一种益生菌共生体、培养方法及应用与流程

本发明属于益生菌领域，具体涉及一种益生菌共生体、培养方法及应用。

背景技术：

益生菌(probiotics)是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物，是人体肠道重要的生理细菌，对机体有多种其它正常生理菌群无法比拟的生理作用。其生理作用包括：调整肠道菌群；提高蛋白质和维生素的代谢；防止便秘；产生抗菌素：缓解乳糖不耐症；治疗肝损伤；降低结肠癌的发病率；抗肿瘤；增强免疫系统；降低胆固醇；治疗泌尿系统感染等。肠道菌群的组成对人体营养、免疫、癌症、衰老等有着密切的关系，促进肠道中有益菌的增殖，抑制有害细菌的生长，对于高血压、高血脂、心脏病、糖尿病和癌症等生活习惯病防治方面具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的发明人经过不断实验，从一种传统的乳制品中分离一对天然互惠共生乳酸菌，共生体益生菌sr-19与cr-29，都为革兰氏阳性，兼性厌氧菌，其在相互促进生长方面产生了预料不到的效应，还通过验证过的生产工艺对该共生体益生菌进行高密度发酵，本发明即是基于以上发现而完成。

本发明的第一个方面在于公开一种益生菌共生体，其特征在于，其包括cgmcc编号11870的耐久肠球菌cr-29(enterococcusduranscr-29)和cgmcc编号11869的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌sr-19(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidessr-19)。

优选的，所述益生菌共生体中，耐久肠球菌cr-29与肠膜明串珠菌肠膜亚种菌sr-19的cfu/g比例为1:10-10:1。

进一步优选的，所述益生菌共生体中，耐久肠球菌cr-29与肠膜明串珠菌肠膜亚种菌sr-19的cfu/g比例为5：7。

本发明的第二个方面在于公开一种制备益生菌共生体的培养方法，

采用液体培养基，肠膜明串珠菌肠膜亚种均sr-19与耐久肠球菌cr-29的接种量分别为5％与7％，初始ph6.8；

初始培养温度为44℃(1.0-1.5小时)；中段培养温度为42℃(2.0-2.5小时)，发酵中段为ph5.9；末段培养温度为38℃(1.5-2.0小时)；

振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后添加补充营养物质继续培养，至活菌数不小于1010cfu/ml收获；

培养出的活菌体可通过低温离心分离获得；

所述液体培养基，即工业培养基，的配方为：脱脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，柠檬酸钠2g/l,醋酸钠0.5g/l，ph6.8-7.2；所述补充营养物质的配方为：牛肉膏与胡萝卜原汁2:1体积混合溶液。

本发明的第三个方面在于公开一种益生菌共生体的菌粉，通过以下方法制成：活菌数不小于1010cfu/ml益生菌共生体发酵液经过滤或离心，利用冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制得共生体益生菌菌粉；以上操作均在无菌条件下进行。

本发明的第四个方面在于公开一种耐久肠球菌和/或肠膜明串珠菌肠膜亚种菌益生菌替代剂，用于在食品、食品添加剂、保健食品、人类药品、兽药、动物饲料。

本发明的第五个方面在于公开一种益生菌促生长剂，用于在食品、食品添加剂、保健食品、人类药品、兽药、动物饲料；所述益生菌选自保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌、粪肠球菌的一种或多种。

在一些实施例中，该共生体益生菌的生产过程是通过：接种、复壮、发酵培养、分离、冻干等步骤。具体的，

共生体益生菌肠膜明串珠菌肠膜亚种sr-19与耐久肠球菌cr-29的接种量5％与7％，培养基为：牛奶(羊奶或马奶)、脱脂奶粉、乳清蛋白、维生素k、矿物元素为原料，初始培养温度为44℃(1.0-1.5小时)；中段培养温度为42℃(2.0-2.5小时)；末段培养温度为38℃(1.5-2.0小时)。初始ph6.8，发酵中段为ph5.9，振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后以补料速度6.3m/h补充营养物质(牛肉膏与胡萝卜汁2:1混合溶液)继续培养至收获可使益生菌菌活菌数不小于1010cfu/ml以上。培养出的活菌体可通过低温离心分离(6000r/min)获得，利用海藻酸钠、木糖醇、初乳蛋白(2:1:1)作为冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制的共生体益生菌菌粉。

所述培养基与冻干保护剂配方：

益生菌共生体的培养基详细配方，包括各组分和含量；实验室培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，加蒸馏水至1000ml，ph6.4。

工业化培养基组成为:脱脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，柠檬酸钠2g/l,醋酸钠0.5g/l，ph6.8-7.2。补充营养物质：牛肉膏beefextract与胡萝卜原汁2:1混合溶液按发酵总量的0.8％补充；

培养基121℃湿热灭菌，备用。

冻干保护剂：海藻酸钠50％、木糖醇25％、初乳蛋白25％(2:1:1)作为冻干保护剂按1:10比例与发酵液干物质混合。

本发明涉及的主要仪器及设备：

4℃冰箱sc-276，海尔集团；-86℃冰箱dw-fw3_51，中科美菱低温科技有限公司；电子天平ja2003，上海精密科学仪器有限公司；数显酸度计phs-2_5，上海仪电科学仪器股份有限公司；无菌超净工作台sw-cj一1f，苏净airtech；高压灭菌锅ldzx-30kb，上海三申医疗器械有限公司；恒温培养箱jb202，上海锦屏仪器仪表有限公司；无菌过滤装置250ml，美国nalgene公司；数显恒温水浴锅hh-2，金坛市富华仪器有限公司；hitachiu-2000型紫外可见分光光度计；eppendorftgl-168高速台式离心机；olympusbx50型光学显微镜；olympusbx50型摄像系统；722型分光光度计；厌氧罐(bblgaspark)；olympuspm-20型摄像系统；250m1聚丙烯离心管、(gilson)、涂菌平皿为国产；巴斯德吸管、吸管、微量加样器8道排枪，eppendorf公司。

主要实验材料：耐久肠球菌cr-29，肠膜明串株菌sr-19，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，编号分别为cgmcc编号11870、和cgmcc编号11869。

保加利亚乳杆菌，嗜酸乳杆菌来自长春中俄科技园中俄生物工程与技术联合研发中心；青春双歧杆菌来自俄罗斯莫斯科大学；粪肠球菌f-3由俄罗斯圣彼得堡国立大学基础医学与医疗技术系提供。肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大肠杆菌(escherichiacoli)由吉林大学公共卫生学院提供。

生物材料保藏信息：

耐久肠球菌cr-29，分类命名为耐久肠球菌enterococcusdurans，于2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.11870。

肠膜明串株菌sr-19，分类命名为肠膜明串珠菌肠膜亚种leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides，于2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.11869。

本发明的有益效果是：

1.更安全。不仅是健康个体正常菌群的代表菌，亦可从传统乳制品中提取的。在传统的食用乳制品中，得到长期的实践验证。

2.更容易存活。两种菌种为微量需氧和兼性厌氧菌，相较严格厌氧菌，如：双歧杆菌等更容易在应用中保持活性。

3.更美味。肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)可发酵柠檬酸而产生特异风味物质，其有称为风味菌，香气菌或产香菌。在医药和食品应用中无需添加糖衣或者美味剂，就具有怡人味道。

4.更有效(定殖能力更强)。本产品的主要成分是一对共生体益生菌l.mesenteroides和e.durans分相互间具有促进作用。在体内的定殖能力大大优于以往的任何单一菌种。并且，对每个个体本身存在于体内的有益菌群打造适宜环境，拮抗有害菌群，同时释放对人体健康有益物质：维生素a、b1、b2、b5、b9、b12、c、d、e、有机酸(乳酸,不饱和脂肪酸等)、酶，微量元素(fe、cu、ca、k、mg、p、zn)。从而打破传统治疗人体消化道菌群失调的填补失去的有益菌群方法。特别的服用方法：分别有益生菌胶囊和片剂，胶囊水送入肠，片剂含化或咀嚼，从而最大实现共生体对整体消化道内的活性。

5.应用更广阔。可用于日常保健，医学临床(小儿的上消化道炎)，兽医药，食品工业中。

附图说明：

图1共生体益生菌单一菌体的无细胞上清液对菌落形成的影响

图2益生菌sr-19无细胞上清液对其他益生菌的影响

图3益生菌cr-29无细胞上清液对其他益生菌的影响

图4益生菌共生体sr-19与cr-29混合发酵无细胞上清液对其他益生菌的促生影响

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但足本领域技术人员将会理解，下列实施例仅于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1sr-19和cr-29的互相促生长

通过平板打孔生长圈测定法验证益生菌对其他菌体的影响。

1)益生菌无细胞上清液(free-cellsupernatant)的制备:分别取单一益生菌sr-19、cr-29的培养24h后的菌液，在无菌条件下离心(8000r/min，4℃，20min)。上清液分别经0.45μm微孔滤膜过滤除菌。收集于无菌的4.0mlep管中，4℃冰箱保存备用。

2)实验操作：将耐久肠球菌cr-29与混匀的45℃上层琼脂倒在底层培养基上，凝固后以无菌打孔器打孔(孔径8mm),孔中加入1ml制备好的肠膜明串株菌sr-19无细胞上清液，培养24h，测定菌落的大小与密度。同时，将本实验的研究客体互换，即将肠膜明串株菌sr-19与混匀的45℃上层琼脂倒在底层培养基上，加入耐久肠球菌cr-29的无细胞上清液。并且，测定单一益生菌和益生菌共生体无细胞上清液彼此之间的促进生长作用以及对其他益生菌的影响。将一种菌的无细胞上清液与培养基按1:10混合，接入1％待检菌，厌氧培养24小时，以uv-9100型紫外可见分光光度计测定od600值。待测菌分别为耐久肠球菌cr-29，肠膜明串株菌sr-19，保加利亚乳杆菌，嗜酸乳杆菌，青春双歧杆菌，粪肠球菌f-3。

培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁o.5g，硫酸锰o.25g，琼脂，15g，加蒸馏水至1000ml，ph6.4。

从图1可以看出，无论是肠膜明串株菌sr-19还是耐久肠球菌cr-29，这两株菌的发酵活性代谢物质对彼此具有相互的促进生长的作用。在打孔处加入1ml无细胞上清液的情况下，sr-19菌的菌落个数是空白组的4倍，cr-29菌的菌落个数是空白组的4.5倍。

除了研究益生菌平板固态生长的互惠共生情况，还要了解共生体益生菌在液态发酵过程中彼此影响，以及此益生菌共生体对其他益生菌的生长是否具有促进作用。

测定单一益生菌无细胞上清液彼此之间的促进生长作用以及对其他益生菌的影响。

图2表明sr-19对cr-29的液体培养促生长作用。

实施例2益生菌共生体的作用

比较图2、图3、图4中，sr-19、cr-29、共生体对四种菌的影响，可以看出，共生体的显著促进四种菌的作用，两种菌具有协同作用。

由本实验得出，在液态静止培养下单一益生菌对彼此互为共生的菌株有促生效应，这进一步验证了之前平板打孔生长圈测定法的实验结果。而单一的sr-19或cr-29对其他代表性的肠道益生菌的促进生长的作用不明显；而益生菌共生体的联合发酵上清液对不同的益生菌促生作用很好，至少可刺激一倍以上的扩增，对于青春双歧杆菌促生可达3倍以上。分析原因可能是共生体益生菌的活性代谢物以及有机酸等对益生菌有协同促生的影响。这为该益生菌在肠道内定殖后，促进其他肠道内的原生益生菌的生长提供了实验基础。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。