本发明涉及一种微流控芯片、其制备方法及应用，尤其涉及一种可用于特异性捕获胎儿有核红细胞的微流控芯片及其制备方法，以及其在胎儿有核红细胞捕获和单细胞释放中的应用，属于分子细胞生物学检测技术领域。
背景技术
孕妇外周血中胎儿有核红细胞(fnrbc)是指通过胎盘屏障进入母亲体循环中的胎儿细胞。正常成人的外周血中不存在有核红细胞,因此在排除血液系统疾病后,孕妇外周血中发现的有核红细胞应来自胎儿。胎儿有核红细胞在孕期中持续存在于母血中，寿命一般小于90天，因此不受既往妊娠影响。同时胎儿有核红细胞可通过细胞表面的特殊抗原及血红蛋白反应进行鉴定，属于有核细胞，因而可提供高纯度和完整的胎儿基因组，是检查和分析胎儿遗传病的理想的遗传物质的来源。因此胎儿有核红细胞具有重大的生物学意义和临床价值，进而从血液中检测胎儿有核红细胞越来越引起人们的重视。但是，由于外周血中胎儿细胞数量稀少，每毫升孕妇外周血中仅有1-10个胎儿有核红细胞，而血中的其他细胞可达到109个以上，其中有核细胞可达到106个以上，同时白细胞直径约为7-20μm，有核红细胞直径约为10-20μm，且形态相差不大，因此在巨大的背景细胞干扰下，无法对如此微量的胎儿有核红细胞直接进行有效的检测和分析。
近年来，相关研发人员为了将胎儿有核红细胞有效的富集和分离出来进行胎儿遗传病检查，已陆续发展了包括密度梯度离心(densitygradientcentrifuge)、荧光激活流式细胞分离技术(facs)以及磁性激活细胞分选(macs)等方法。但这些方法普遍存在富集效率低、分离纯度不够、操作复杂和费用昂贵等问题，因而限制了其在临床上的广泛应用。
密度梯度离心法是利用细胞密度的差异分离孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，如以聚蔗糖-泛影葡胺作为分离介质，用三重密度梯度离心法能把血细胞分为4层，其中第二层细胞中主要含有胎儿有核红细胞，但其所占比例较小；又如以percoll作为分离介质，采用不连续密度梯度离心法对孕妇外周血离心，有核细胞层位于1.075～1.085g/ml。密度梯度离心法操作方法简便，适合推广到临床，但该层中仍有大量的母源细胞，因此一般需要结合其他方法进行进一步分离纯化。
荧光激活流式细胞分离技术是将通过特异性荧光抗体标记后的混合细胞样品流过毛细管，同时对单个细胞所发出的散射光和荧光等多种参数进行采样，将特定的细胞通过细胞分选器从其他细胞中分离出来。这种方法的富集分离纯度相对密度梯度离心法高，但使用的设备价格昂贵，操作步骤较复杂，需专业人员进行，而且细胞用量大，难以在实验室和医院推广普及。
磁性激活细胞分选技术是用标记了磁性颗粒的单克隆抗体与特定细胞表面的抗原反应后，在外加磁场的作用下，可将样品中结合了磁性颗粒的细胞与其它不带磁性颗粒的细胞分开，以达到分离纯化的目的。
无论荧光激活流式细胞分离技术还是磁性激活细胞分选技术都需要首先利用特异性抗体识别特定细胞表面的抗原，然后再进行筛选。而利用荧光抗体或者磁性颗粒标记的抗体在巨大的背景细胞下，结合数量稀少和浓度极低的胎儿有核红细胞无异于大海捞针，效率低下。
近年来，微流控技术的发展为胎儿有核红细胞的分离提供了新的方法，其是通过在微米至毫米尺度上制造与分离样品尺度相比拟的微流道和微结构，充分利用尺度效应实现样品的分离。微流控芯片具有分离效率高、分析速度快、分离模式多以及应用范围广等特点。例如，文献1利用级联两个微流控芯片，通过确定性侧向位移(deterministiclateraldisplacement)芯片将较大的有核细胞(如：胎儿有核红细胞、白细胞等)从较小的红细胞中分离出来，再通过基于磁场分离的血红蛋白富集芯片将胎儿有核红细胞从其他有核细胞中分离富集，可以将捕获效率提高10倍以上，从每毫升血中捕获数十个胎儿有核红细胞。尽管通过两级微流控芯片可以除去约99.99％的红细胞和99.90至99.99％的白细胞，但富集的样品中仍有5000000的红细胞和8000至8000000的白细胞，还会影响下游检测和分析。
又如，文献2利用红细胞超聚集(hyperaggregation)和红细胞裂解方法除去红细胞，再通过微磁铁阵列富集胎儿有核红细胞，同样可从每毫升血中捕获数十至数百个胎儿有核红细胞，但纯度仍可能低至20％，对胎儿遗传病的检测和分析造成障碍。
文献1：“amicrofluidicsapproachfortheisolationofnucleatedredbloodcells(nrbcs)fromtheperipheralbloodofpregnantwomen”.prenataldiagnosis,v28(2008),p892-899。
文献2：“isolationofnucleatedredbloodcellsinmaternalbloodfornon-invasiveprenataldiagnosis”.biomedicalmicrodevices,v17(2015):118。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种微流控芯片、其制法及胎儿有核红细胞捕获与释放方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种微流控芯片，包含微流道以及能与靶标物质特异性结合的捕捉物质；所述捕捉物质经连接臂固定于所述微流道内，所述连接臂包含至少一个可被光切割的位点，并且当其中一个以上可被光切割的位点被选定波长的光切割后，所述连接臂将完全断裂。
在一些具体实施方案中，所述微流控芯片包含：至少可使胎儿有核红细胞通过的微流道，以及，能与胎儿有核红细胞特异性结合的捕捉物质；所述捕捉物质经连接臂固定于所述微流道内，所述连接臂包含至少一个可被光切割的位点，并且当其中一个以上可被光切割的位点被选定波长的光切割后，所述连接臂将完全断裂。
在一些较佳实施方案中，所述连接臂采用包含至少一个可被选定波长的光照射而降解的基团的分子，其中每一个所述的基团构成一个所述的可被光切割的位点。
优选的，所述选定波长的光为紫外光或可见光。
本发明实施例还提供了一种制备所述微流控芯片的方法，其包括：
于第一基片上加工形成与所述微流道相对应的第一微结构部，再将第一基片与第二基片固定结合，形成包含有所述微流道的微流控芯片，
或者，提供具有第一设定结构的第一模具，并利用所述第一模具加工形成包含与所述微流道相对应的第一微结构部的第一基片，再将第一基片与第二基片固定结合，形成包含有所述微流道的微流控芯片，
所述第二基片具有平整表面或具有能与第一微结构部配合形成所述微流道的第二微结构部；
以及，通过所述连接臂将所述捕捉物质固定在所述微流道内。
在一些较佳实施方案中，所述的制备方法包括：采用包含可被选定波长的光(例如紫外光或可见光)切割的基团的分子作为连接臂将所述捕捉物质固定连接于所述微流道内。
本发明实施例提还供了一种胎儿有核红细胞的捕获方法，主要是基于所述的微流控芯片实施的，其包括：将包含有作为靶标物质的胎儿有核红细胞的流体输入所述微流控芯片，使所述流体从所述微流道内通过，并使所述流体与固定于所述微流道内的捕捉物质充分接触，从而捕获所述流体内的胎儿有核红细胞。
本发明实施例还提供了一种胎儿有核红细胞的单细胞释放方法，其包括：
以前述的任一种方法捕获胎儿有核红细胞；
以选定波长的光选择性切割至少一个用以将捕获有胎儿有核红细胞的捕捉物质固定于微流道内的连接臂，使至少一个被捕获的胎儿有核红细胞被释放。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1.本发明的微流控芯片是基于微流控系统的高效率和高纯度的胎儿有核红细胞捕获芯片，其微流道和/或微结构的特征尺度为胎儿有核红细胞尺度相比拟，为胎儿有核红细胞数倍，数十倍，数百倍，通过物理尺度限制，增强细胞与沟道表面固定抗体的有效接触，实现亲和力与流体剪切力之间的平衡，以提高捕获效率，降低其他细胞的非特异性吸附。
2.本发明的微流控芯片的制备工艺简单，制造成本低，可直接大规模制造，可以从材料和加工工艺流程两方面保证低成本。
3.籍由本发明的微流控芯片，可以在孕早期和孕中期从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞，并且还可利用紫外光等对连接臂分子进行光切割，从而在单细胞水平上选择性的释放被捕获的细胞，实现高效率和高纯度的分离，进一步提高纯度，用于下游分子生物学分析和遗传病检测。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供的一种微流控芯片包含可使胎儿有核红细胞等靶标物质通过的微流道，并且所述微流道内还固定有能与靶标物质特异性结合的捕捉物质，用以捕获流经所述微流道的胎儿有核红细胞。
进一步的，所述捕捉物质经连接臂固定于所述微流道内，所述连接臂包含至少一个可被光切割的位点，并且当其中一个以上可被光切割的位点被选定波长的光切割后，所述连接臂将完全断裂。
更进一步的，所述连接臂采用包含至少一个可被选定波长的光照射而降解的基团的分子，其中每一个所述的基团构成一个所述的可被光切割的位点。
前述的“基团”系指可以在选定波长的光照下发生降解而导致所述连接臂分子的分子链断裂的基团，典型的此类基团可以有1-(2-硝基苯基)乙基(1-(2-nitrophenyl)ethyl)等，这些基团可以来源于4-{4-[1-(9-芴甲氧羰酰胺基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基}丁酸(4-{4-[1-(9-fluorenylmethyloxycarbonylamino)ethyl]-2-methoxy-5-nitrophenoxy}butanoicacid，fmoc-photo-linker)、可被光切割的生物素(photocleavablebiotin(nhs-pc-biotin))等物质。换言之，所述的连接臂可以选用此类会因可见光或紫外光等照射而导致分子链断裂的分子。
进一步的，所述选定波长的光为紫外光或可见光。
优选的，所述选定波长的光的波长为300nm～450nm。
优选的，所述连接臂包含两个以上所述的基团。
尤其优选的，所述连接臂包含串联设置的两个以上所述的基团，并且当其中任意一个所述的基团被选定波长的光照射降解后，所述连接臂将完全断裂，如此设计可以进一步提升切割的效率。
进一步的，所述微流道的宽度为20μm～5mm，尤其优选为20μm或30μm或50μm或100μm或300μm或500μm或1mm或5mm。
较为优选的，所述微流道为曲线形，籍以使流体能在微流道中能更为充分的与微流道内壁接触，以及利于实现对流体流速的控制。
当然，所述微流道也可以是直线形的。
当样品中的细胞在微量注射泵或恒压泵或其他进样装置的作用下，流过微流道时，与沟道表面固定抗体的接触，实现高效率捕获，通过调节流速，实现抗体亲和力与流体剪切力之间的平衡，降低其他细胞的非特异性吸附，提高捕获纯度。
在一些实施方案中，所述微流道内壁上通过所述连接臂固定有所述捕捉物质。
在一些实施方案中，所述微流道内还分布有两个以上微结构，且相邻微结构之间的距离足以使胎儿有核红细胞通过，至少一所述微结构上还通过所述连接臂固定有所述捕捉物质。
进一步的，所述微流道和/或微结构的尺寸不小于胎儿有核红细胞的尺寸。
较为优选的，相邻微结构之间的距离为20μm～5mm，尤其优选为20μm、30μm、50μm、100μm、300μm、500μm、1mm或5mm。
在一些实施方案中，所述微结构为微柱或微坝结构，但不限于此。当样品中的细胞在微量注射泵或恒压泵或其他进样装置的作用下，流过微结构时，与其表面固定抗体的接触，实现高效率捕获，通过优化微结构和调节流速，实现抗体亲和力与流体剪切力之间的平衡，降低其他细胞的非特异性吸附，提高捕获纯度。
进一步的，所述捕获分子包括特异性捕获抗体、特异性多肽、核酸适配体中的一种或两种以上的组合。
更为优选的，所述特异性捕获抗体包括cd71抗体、cd45抗体、cd36或其他胎儿有核红细胞的特异性抗体。
本发明实施例的另一个方面提供了一种制备所述微流控芯片的方法，其包括：
于第一基片上加工形成与微流道相对应的第一微结构部，再将第一基片与第二基片固定结合，形成包含有微流道的微流控芯片，
或者，提供具有第一设定结构的第一模具，并利用所述第一模具加工形成包含与微流道相对应的第一微结构部的第一基片，再将第一基片与第二基片固定结合，形成包含有微流道的微流控芯片，
其中，所述微流道足以使胎儿有核红细胞通过，
所述第二基片具有平整表面或具有能与第一微结构部配合形成所述微流道的第二微结构部；
以及，在所述微流道内通过所述连接臂固定能与胎儿有核红细胞特异性结合的捕捉物质，用以捕获流经所述微流道的胎儿有核红细胞。
在一些实施方案中，所述的制备方法包括：于第二基片上加工形成与第一微结构部配合的第二微结构部。
在一些实施方案中，所述的制备方法包括：提供具有第二设定结构的第二模具，并利用所述第二模具加工形成包含与微流道相对应的第二微结构部的第二基片。
较为优选的，所述微流道内还分布有两个以上微结构，且相邻微结构之间的距离足以使胎儿有核红细胞通过，以及，至少一所述微结构上还通过所述连接臂固定有所述捕捉物质。
在一些实施方案中，所述的制备方法包括：将第一基片与第二基片键合形成所述微流控芯片，所述键合方法包括热键合，溶剂辅助键合，溶剂辅助热键合，双面压敏胶键合以及共价键合方式中的任意一种。
在一些较佳实施方案中，所述的制备方法还可包括：采用在选定波长的光(例如紫外光或可见光)照射下会发生分子链断裂的分子作为连接臂将所述捕捉物质固定于所述微流道内，特别是固定于所述微流道的内壁上和/或所述微结构上。
在一些实施方案中，所述微流控芯片可以用塑料材料制造，塑料不仅自身成本低，而且直接用大规模制造技术，如注塑等来加工制造微流控芯片，这样可以从材料和加工工艺流程两方面保证低成本、即抛式微流控芯片的生产。
在一些实施方案中，所述微流控芯片的制备工艺可以包括：通过光刻技术在硅片或玻璃表面制作掩模，掩模包括但不限于正胶、负胶、二氧化硅、金属膜或其他可以复制转移微结构图案的材料，通过深硅刻蚀工艺或干法玻璃刻蚀工艺制备指定高度/深度的阳模，再用镀膜工艺沉积纳米至微米的种子层后，所述镀膜工艺包括但不限于电子束蒸发、磁控溅射、热蒸发等，再通过电铸工艺制造金属阴模，金属阴模包括但不限于镍、铜等，最后通过热压模或者注塑工艺可以低成本的批量制造微流道和微结构。
在一些实施方案中，所述微流控芯片的制备工艺可以包括：通过光刻技术在硅片或者玻璃表面直接用微米至毫米厚度的正胶或负胶制备阳模，再用镀膜工艺沉积纳米至微米的种子层后，所述镀膜工艺包括但不限于电子束蒸发、磁控溅射、热蒸发等，再通过电铸工艺制造金属阴模，金属阴模包括但不限于镍、铜等，最后通过热压模或者注塑工艺可以低成本的批量制造微流道和微结构。
在一些实施方案中，所述微流控芯片的制备工艺可以包括：通过高精度铣床在铜或其他金属材料表面加工微结构，作为热压模或者注塑工艺的阴模，低成本的批量制造微流道和微结构，或者通过激光或数控机床直接在塑料表面加工微流道和微结构。
其中，所述微流控芯片采用塑料或聚二甲基硅氧烷(pdms)等制备，但不限于此。
进一步的，在一些实施方案中，表面加工有微流道和微结构的塑料片与另一块表面有或没有微流道和微结构的塑料片或聚二甲基硅氧烷片或玻璃片键合，封装微流控芯片。另一块pdms或玻璃表面可以没有微流道和微结构，也可以通过以上描述的方法加工微流道和微结构。当两块基片都有微结构时，需要借助对准工具，如光学显微镜，进行微流控芯片封装。所述塑料片键合方法包括但不限于热键合，溶剂辅助键合，溶剂辅助热键合以及双面压敏胶键合等。其中，热键合要求两块键合材料的玻璃化温度接近，如玻璃化温度差小于10摄氏度。
进一步的，在一些实施方案中，也可以用聚二甲基硅氧烷(pdms)制造所述微流控芯片。通过光刻技术在硅片或者玻璃表面直接用微米至毫米厚度的正胶或负胶制备阴模，再将二甲基硅氧烷单体和引发剂按指定比例混合，除气泡后，浇注在阴模上得到微流道和微结构。pdms与另一块pdms或者pdms与玻璃之间经过等离子清洗激活后，可以不可逆的共价键合，封装微流控芯片。另一块pdms或玻璃表面可以没有微流道和微结构，也可以通过以上描述的方法加工微流道和微结构。当两块基片都有微结构时，需要借助对准工具，如光学显微镜，进行微流控芯片封装。
在一些实施方案中，所述微流控芯片的制备工艺可以包括：在硅片或玻璃表面，用光刻和干法刻蚀，制备微流道和微结构，玻璃和另一块玻璃以及玻璃和硅片之间通过键合方法封装后，制造微流控芯片。所述键合方法包括但不限于热键合、阳极键合等。一般其中一块基片须为透明材料，如玻璃，以保证光学和荧光成像检测；另一块玻璃表面可以没有微流道和微结构，也可以通过以上描述的方法加工微流道和微结构。同样的，当两块基片都有微结构时，需要借助对准工具(如光学显微镜等)进行微流控芯片封装。
前述制备工艺中的操作及工艺条件等均可以参照业界已知的方案实施，例如可参考文献3：《微流控芯片实验室》(林炳承，秦建华著，出版社：科学出版社；出版日期：2006-7-1；isbn：9787030171603)；文献4：微流控芯片的材料与加工方法研究进展，《传感器与微系统》2011年06期；文献5：《微流控分析芯片的制作及应用》，化学工业出版社，2005年6月13日出版，isbn:7502570292,9787502570293。
本发明实施例的一个方面还提供了一种胎儿有核红细胞的捕获方法，主要是基于所述的微流控芯片实施的，其包括：
将包含有胎儿有核红细胞的流体输入所述微流控芯片，使所述流体从所述微流道内通过，并使所述流体与固定于所述微流道内的捕捉物质充分接触，从而捕获所述流体内的胎儿有核红细胞。
较为优选的，所述的捕获方法还可包括：使所述流体按照设定流速从所述微流道内通过，在该设定流速下，所述流体作用于胎儿有核红细胞上的剪切力小于所述捕捉物质与胎儿有核红细胞的结合力，但大于或等于所述捕捉物质与其它细胞的结合力，所述的其它细胞是不能与所述捕捉物质特异性结合的细胞(例如红细胞、白细胞等)。
在一些实施方案中，所述的捕获方法还可包括：在将所述流体输入所述微流控芯片之前，还对所述流体进行预处理而使胎儿有核红细胞富集，其中采用的预处理方法包括密度梯度离心、荧光激活流式细胞分离以及磁性激活细胞分选方式中的至少一种。
例如，在所述预处理方法中，基于胎儿有核红细胞比一般红细胞大，与白细胞有相当的尺度区别，可发展基于大小的分离方法，分离红细胞和胎儿有核红细胞，而使胎儿有核红细胞富集；又如，基于胎儿有核红细胞与红细胞一样富含铁，可在一定条件下转化为具备顺磁性的颗粒，利用磁场将红细胞(包括红细胞和胎儿有核红细胞)从外周血中的其他细胞中分离富集；又如，基于胎儿有核红细胞表面具有特异抗原，如cd71、cd36等，可以通过亲和反应将胎儿有核红细胞特异性的捕获在微结构或磁珠表面；同时，cd71和cd36等抗体也可用于对胎儿有核红细胞的进行免疫荧光鉴定。也可以将多种分离和富集方法级联在一起，实现高效率和高纯度的分离。
本发明实施例的一个方面还提供了一种胎儿有核红细胞的单细胞释放方法，其包括：
以前述的任一种方法捕获胎儿有核红细胞；
以选定波长的光选择性的切断至少一个用以将捕获有胎儿有核红细胞的捕捉物质固定于微流道内的连接臂，使至少一个被捕获的胎儿有核红细胞被释放。
在一些实施方案中，可以对所述微流控芯片捕获的细胞进行鉴定后，再对所述连接臂进行定点切割。
所述鉴定的方法包括但不限于免疫荧光染色、荧光原位杂交(fish)等。其中，所述免疫荧光染色鉴定包括正鉴定和负鉴定。
所述正鉴定可通过捕获分子不同的抗体免疫荧光染色鉴定，如当使用鼠抗人cd71抗体捕获时，可用荧光标记的兔抗人cd71抗体，或者cd36抗体，或者cd235a抗体,或者丙种球蛋白抗体，或者荧光标记的特异性多肽进行免疫荧光染色鉴定，也可用荧光标记的核酸适配体进行鉴定。
所述负鉴定可通过荧光标记的白细胞特异性抗体，包括但不限于cd45，对微流道和微结构表面的细胞进行免疫荧光染色鉴定，被荧光抗体染色被鉴定为白细胞，而未被染色的细胞则被鉴定为胎儿有核红细胞。
进一步的，通过前述鉴定后，利用紫外光或可见光等对连接臂分子进行光切割，从而在单细胞水平上选择性释放被鉴定为胎儿有核红细胞的细胞，之后可以对被释放的细胞进行单细胞分析，也可以收集被释放的部分细胞或者所有细胞进行分析。下游分子生物学分析和遗传病检测方法包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)，定量pcr，荧光原位杂交，sanger测序，第二代测序等。
以下将结合若干较为典型的施力对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：
参考文献3-文献5，制备基于玻璃-pdms(聚二甲基硅氧烷)的微流控芯片，其中微流道阵列为50条宽度为30μm，深度为150μm，长度为20mm，呈正弦曲线的微流道组成，微流道阵列并行分布在两条1.5mm宽的主流道之间，呈z字型分布。之后，利用等离子清洗激活所述微流控芯片中的玻璃和pdms表面，然后键合，再用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)修饰微流道表面，连接可被光切割的生物素(photocleavablebiotin(nhs-pc-biotin))后，依次连接链霉亲和素及生物素化的cd71抗体，用于捕获分离胎儿有核红细胞。
该过程具体如下：将100μl2％的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)的乙醇(95％)溶液以20μl/min的流速流过微流道15min，然后用无水乙醇50μl/min的流速流过微流道5min清洗后，置于110℃10min固化。然后将50μl1mm可被光切割的生物素(nhs-pc-biotin)和1mmn,n-二异丙基乙胺(diea)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液注入沟道2h，先后用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)和250μl去离子水清洗微流道。将100μl10μg/ml中性亲和素(neutravidin)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液清洗微流道后,将100μl的10μg/ml生物素化的cd71抗体(biotinylatedcd71antibody)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道,室温反应2h后，取用250μl的0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液，250μl磷酸缓冲液(pbs)清洗微流道后,注满磷酸缓冲液(pbs)保存在4℃冰箱待用。
实施例2：
参考文献3-文献5，制备基于玻璃-pdms(聚二甲基硅氧烷)的微流控芯片，其中微流道阵列为16条的宽度为200μm，深度为100μm，长度为20mm，呈直线形的微流道组成，从入口和出口处分别经过5次二分成为16条微流道，且微流道中还分布有多根微柱，微柱的高度100μm，直径20μm，相邻微柱的距离20μm。
之后利用等离子清洗激活玻璃-pdms表面，用氨基硅烷aptes修饰微流道表面，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)连接4-{4-[1-(9-芴甲氧羰酰胺基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基}丁酸(fmoc-photo-linker，(4-{4-[1-(9-fluorenylmethyloxycarbonylamino)ethyl]-2-methoxy-5-nitrophenoxy}butanoicacid))后，依次连接nhs-biotin,链霉亲和素及生物素化的cd71抗体，用于捕获分离胎儿有核红细胞。
该过程具体如下：
将100μl2％的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)的乙醇(95％)溶液以20μl/min的流速流过微流道15min，然后用无水乙醇50μl/min的流速流过微流道5min清洗后，置于110℃10min固化。然后将100μl50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和10mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的溶于50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)，将溶液注入沟道30min后，用50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)清洗5min。然后将100μl5mm4-{4-[1-(9-芴甲氧羰酰胺基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基}丁酸、10mm苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐(benzotriazol-l-yloxytrisdimethylaminophosphoniμmhexafluorophosphate(bop))，10mm1-羟基苯并三唑一水物(1-hydroxybenzotriazole(hobt))和10mmn,n-二异丙基乙胺(n,n-diisopropylethylamine(diea))溶于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，注入微流道4h后,用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)清洗微流道。然后将50μl1mmn-羟基琥珀酰亚胺-生物素(nhs-biotin)和1mmn,n-二异丙基乙胺(diea)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液注入沟道2h，先后用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)和250μl去离子水清洗微流道。将100μl的10μg/ml链霉亲和素(streptavidin)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入微流道2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液清洗微流道后,将100μl10μg/ml生物素化的cd71抗体的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道,室温反应2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(+pbs)溶液，250μl磷酸缓冲液(pbs)清洗微流道后,注满磷酸缓冲液(pbs)保存在4℃冰箱待用。
在本实施例中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)也可用其他可以偶联氨基和羧基的试剂代替。
实施例3：
参考文献3-文献5，制备基于玻璃-pdms(聚二甲基硅氧烷)的微流控芯片，其中微流道的宽度为500μm，深度为100μm，长度为30mm，呈直线形，且微流道中还分布有多个微坝，微坝为方柱，高度为100μm，截面边长为20μm，相邻微坝的距离20μm。
之后利用等离子清洗激活玻璃-pdms表面，用氨基硅烷aptes修饰微流道表面，通过edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)连接fmoc-photo-linker后，依次连接可被光切割的生物素(nhs-pc-biotin)、链霉亲和素及生物素化的cd71抗体，用于捕获分离胎儿有核红细胞。
该过程具体如下：
将100μl2％的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)的乙醇(95％)溶液以20μl/min的流速流过微流道15min，然后用无水乙醇50μl/min的流速流过微流道5min清洗后，置于110℃10min固化。然后将100μl50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和10mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的溶于50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)，将溶液注入沟道30min后，用200μl50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)清洗5min。然后将100μl5mm4-{4-[1-(9-芴甲氧羰酰胺基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基}丁酸(fmoc-photo-linke),10mm苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐(bop),10mm1-羟基苯并三唑一水物(hobt)和10mmn,n-二异丙基乙胺(diea)溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，注入微流道4h后，用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)清洗微流道。然后将50μl1mm可被光切割的生物素(nhs-pc-biotin)和1mmn,n-二异丙基乙胺(diea)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液注入沟道2h，先后用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)和250μl去离子水清洗微流道。将100μl10μg/ml链霉亲和素(streptavidin)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入微流道2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液清洗微流道后,将100μl10μg/ml生物素化的cd71抗体的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道，室温反应2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(+pbs)溶液，250μl磷酸缓冲液(pbs)清洗微流道后,注满磷酸缓冲液(pbs)保存在4℃冰箱待用。
本实施例将两种可被光切割分子同时用于表面修饰，只要其中一个被紫外光切割，就可以释放相应的抗体，可以提高光切割释放的效率，并缩短光切割释放所需的时间。
实施例4：
参考文献3-文献5，制备基于塑料的微流控芯片，所述塑料包括但不限于pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、pc(聚乙烯)和coc(聚烯烃)等，其中微流道阵列为50条宽度为25μm，深度为75μm，长度为20mm，呈圆弧形的微流道组成,微流道阵列并行分布在两条1.5mm宽的主流道之间，呈z字型分布。之后用等离子清洗激活塑料表面，热键合形成微流道，通过edc/nhs连接可被光切割的生物素(photocleavablebiotin(nhs-pc-biotin))后，依次连接链霉亲和素及生物素化的cd71抗体，用于捕获分离胎儿有核红细胞。
该过程具体如下：
将100μl50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和10mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的溶于50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)，将溶液注入微流道30min后，用250μl50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)清洗5min。然后将50μl1mm可被光切割的生物素(nhs-pc-biotin)和1mmn,n-二异丙基乙胺(diea)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液注入沟道2h，先后用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)和250μl去离子水清洗微流道。将100μl10μg/ml中性亲和素(neutravidin)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液清洗微流道后,将100μl10μg/ml生物素化的cd71抗体(biotinylatedcd71antibody)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道,室温反应2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液，250μl磷酸缓冲液(pbs)清洗微流道后,注满磷酸缓冲液(pbs)保存在4℃冰箱待用。
实施例5：参考文献5，制备基于塑料的微流控芯片，所述塑料包括但不限于pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、pc(聚乙烯)和coc(聚烯烃)等，其中微流道阵列为64条，宽度为20μm，深度为50μm，长度为10mm，呈s形曲线微流道组成,从入口和出口处分别经过7次二分成为64条微流道。
之后用等离子清洗激活塑料表面，通过edc/nhs连接二乙胺，再通过edc/nhs连接，连接fmoc-photo-linker后，依次连接nhs-biotin、链霉亲和素及生物素化的cd71抗体，用于捕获分离胎儿有核红细胞。其中，edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)也可用其他可以偶联氨基和羧基的试剂代替。
该过程具体如下：将100μl50mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和10mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的溶于50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)，将溶液注入微流道30min后，用250μl50mm的2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液(mes)(ph＝4.5)清洗5min。然后将100μl5mm4-{4-[1-(9-芴甲氧羰酰胺基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基}丁酸(fmoc-photo-linker)，10mm苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐(bop),10mm1-羟基苯并三唑一水物(hobt)和10mmn,n-二异丙基乙胺(diea)溶于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，注入微流道4h后,用250μln，n-二甲基甲酰胺(dmf)清洗微流道。然后将50μl1mm可被光切割的生物素(nhs-pc-biotin)和1mmn,n-二异丙基乙胺(diea)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液注入沟道2h，先后用250μln,n-二甲基甲酰胺(dmf)和250μl去离子水清洗微流道。将100μl10μg/ml链霉亲和素(streptavidin)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入微流道2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(pbs)溶液清洗微流道后,将100μl10μg/ml生物素化的cd71抗体(biotinylatedcd71antibody)的磷酸缓冲液(pbs)溶液注入沟道,室温反应2h后，取用250μl0.1％吐温-20(tween-20)的磷酸缓冲液(+pbs)溶液，250μl磷酸缓冲液(pbs)清洗微流道后,注满磷酸缓冲液(pbs)保存在4℃冰箱待用。
需要说明的是，前述实施例采用nhs-pc-biotin和fmoc-photo-linker等以1-2(硝基苯基)-乙基(1-2(nitrophenyl)-ethyl)为紫外切割基团的分子及其组合连接作为光切割手臂，但也可以用其他含有可以被紫外光或可见光切割的基团的分子作为连接臂分子。
前述实施例以链霉亲和素及生物素化的cd71抗体为例，但也可以利用抗体上的氨基或者巯基将抗体固定在微流道表面。
前述实施例以cd71抗体为例作为胎儿有核红细胞的特异性捕获抗体，但也可以用cd36或者其他胎儿有核红细胞特异性抗体作为捕获抗体，还可以通过多肽筛选方法获得的特异性多肽作为捕获分子，还可以通过核酸适配体筛选获得核酸适配体作为捕获分子，还可以通过多种抗体混合提高捕获效率，还可以通过将抗体与多肽、或者抗体与核酸适配体、或者多肽与核酸适配体、或者抗体与多肽以及核酸适配体混合后作为捕获分子，以提高捕获效率。
实施例6：采集的新鲜孕妇外周血可以直接使用实施例1-5中所述的微流控芯片进行胎儿有核红细胞捕获富集，其操作方法包括：将2-5毫升新鲜孕妇外周血按照1mm/s的线速度通过实施例1-5所述的微流控芯片内的微流道(相应的体积速度可通过线速度与等效截面积计算得到)，之后以1毫升磷酸缓冲液清洗微流道。将100μl荧光素(fitc)标记的cd36抗体和/或cd235a抗体流过微流道，室温静置30min后，在荧光显微镜下观察，荧光检测结果为阳性的细胞初步鉴定为胎儿有核红细胞，用波长405nm的紫外光源切割5min，收集细胞，用于分子生物学鉴定，包括pcr、桑格测序和第二代测序等。
实施例7：采集的新鲜孕妇外周血可以直接使用实施例1-5中所述的微流控芯片进行胎儿有核红细胞捕获富集，其操作方法包括：将2-5毫升新鲜孕妇外周血按照1mm/s的线速度通过实施例1-5所述的微流控芯片内的微流道(相应的体积速度可通过线速度与等效截面积计算得到)，之后以1毫升磷酸缓冲液清洗微流道。将100微升荧光素(fitc)标记的cd45抗体流过微流道，室温静置30分钟后，在荧光显微镜下观察，荧光检测结果为阴性的细胞初步鉴定为胎儿有核红细胞，用405纳米紫外光源切割1-5分钟，收集细胞，用于分子生物学鉴定，包括pcr,桑格测序和第二代测序等。
较为优选的，在前述实施例中也可在将所述新鲜孕妇外周血输入所述微流控芯片之前进行预处理。所述预处理包括但不限于梯度密度离心、磁珠负选(如用cd45标记的磁珠除去部分白细胞)等，获得初步富集胎儿有核红细胞的样品，之后再输入所述微流控芯片。前述的这些预处理方式均是业界已知的，例如可以参考文献6。
考虑到在样品流过微流控芯片并经过清洗后，微流道和微结构表面既可能有被特异性识别分子(包括但不限于cd71、cd36等)、多肽和核酸适配体，捕获的胎儿有核红细胞，也可能有非特异性吸附的其他细胞等，而胎儿有核红细胞的纯度会直接影响下游分子生物学分析。因此，还可以对微流道和/或微结构上吸附的细胞进行鉴定，鉴定的方法包括但不限于免疫荧光染色、荧光原位杂交(fish)等，例如可以参阅文献7。所述免疫荧光染色鉴定包括正鉴定和负鉴定。
其中，所述正鉴定可通过捕获分子不同的抗体免疫荧光染色鉴定，如当使用鼠抗人cd71抗体捕获时，可用荧光标记的兔抗人cd71抗体，或者cd36抗体，或者cd235a抗体,或者丙种球蛋白抗体，或者荧光标记的特异性多肽进行免疫荧光染色鉴定，也可用荧光标记的核酸适配体进行鉴定，例如可以参阅文献8。
其中，所述负鉴定可通过荧光标记的白细胞特异性抗体，包括但不限于cd45，对微流道和微结构表面的细胞进行免疫荧光染色鉴定，被荧光抗体染色被鉴定为白细胞，而未被染色的细胞则被鉴定为胎儿有核红细胞。
在鉴定完毕后，可以对确定为胎儿有核红细胞进行单细胞释放或者多细胞分批释放，其具体操作可以包括：在荧光显微镜观察下，打开发射波长为300nm～450nm的光源，通过显微镜光路，选择性切割可被紫外光切割的连接臂分子，释放选定的胎儿有核红细胞。
进而，可以对被释放的细胞进行单细胞分析，也可以收集被释放的部分细胞或者所有细胞进行分析。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，可以实现高效率和高纯度的分离胎儿有核红细胞，并可对捕获的胎儿有核红细胞进行单细胞释放，从而可以大幅降低下游分子生物学分析和遗传病检测的难度并提升准确率。
文献6：ahighyieldoffetalnucleatedredbloodcellsisolatedusingoptimalosmolalityandadouble-densitygradientsystem.prenatdiagn.2007dec；27(13):1245-50。
文献7：enrichmentoffetalcellsfrommaternalbloodbyhighgradientmagneticcellsorting(doublemacs)forpcr-basedgeneticanalysis.prenatdiagn.1994dec；14(12):1129-40。
文献8：analysisoffetalnucleatedredbloodcellsfromcvswashingsincasesofaneuploidy.prenatdiagn.2001oct；21(10):864-7。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。