本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及毕赤酵母重组菌及其在高密度发酵产菊粉内切酶中的应用。
背景技术：
目前，源于菊粉的低聚果糖，作为一种功能糖，广泛应用于医药保健业、食品工业等领域。低聚果糖能够促进双歧杆菌的增殖、低致龋性、难消化性及类似膳食纤维等作用，现已成为一种具有独特生理活性的食物配料。低聚果糖是一般由菊粉，经内切菊粉酶生物降解后制备而成。因此，内切菊粉酶是制备低聚果糖的核心与关键，直接影响低聚果糖的产品品质。
内切菊粉酶，作为一种关键的低聚果糖生产的生物助剂，是能够水解β-2,1-D-果糖苷键的一类酶，学名为β-2,1-D-果聚糖酶。菊粉可通过菊粉酶降解的方法制备得到果糖和低聚果糖。菊粉酶是一类催化菊糖水解的复合酶类，由内切菊粉酶与外切菊粉酶组成。菊粉是在菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的协同作用下被彻底降解成单糖的。而菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖的机理是菊粉多糖在内切酶的作用下主要形成低聚果糖。菊粉酶的来源很广，其中微生物来源的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。近年来，科研人员致力于筛选和构建新的产酶菌种，对现有菌种进行改造，采用先进的发酵产酶技术，以及对酶分子的修饰，以获取高酶活、热稳定性好的工业生产低聚果糖用生物助剂。高细胞密度发酵(high cell density fermentation，HCDF)，是在传统发酵技术上改进的发酵技术，它采用增加工程菌对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵密度，极大地改进了发酵工艺，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)，不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高了在市场上的竞争力。目前，高密度发酵工艺已成为生物技术中进行中试生产的主要发酵工艺。毫无疑问，对于内切菊粉酶来说，高细胞密度的微生物合成是生产大量的工业用酶的唯一的、高效的方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一株毕赤酵母基因重组菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述毕赤酵母基因重组菌在发酵产菊粉内切酶中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌，将SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到pPIC9K中，得到重组质粒，再将重组质粒转化毕赤酵母GS115，既得到产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌。
一种利用毕赤酵母重组菌高密度发酵产菊粉酶的方法，包括如下步骤：
(1)种子液制备：将产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌接种于活化培养基上活化，再转接到BMGY液体培养基中，在28～30℃、200～250r/min条件下培养12～18h，得到种子液；
(2)高密度发酵：将步骤(1)得到的种子液转接到基础培养基中，在发酵罐中培养，发酵条件为：温度28～30℃、搅拌速度800～1000r/min、溶氧量20％～30％、通气量为5～6L/min，控制发酵pH为5.5～6，培养6h之后开始流加补充培养基，每隔12h补加甲醇至终体积浓度为0.5％，培养64～72h。
步骤(1)中，所述活化培养基的配方如下：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。
步骤(1)中，所述BMGY液体培养的配方如下：胰蛋白胨20g/L、酵母浸膏10g/L121℃，灭菌20min后，加入100mmol/L pH＝6的磷酸钾，无氨基氮源13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L。
步骤(2)中，所述基础培养基的配方如下：硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁1g/L、EDTA 3mg/L、硫酸锌1g/L、硫酸亚铁5mg/L、硫酸铜1mg/L、氯化钙1g/L、氯化锰0.5mg/L、氯化钴0.8mg/L、碘化钾0.2mg/L、钼酸钠0.05mg/L、烟酸5mg/L、生物素0.8mg/L、葡萄糖10g/L。
步骤(2)中，所述补充培养基的配方如下：硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁0.05g/L、EDTA 2mg/L、硫酸锌0.08g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸铜0.5mg/L、氯化钙0.5g/L、氯化锰0.3mg/L、氯化钴0.8mg/L、碘化钾0.1mg/L、钼酸钠0.03mg/L、烟酸5mg/L、生物素1mg/L、葡萄糖50g/L、消泡剂0.05ml/L。
有益效果：本发明公开了一株毕赤酵母重组菌，并利用该菌株进行高密度发酵产菊粉酶，得到的内切菊粉酶具有稳定性好、酶活高的特点。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中酶活定义为：反应体系中每分钟产生1微摩尔己糖所需酶量为1个酶活性单位。
活化培养基的配方如下：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。
BMGY液体培养的配方如下：胰蛋白胨20g/L、酵母浸膏10g/L 121℃，灭菌20min后，加入100mmol/L pH＝6的磷酸钾，无氨基氮源13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L。
基础培养基的配方如下：硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁1g/L、EDTA 3mg/L、硫酸锌1g/L、硫酸亚铁5mg/L、硫酸铜1mg/L、氯化钙1g/L、氯化锰0.5mg/L、氯化钴0.8mg/L、碘化钾0.2mg/L、钼酸钠0.05mg/L、烟酸5mg/L、生物素0.8mg/L、葡萄糖10g/L。
培养基的配方如下：硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾10g/L、硫酸镁0.05g/L、EDTA 2mg/L、硫酸锌0.08g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸铜0.5mg/L、氯化钙0.5g/L、氯化锰0.3mg/L、氯化钴0.8mg/L、碘化钾0.1mg/L、钼酸钠0.03mg/L、烟酸5mg/L、生物素1mg/L、葡萄糖50g/L、消泡剂0.05ml/L。
实施例1：内切菊粉酶纯酶酶活检测。
在SEQ ID NO.1所示的内切菊粉酶序列的尾部加上His6序列，然后克隆到pET28a质粒上，转化大肠杆菌DH5α，培养，用镍柱纯化内切菊粉酶，检测纯酶的酶活为25.6U/mL。
实施例2：内切酶的毕赤酵母重组菌的构建。
将SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到pPIC9K中，得到重组质粒，再将重组质粒转化毕赤酵母GS115，既得到产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌。
实施例3：毕赤酵母重组菌高密度发酵产菊粉内切酶。
(1)种子液制备：将产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌接种于活化培养基上活化，再转接到BMGY液体培养基中，在28～30℃、200～250r/min条件下培养12h，得到种子液；
(2)高密度发酵：将步骤(1)得到的种子液转接到基础培养基中，在发酵罐中培养，发酵条件为：温度28～30℃、搅拌速度800r/min、溶氧量20％、通气量为6L/min，控制发酵pH为5.5，培养6h之后开始流加补充培养基，每隔12h补加甲醇至终体积浓度为0.5％，培养72h。
在该发酵条件下，菊粉内切酶的表达量为250mg/L。
实施例4：毕赤酵母重组菌高密度发酵产菊粉内切酶。
(1)种子液制备：将产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌接种于活化培养基上活化，再转接到BMGY液体培养基中，在28～30℃、200r/min条件下培养12h，得到种子液；
(2)高密度发酵：将步骤(1)得到的种子液转接到基础培养基中，在发酵罐中培养，发酵条件为：温度30℃、搅拌速度1000r/min、溶氧量30％、通气量为5L/min，控制发酵pH为6，培养6h之后开始流加补充培养基，每隔12h补加甲醇至终体积浓度为0.5％，培养72h。
在该发酵条件下，菊粉内切酶的表达量为275mg/L。
实施例5：毕赤酵母重组菌高密度发酵产菊粉内切酶。
(1)种子液制备：将产菊粉内切酶的毕赤酵母重组菌接种于活化培养基上活化，再转接到BMGY液体培养基中，在28～30℃、250r/min条件下培养12h，得到种子液；
(2)高密度发酵：将步骤(1)得到的种子液转接到基础培养基中，在发酵罐中培养，发酵条件为：温度28℃、搅拌速度900r/min、溶氧量25％、通气量为6L/min，控制发酵pH为5.8，培养6h之后开始流加补充培养基，每隔12h补加甲醇至终体积浓度为0.5％，培养72h。
在该发酵条件下，菊粉内切酶的表达量为285mg/L。