应条件和琼脂糖凝胶电泳同“特异性引物验证”。

实验结果特异性筛选PCR扩增产物电泳图如图2所示。菌落编号D6、F1和F6具有目的条带。

实施例4：耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans筛选验证

通过凝胶成像仪，选择实施例3中所有进行编号的单菌落，使用细菌通用引物对1492R/F27进行16srDNA菌落PCR(如图3所示)，阳性对照(CK+)为目的菌株，阴性对照(CK-)为重蒸水。将PCR产物进行核苷酸测序，将核苷酸序列使用NCBI进行BLAST比对，比对结果结果显示具有目的条带的菌落编号D6、F1和F6对应的的16srDNA菌落PCR结果与耐酸乳杆菌(LC202658.1)具有100％的相似度，从而快速得知D6、F1和F6所对应编号的菌落为目的乳酸菌。

实施例5：耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans的筛选

培养基的配制：胰蛋白胨15.0g/L、牛肉浸膏10.0g/L、酵母提取物6.0g/L、葡萄糖25.0g/L、无水山梨醇油酸酯1.5mL/L、K₂HPO₄5.0g/L、三水合乙酸钠10.0g/L、柠檬酸三铵5.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、MnSO₄·4H₂O0.1g/L、琼脂25.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL 蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；溴甲酚绿0.02g/mL、D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.02g/mL、甲瓦龙酸内脂0.015g/mL、维生素B11 0.015g/mL和制霉素0.06g/mL，添加二甲基亚砜配制成副溶液，使用0.2μm无菌滤膜过滤灭菌；使用时，主溶液冷却至60℃，添加5mL副溶液混匀使用。

样品前处理：称取10g发酵食品于已灭菌装有100mL无菌PBS缓冲液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯盐酸盐)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。

微生物培养：取10^-3、10^-4和10^-53个样品菌悬液稀释度涂布于上述MRS培养基平板中于37℃厌氧箱中培养84h，挑选挑取平板上周围培养基由蓝色变为黄色的单菌落并编号，使用特异性引物进行菌落PCR。

PCR反应条件和琼脂糖凝胶电泳同“特异性引物验证”。

实验结果同实施例3，三株菌落的PCR产物在100～250bp之间有条带。

实施例6：耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans的筛选

培养基的配制：胰蛋白胨8.0g/L、牛肉浸膏5.0g/L、酵母提取物2.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.5mL/L、K₂HPO₄1.0g/L、三水合乙酸钠1.0g/L、柠檬酸三铵1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.1g/L、MnSO₄·4H₂O0.01g/L、琼脂15.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；溴甲酚绿0.01g/mL、D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.01g/mL、甲瓦龙酸内脂0.005g/mL、维生素B110.01g/mL和制霉素0.04g/mL，添加二甲基亚砜配制成副溶液，使用0.2μm无菌滤膜过滤灭菌；使用时，主溶液冷却至40℃，添加1mL副溶液混匀使用。

样品前处理：称取10g发酵食品于已灭菌装有100mL无菌PBS缓冲液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯盐酸盐)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。

微生物培养：取10^-3、10^-4和10^-53个样品菌悬液稀释度涂布于上述MRS培养基平板中于37℃厌氧箱中培养84h，挑选挑取平板上周围培养基由蓝色变为黄色的单菌落并编号，使用特异性引物进行菌落PCR。PCR反应条件和琼脂糖凝胶电泳同“特异性引物验证”。

实验结果同实施例3，三株菌落的PCR产物在100～250bp之间有条带。

实施例7：发酵酒醅中耐酸乳杆菌Lactobacillus acetotolerans)的RTFQ PCR

建立CT值与耐酸乳杆菌菌浓的标准曲线(如图4所示)。

提取酒醅样品中的总基因组，基因组浓度为10ng/μL。

使用LaF1/LaR1引物对对多提取的基因组进行RTFQ PCR

RTFQ PCR反应体系为：总体系20μL：2×Fast qPCR Master Mix(with loading dye)10μL，上下游引物各0.4μL，基因组1μL，超纯水8.2μL。

所述RTFQ PCR反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃10s，退火50℃0.5min，延伸70℃1min，共40个循环，70℃10min。

根据反应结束的CT值(如图5所示)，通过所建立的标准曲线计算耐酸乳杆菌在样品中的浓度为C＝8.2×10⁸CFU/mL。

对照例1：

培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K₂HPO₄2.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、MnSO₄·4H₂O0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；溴甲酚绿0.015g/mL、D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.01g/mL和制霉素0.05g/mL，添加二甲基亚砜配制成副溶液，使用0.2μm无菌滤膜过滤灭菌；使用时，主溶液冷却至50℃，添加2mL副溶液混匀使用。

样品前处理：称取10g发酵食品于已灭菌装有100mL无菌PBS缓冲液(pH7.4，含0.5g/L D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。

微生物培养：取10^-3、10^-4和10^-53个样品菌悬液稀释度涂布于上述MRS培养基平板中于37℃厌氧箱中培养84h，挑选挑取平板上周围培养基由蓝色变为黄色的单菌落并编号，使用特异性引物进行菌落PCR。PCR反应条件和琼脂糖凝胶电泳同“特异性引物验证”。

实验结果显示，PCR产物不在100～250bp之间或者没有条带，说明耐酸乳杆菌在上述MRS培养基中没有生长。

对照例2：

培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K₂HPO₄2.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、MnSO₄·4H₂O0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；溴甲酚绿0.015g/mL、甲瓦龙酸内脂0.01g/mL和制霉素0.05g/mL，添加二甲基亚砜配制成副溶液，使用0.2μm无菌滤膜过滤灭菌；使用时，主溶液冷却至50℃，添加2mL副溶液混匀使用。

样品前处理：称取10g发酵食品于已灭菌装有100mL无菌PBS缓冲液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯盐酸盐)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min摇床振荡混匀30min，静置5min获得菌悬液。

微生物培养：取10^-3、10^-4和10^-53个样品菌悬液稀释度涂布于上述MRS培养基平板中于37℃厌氧箱中培养84h，挑选挑取平板上周围培养基由蓝色变为黄色的单菌落并编号，使用特异性引物进行菌落PCR。PCR反应条件和琼脂糖凝胶电泳同“特异性引物验证”。

实验结果表明，PCR产物不在100～250bp之间或者没有条带，说明耐酸乳杆菌在上述MRS培养基中没有生长。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉次技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2328

<212> DNA

<213> 耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）

<400> 1

atggcaagtg taaataaaca tgttaattat aaattgatta cttcaattgc tgctgcgaca 60

ttattaggat taattgaatt acaaagtcaa acggtaaaag cagaggtaaa tgctacaccc 120

cttataatac aacaacgggt taaccaagat gataataatg atccgttgtt taacggtgct 180

gatgtttcaa atgggtatac tgataaaggc tatacctatg tagaaccaac tttaacatcc 240

ccagagcgtc aagactcata tcatttaacg actaatcaag gttggtcgaa tgatttgcaa 300

actattaact ataatcaaaa agataataat tataatttat attatcttca tacagagggt 360

ggagctaatg gcaatgcaac cggtggtcaa aactggcagc gtgtaacgac caaagacttt 420

actcacttta gcaaacccaa tactgctatt caggataaag gaaatattaa agatgcttgg 480

ggtagtgcct ggacaggatc aattattact aataaaggta atattaccgg tgtacctaaa 540

ggtgcacaag tagcttattt ttcagggtta agtattaagg ataaacaaca gaatatttgg 600

gcagcctggt cggataatga tggtcaaagt tttgatcata tcctttataa tggctttcca 660

gtaattgatc attattggga ttggacttct aaaaataaat ctgatgaaag agatccttcg 720

gttttttatt ggcataataa actaattatg tatgcggctg aaggtaatga tttaggtgtt 780

tatcaatccg cagatggtct ccattggtca aaagctaatc ccgaaaatga aagtaaggtt 840

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ccagaaaagg aaccgaataa tatggctgaa attaaaggaa ctgctagtaa tagtcagttg 1980

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attggcaaaa ataaatttat aaaaaaagct aattttcaaa tcaaataa 2328

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aacatcccca gagcgtcaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggcactaccc caagcatctt 20