本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一类吡咯并嘧啶类化合物及其制备方法、含有该类化合物作为活性成分的药物组合物及其在治疗自身免疫疾病药物中的用途。
背景技术
janus激酶是一种细胞质内非跨膜型非受体酪氨酸激酶，含有4个亚型分别是jak1、jak2、jak3、tyk2，其中jak3只在骨髓和淋巴组织中表达，其余3种广泛存在全身组织当中。jak/stat信号转导通路广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节过程，与多种系统疾病关系密切[aringerm，etal,(1999),lifescience,64(24):2173-2186]，例如类风湿关节炎、银屑病、慢性结肠炎、器官移植排斥等免疫疾病，其抑制剂是目前研发热点，有临床研究价值。已经上市和处于临床研究的这类药物主要用于血液系统疾病、肿瘤、类风湿关节炎和银屑病等自身免疫疾病的治疗。
目前，炎症相关的自身免疫性疾病临床使用的传统药物存在作用机制非特异性、药效有限、副作用大等缺点，另一方面生物制剂费用十分昂贵，强效并且价格低廉的小分子药物十分缺乏，因此，临床上需要开发更多疗效、费用及安全方面更佳的药物。fda已经批准了两个jak抑制剂：托法替尼(tofacitinib)和鲁索替尼(ruxolitinib)，分别用于治疗类风湿关节炎和骨髓纤维化的适应症。现有的jak抑制剂存在选择性不高、副作用大等一些问题，所以需要研究新的特异性jak激酶抑制剂改善现状。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于，公开一类新型结构的吡咯并嘧啶类化合物及其药用盐。
本发明的另一个目的在于，公开一类吡咯并嘧啶类化合物及其药用盐的制备方法。
本发明的再一个目的在于，公开以一类吡咯并嘧啶类化合物及其药用盐作为活性成分的药物组合物，及其在制备用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、器官排异反应等自身免疫疾病的药物方面的用途。
本发明具体涉及式ⅰ结构的化合物及其药学上可接受的盐：
其中r为苯基或氰基、硝基、卤素取代的苯基；苯基或卤素、c1-c4的烷氧基单、二取代的c1-c4的烷基、烯基。
本发明涉及通式ⅰ结构中优选的化合物或其药用盐选自：
其中r:
通式ⅰ化合物药学上可接受的盐是指：化合物与无机酸、有机酸成盐。其中优选：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、枸橼酸盐、葡萄糖酸盐、氨基酸盐。
本发明通式ⅰ化合物通过以下步骤合成：
化合物ⅲ与4-取代哌嗪类化合物ⅱ在碱性条件下进行取代反应制备式ⅰ化合物；所述的碱性条件为碱金属的碳酸盐。
式ⅰ化合物可以和各种无机酸或有机酸成盐。
具体方法是将本发明中制备的任一化合物溶于乙醚、dmf、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯或dmso中的一种，于冰水浴下滴加盐酸乙醚至ph＝2，制成盐酸盐；
或将本发明中制备的任一化合物溶于乙醚、dmf、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯或dmso中的一种，加入等摩尔牛磺酸，加热搅拌得其牛磺酸盐；
抑或将本发明中制备的任一化合物溶于乙醚、dmf、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯或dmso中的一种，于冰水浴下滴加浓硫酸至ph＝3，制成硫酸盐等，以上盐不仅限于此。
此类化合物对于治疗人类自身免疫疾病是有效的。尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径(如静脉、肌肉给药)及口服给药。
本发明化合物的药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、颗粒剂、肠溶片、咀嚼片、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份(本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定地加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常，活性化合物的量范围为组合物的0.5％～90％(重量)。另一优选的范围为0.5％-70％。
本发明的具有式ⅰ结构的化合物或其药学上可接受的盐，其药效实验采用mtt法测定目标化合物对jak3激酶依赖细胞daudi及jak3激酶非依赖细胞bt-20的抑制活性。
jak3激酶在人白血病细胞daudi中高表达，其抑制剂将影响jak3对daudi细胞的活化，进而影响细胞增殖、分化、凋亡等过程；人乳腺癌细胞bt-20是jak3激酶非依赖细胞株，jak3激酶抑制剂对bt-20细胞不具有抑制作用。本专利申请涉及的新化合物对daudi细胞的活性抑制测定为实验组1；对bt-20细胞的抑制测定为实验组2。
细胞：人白血病细胞daudi(b-allcell，急性b细胞型淋巴细胞性白血病细胞)、人乳腺癌细胞bt-20购自中国医学科学院基础医学研究所。
试剂：胎牛血清(fbs)(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；mem、1640培养基(
仪器：超净工作台(苏州净化设备厂)；rt6100型酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。
样品准备：所有新化合物纯度满足细胞实验的要求，精密称取各样品，溶于定量dmso，置于超声波仪中5min，使样品充分溶解，配制成20mmol/l的溶液。精确吸取上述样品液10μl，加入90μldmso、900μl无血清培养基，稀释成200μmol/l，备用。
实验方法：
取对数生长期细胞悬浮于培养基中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液，显微镜下血细胞计数板计数活细胞。96孔板每孔接种细胞悬液180μl(细胞浓度为10000个细胞/孔)，在37℃、100％相对湿度、含5％co2的培养箱预培养24小时后，离心，小心析出培养基，换成没有血清的培养基，并在每孔中加20μl样品溶液。并设阴性对照(等浓度dmso)及空白本底(不加细胞)，各组均设3个复孔。再连续培养48小时，然后用mts法测定。每孔加入20μl的mts溶液，继续培养30min后，于酶标仪490nm单波长比色，测定od值。
计算细胞生长抑制率作为评价指标。抑制率(％)＝[1-(实验组od均值-空白组od均值)/(对照组od均值-空白组od均值)]×100％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。所述的化合物经高效液相色谱(hplc)，薄层色谱(tlc)进行检测。随后采用核磁共振谱(1hnmr，13cnmr)，高分辨质谱(hrms)等更进一步确证其结构。
实施例1：在装有温度计、搅拌装置的反应瓶中加入4-(4-硝基苯基)哌嗪(20.7g，0.1mol)、4-氯-吡咯并[2,3-d]嘧啶(15.3g，0.1mmol)、k2co3(32g)和dmf(300ml)，70℃反应6h，tlc显示反应完全，将反应液倒入500ml冷水中，乙酸乙酯萃取，萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除有机溶剂，柱层析分离得到化合物ⅰ-1。收率66.5％.
1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ：3.70(t,j＝5.2hz,4h),4.07(d,j＝5.2hz,4h),6.63(t,j＝1.6hz,1h),7.00(d,j＝9.2hz,2h),7.20(t,j＝2.8hz,1h),8.09(d,j＝9.2hz,2h),8.17(s,1h),11.71(s,1h).hrmsm/z,[m+h]+325.1410。
实施例2：参照实施例1的方法，以4-(2-氰基苯基)哌嗪为原料合成ⅰ-2，收率59.1％，
1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ：3.30(t,j＝4.8hz,5h),4.06(t,j＝4.8hz,4h),6.67(q,j＝1.6hz,1h),7.12(t,j＝7.2hz,1h),7.19-7.21(m,2h),7.59-7.63(m,1h),7.73(dd,j1＝1.2hz,j2＝7.6hz,1h),8.18(s,1h),11.72(s,1h).hrmsm/z，[m+h]+305.1512。
实施例3—实施例6：参照实施例1的方法，以相应的取代哌嗪为原料合成ⅰ-3—ⅰ-6.
表1ⅰ-3-ⅰ-6系列化合物结构及表征数据
实施例7：制备化合物ⅰ-1盐酸盐：取5.0g化合物ⅰ-1，加入100ml无水乙醇，冰水浴冷却至0℃，滴加盐酸乙醇溶液至ph为2，继续于冰水浴下搅拌约1h。过滤，真空干燥，得白色固体粉末。
实施例8：制备化合物ⅰ-2马来酸盐：取2.0g化合物ⅰ-2，溶于80ml无水甲醇。加热至回流后加入等摩尔马来酸，继续于回流下搅拌反应30分钟。室温下静置24h，析出白色固体，过滤，真空干燥，得白色固体粉末。
为了更充分地说明本发明的化合物的药物组合物，下面提供下列制剂实施例，所述实施例仅用于说明，而不是用于限制本发明的范围。所述制剂可以使用本发明化合物中的任何化合物及其盐作为活性成分。
实施例9：
用下述成分制备硬明胶胶囊：
用量/囊
化合物ⅰ-135mg
干淀粉500mg
硬脂酸镁30mg
制备工艺：将原辅料预先干燥，过100目筛备用。按处方量将上述成分混合后，填充入硬明胶胶囊中。
实施例10：
用下述成分制备片剂：
制备工艺：将原辅料预先干燥，过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中，每次加时充分混匀2－3次，保证药与辅料充分混匀，过20目筛，在55℃通风烘箱中干燥2h，干颗粒过16目筛整粒，测定中间体含量，混合均匀，在压片机上压片。
本发明涉及通式ⅰ部分化合物生物活性测试结果(见表2：对daudi细胞和bt-20细胞活性抑制作用)：
表2化合物对细胞的抑制率(％)