乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及其制备方法和用途与流程

本发明属高分子化学材料领域，具体涉及一种乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及其制备方法和用途。

背景技术：

壳聚糖(chitosan,cs)是甲壳素在碱性条件下部分脱乙酰基的产物，是自然界中唯一具有明显碱性的天然多糖，具有优良的生物降解性、良好的抑菌性能和生物相容性，但其在碱性和中性条件下难以溶解的特性，较大程度地限制了它的应用。对壳聚糖进行季铵化改性，能有效改善壳聚糖在中性甚至弱碱性水溶液中的溶解能力，与壳聚糖相比，改性后的壳聚糖季铵盐因具有更为优良的水溶性、吸湿保湿性和抗菌性能而受到广泛关注。

乳酸链球菌肽(nisin)是由乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的阳离子多肽，其分子量约为3500da，由34个氨基酸残基构成，其分子结构中含有不常见的氨基酸和硫醚基团，这些基团使其具有一些功能特性，如耐酸性、抗菌性和抗氧化活性。近年来，相关研究者采用传统化学交联剂如戊二醛、edc/nhs等，将多肽接枝到多糖上以期获得具有更好生物性能(如水溶性、抗菌性和抗氧化活性等)的高分子化合物。然而，此类化学试剂不可避免的会产生毒性且常常伴随着一些副反应的发生。因此，寻求一种绿色高效的合成方法已变得刻不容缓。

本发明以转谷氨酰胺酶为催化剂，催化乳酸链球菌肽和壳聚糖季铵盐合成以酰胺键连接的乳酸链球菌肽-壳聚糖季铵盐改性物，该催化反应选择性专一，环境友好，所制备的改性物具有良好的抗菌性能，除此之外，经接枝改性后的化合物抗氧化活性显著增强，能有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基、羟自由基，是一种有潜在应用价值的伤口敷料。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及其制备方法和用途。该方法制备工艺简单，制得的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐具有良好的抗氧化能力和抗菌活性以及对细胞无明显毒性。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

提供一种乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，它是以壳聚糖季铵盐和乳酸链球菌肽为底物，转谷氨酰胺酶为催化剂催化接枝得到的。

按上述方案，所述乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐中壳聚糖季铵盐的氨基被乳酸链球菌肽取代的取代度为0.233-0.467。

按上述方案，所述壳聚糖季铵盐由壳聚糖接枝3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵得到。

所述壳聚糖季铵盐具体制备方法为：将3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶于蒸馏水中，随后加入壳聚糖，壳聚糖与3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵质量比为1:10-15，在75-95℃下接枝反应20-28h，随后将所得反应液后处理得到壳聚糖季铵盐。

本发明还提供上述乳酸链球菌肽接枝基壳聚糖季铵盐的制备方法：先将壳聚糖季铵盐溶于pbs溶液中，再与乳酸链球菌肽在转谷氨酰胺酶的作用下进行接枝反应，再经后处理得到乳酸链球菌肽接枝基壳聚糖季铵盐。

上述制备方法具体步骤如下：

1)将壳聚糖季铵盐溶于ph值为4-6的pbs缓冲溶液中，得到浓度为0.02-0.30mg/ml的壳聚糖季铵盐溶液；

2)将乳酸链球菌肽和转谷氨酰胺酶冻干粉分别溶于pbs缓冲溶液，得到乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，然后将乳酸链球菌肽溶液、转谷氨酰胺酶溶液依次加入到步骤1)所得壳聚糖季铵盐溶液中进行接枝反应，再进行后处理得到乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐。

按上述方案，步骤2)所述乳酸链球菌肽与壳聚糖季铵盐溶液中壳聚糖季铵盐的质量比为0.5-2.5：1。

按上述方案，步骤2)所述转谷氨酰胺酶冻干粉由粗制转谷氨酰胺酶经纯化后冷冻干燥得到，所述转谷氨酰胺酶冻干粉与壳聚糖季铵盐溶液中壳聚糖季铵盐的质量比为0.05-0.25：1。

按上述方案，步骤2)所述接枝反应条件为：在25-55℃下反应1-4小时。

按上述方案，步骤2)所述后处理包括将接枝后的产物加热煮沸15min后，再进行离心、透析冷冻干燥处理。

本发明还包括上述乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐在伤口创面愈合处理方面的应用。

本发明的有益效果在于：本发明制备工艺简单，环境友好，成本低廉；制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐水溶性好，具有良好的抗氧化能力和抗菌活性以及对细胞无明显毒性，在伤口的愈合方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例1制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐的红外光谱图；

图2为实施例1-5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐对dpph的清除率数据对比图；

图3为实施例1-5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐对羟自由基的清除率数据对比图；

图4为实施例1、3、5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及未接枝乳酸链球菌肽的壳聚糖季铵盐对成纤维细胞的细胞存活率对比图。

其中，附图2-4中的取代度分别对应相应的实施例，取代度0.233代表实施例1，取代度0.294代表实施例2，取代度0.322代表实施例3，取代度0.402代表实施例4，取代度0.467代表实施例5。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

本发明实施例所用壳聚糖季铵盐的制备方法如下：取83.72g3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶于45.08ml蒸馏水中，用15％的naoh溶液调节ph至8，随后加入8.00g壳聚糖，在85℃下进行接枝反应24h，将所得反应液在蒸馏水中透析三天，旋转蒸发，烘干后即得到壳聚糖季铵盐。

实施例1

制备乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，方法如下：

分别配制浓度为0.2mol/l的磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，然后将磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液按体积比96:4混合均匀配制得到ph为4.0的pbs缓冲溶液，量取50ml配制的ph为4.0的pbs缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖季铵盐，使其充分溶解，随后称取0.5g乳酸链球菌肽和0.05g转谷氨酰胺酶冻干粉分别溶解在50mlph为4的pbs缓冲溶液中，得到乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，依次向三口烧瓶中加入乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，在25℃下搅拌反应1h后，将反应液至于沸水浴中搅拌15min使酶失活，然后将反应液冷却至室温。将反应后的溶液透析三天纯化，冷冻干燥后得到乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，经测定：该乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐中氨基基团被乳酸链球菌肽取代的取代度为0.233。

该乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐经红外表征的红外图谱见图1：与壳聚糖(cs)相比，壳聚糖季铵盐(qcs)在1480cm^-1处出现了极为明显的吸收峰，这是氮甲基的伸缩振动吸收峰，这说明季铵盐基团成功地连接到了壳聚糖分子上；乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵(qcs-nisin)在1655cm^-1和1546cm^-1处出现的吸收峰，它们分别归属于酰胺ⅰ带和酰胺ⅱ带；说明乳酸链球菌肽中的酰胺基已经成功接枝到壳聚糖的氨基上。

实施例2

制备乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，方法如下：

分别配制浓度为0.2mol/l的磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，然后将磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液按体积比95：5混合均匀配制得到ph为5.0的pbs缓冲溶液，量取50ml配制的ph为5.0的pbs缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖季铵盐，使其充分溶解，随后称取1.0g乳酸链球菌肽和0.1g转谷氨酰胺酶冻干粉，分别溶解在50mlph为5.0的pbs缓冲溶液中，得到乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，依次向三口烧瓶中加入乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，在35℃下搅拌反应2h后，将反应液至于沸水浴中搅拌15min使酶失活，然后将反应液冷却至室温。将反应后的溶液透析三天纯化，冷冻干燥后得到乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，经测定：该乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐中氨基基团被乳酸链球菌肽取代的取代度为0.294。

实施例3

制备乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，方法如下：

分别配制浓度为0.2mol/l的磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，然后将磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液按体积比88：12混合均匀配制得到ph为5.0的pbs缓冲溶液，量取50ml配制的ph为5.0的pbs缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖季铵盐，使其充分溶解，随后称取1.5g乳酸链球菌肽和0.15g转谷氨酰胺酶冻干粉，分别溶解在50mlpbs缓冲溶液中，得到乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，依次向三口烧瓶中加入乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，在45℃下搅拌反应3h后，将反应液至于沸水浴中搅拌15min使酶失活，然后将反应液冷却至室温。将反应后的溶液透析三天纯化，冷冻干燥后得到乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，经测定：该乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐中氨基基团被乳酸链球菌肽取代的取代度为0.322。

实施例4

制备乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，方法如下：

配制ph为5的pbs缓冲溶液，量取50mlpbs缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖季铵盐，使其充分溶解。随后，称取2.5g乳酸链球菌肽和0.25g转谷氨酰胺酶冻干粉，分别溶解在50mlpbs缓冲溶液中，得到乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，依次向三口烧瓶中加入乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，在55℃下搅拌反应4h后，将反应液至于沸水浴中搅拌15min使酶失活，然后将反应液冷却至室温。将反应后的溶液透析三天纯化，冷冻干燥后得到乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，经测定：该乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐中氨基基团被乳酸链球菌肽取代的取代度为0.402。

实施例5

制备乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，方法如下：

配制ph为4的pbs缓冲溶液，量取50mlpbs缓冲溶液至三口烧瓶中，加入1.0g壳聚糖季铵盐，使其充分溶解。随后，称取2.0g乳酸链球菌肽和0.20g转谷氨酰胺酶冻干粉，分别溶解在50mlpbs缓冲溶液中，得到乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，依次向三口烧瓶中加入乳酸链球菌肽溶液和转谷氨酰胺酶溶液，在35℃下搅拌反应2h后，将反应液至于沸水浴中搅拌15min使酶失活，然后将反应液冷却至室温。将反应后的溶液透析三天纯化，冷冻干燥后得到乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐，经测定：该乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐中氨基基团被乳酸链球菌肽取代的取代度为0.467。

实施例6

将上述各实施例制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐进行如下性能表征：

(1)dpph清除率：用无水乙醇配制0.1mmol/l的dpph溶液，避光保存，将实施例1-5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐分别配制成不同浓度的溶液，作测试样品，然后取2.0ml的测试样品溶液与2.0mldpph溶液加入到同一试管中，混合均匀，得各测试样品溶液，浓度分别为0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.5mg/ml，5.0mg/ml。室温下暗处静置30min后，用紫外分光光度计测各测试样品溶液在517nm处的吸光度，按以下公式计算各实施例制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐的dpph清除率，结果见图2，其中ds为测试样品溶液的吸光度，db为2.0ml的测试样品溶液与2.0ml无水乙醇混合后的吸光度，dc为2.0ml的dpph溶液与2.0ml无水蒸馏水混合后的吸光度。

图2为实施例1-5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐对dpph的清除率数据对比图，由图2可知，壳聚糖季铵盐经过乳酸链球菌肽接枝改性后，dpph清除率随着取代度和浓度的增大而增大。取代度为0.233和0.294时，随浓度增大，清除率随浓度增大变化缓慢；当取代度为0.322，0.402和0.467时，清除率随浓度的增大变化明显。

(2)羟自由基清除率：用蒸馏水配制1.5mmol/l的菲啰啉溶液和1.5mmol/l的硫酸亚铁溶液。将实施例1-5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐分别配制成不同浓度的溶液，作测试样品，然后取1.0ml的测试样品溶液与1.0ml菲啰啉溶液加入到同一试管中，混合均匀，得各测试样品溶液，浓度分别为0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.5mg/ml，5.0mg/ml。然后向混合物中加入1.0ml硫酸亚铁溶液，混合均匀后，取1.0ml过氧化氢溶液(0.03％v/v)加入到混合液中，在37℃水浴中保温1h，用紫外分光光度计测各测试样品溶液在536nm处的吸光度，按以下公式计算各实施例制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐的羟自由基清除率。

其中，as为含有待测样品的吸光度，an为用蒸馏水替代混合物样品的吸光度，作为阴性对照。ab是用蒸馏水替代h2o2的混合液吸光度，作为空白对照。

图3为实施例1-5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐对羟自由基的清除率数据对比图，由图3可知:随着浓度的增加和取代度的升高，壳聚糖季铵盐接枝乳酸链球菌肽对羟自由基的清除能力逐渐增强。当浓度从0.1mg/ml增加到0.5mg/ml时，清除率缓慢上升，当样品浓度达到1.0-5.0mg/ml时，清除率上升趋势更加明显。在取代度为0.467，浓度为5.0mg/ml时，羟自由基的清除率达到最大，为90.1％。

创面中过多的自由基会导致伤口炎症，继而造成组织继发性损伤，良好的自由基清除率将有利于改善伤口愈合环境，减轻细胞损伤；同时，适当清除氧自由基可以改善血管通透性，减少渗出液，减轻组织的水肿，从而促进创面伤口愈合。

(3)抗菌性能测定：采用抑菌圈法对实施例1、3、5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及未接枝乳酸链球菌肽的壳聚糖季铵盐进行抗菌性能测试，测试的细菌是金黄色葡萄球菌和大肠杆，实验步骤如下：将滤纸剪成圆片(直径为5mm)，灭菌，干燥，分别在不同浓度的样品(0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.5mg/ml)溶液中浸泡，备用；吸取0.10ml的菌悬液至固体培养基表面涂布均匀，用灭菌后的镊子夹取浸泡过的滤纸片贴在各含菌平板上，最后将培养皿翻转，使低朝上，置于37℃恒温培养箱中培养24h后，观察滤纸片周围抑菌圈直径大小，并以此作为评价抑菌性能依据。

壳聚糖季铵盐及乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐抑菌圈直径(直径单位：mm；qcs-sfp1、qcs-sfp3、qcs-sfp5分别代表实施例1、3、5)见表1。

表1

创伤愈合过程受到多种因素的影响，其中病原微生物是一个重要的影响因素。病原微生物在伤口组织内繁殖，会造成血管扩张、组织水肿等局部炎症反应，可引发组织坏死、液化而形成脓肿，阻碍伤口的愈合进程，使用抗菌材料处理伤口可有效抑制微生物生长、繁殖，缩短感染伤口的愈合时间。

将实施例1、3、5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及未接枝乳酸链球菌肽的壳聚糖季铵盐用于测定其对成纤维细胞的毒性，实验步骤如下：在无菌条件下，将大鼠皮肤成纤维细胞置入培养瓶中，用含10％fbs的dmem培养基在37℃、5％co2的培养箱中培养。将传代3次后的成纤维细胞接种于96孔细胞培养板中(6000细胞/孔)，用200μl含10％fbs的dmem培养基培养24h。加入实施例1、3、5的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐或未接乳酸链球菌肽的壳聚糖季铵盐培养48h后，随后加入20μl的mtt溶液，避光反应4h。吸去培养基后加入150μl二甲基亚砜(dmso)，避光震荡20min，使mtt甲瓒晶体溶解。用酶标仪测其在490nm处的吸光度，按如下公式计算细胞存活率，其中ods为测试样或对比样的吸光度，odc为空白对照。

图4为实施例1、3、5制备的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐及未接枝乳酸链球菌肽的壳聚糖季铵盐对成纤维细胞的细胞存活率对比图，由图4可知，壳聚糖季铵盐经过乳酸链球菌肽接枝改性后得到的各实施例中的乳酸链球菌肽接枝壳聚糖季铵盐均表现出了较好的细胞存活率(≥75％)，表明其对细胞无明显毒性，且随着取代度的增大，细胞存活率有升高的趋势。