一种黑蒜多糖提取物的制备工艺及应用的制作方法

本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种黑蒜多糖提取物的制备工艺及应用。

背景技术：

黑蒜(blackgarlic)，黑蒜又名黑大蒜、发酵黑蒜、黑蒜头，是用新鲜的生蒜，带皮放在高温高湿的发酵箱里发酵60～90天，让其自然发酵制成的食品。

目前，我国心血管病人群突破2.9亿，冠心病的年发病人群突破64‰，脑中风年发病率165～245/10万。最近5年来，脑中风病正以每年近13％速度上升，有的地区有40％是中年人。大量实验和临床资料表明，冠心病、心肌梗死、脑梗塞、弥漫性血管内凝血、深部静脉血栓等心脑血管病的发生、发展与血脂、血粘、凝血及血小板聚集密切相关，特别是凝血及血小板聚集起到关键性作用。目前抗凝血及抗血小板聚集的药物主要包括肝素、华法林、阿司匹林、水蛙素等，这些准字药品都具有不同程度的毒副作用，口服常规剂量的抗凝药物增加脑出血的危险性高达7-10倍。目前，尽管西医学在心脑血管病的临床治疗上达到了很高水平，但也只能是治标，冠心病、脑中风都无法治愈。

血管生成又称为血管新生，是指毛细血管从原血管以出芽方式形成新血管床的过程。通常存在于胚胎形成和产后组织正常生长的过程中，成年女性生殖系统子宫内膜血管的周期性反复重建和组织受损后正常的修复也有血管生成的参与。出生后的血管再生方式主要包括血管生成和动脉生成。血管生成与动脉生成过程中可以发现两者在发生的部位、诱发和调节因素、结果方面有着一定的区别和联系。大部分的缺血性血管疾病需要同时促进血管生成和动脉生成。

为此，寻找能有效抗血小板聚集和/或促进血管生成的有效组药物或有效提取物是一件十分棘手的事情。目前，关于黑蒜的药理研究主要集中在降血脂、降血糖、抗肿瘤、提高免疫力以及营养学功效等方面，主要由黑蒜中的大蒜素、含硫化合物等来发挥作用，但是对其有效成分的其他药理作用研究较少，更没有关于抗血小板聚集和/或促进血管生成方面的应用报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黑蒜多糖提取物的制备工艺及应用，使得所提取的黑蒜多糖提取物能够显著抗血小板凝集和促进血管生成。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

针对目前关于黑蒜药理研究的空白，本发明提出了黑蒜在制备抗血小板聚集和/或促进血管生成的药物和/或保健品中的应用。

同时，更为具体地，本发明还提出了黑蒜多糖提取物在制备抗血小板聚集和/或促进血管生成的药物和/或保健品中的应用。

在本发明所进行的黑蒜多糖提取物药理试验中，所述黑蒜多糖提取物参照如下制备工艺获得：

步骤1、将黑蒜用水或乙醇加热提取，固液分离，取上清液，得黑蒜提取液；

步骤2、将黑蒜提取液回收溶剂，得黑蒜浓缩液；

步骤3、向黑蒜浓缩液中加入乙醇，静置，所得沉淀物经过处理，获得黑蒜多糖提取物。

其中，作为优选，步骤1为将黑蒜用2-50倍于黑蒜重量的水或乙醇溶液加热提取，固液分离，沉淀物重复加热提取1-2遍并固液分离，合并所有固液分离后的上清液，得黑蒜提取液。

作为优选，步骤1所述水或乙醇溶液的重量是黑蒜重量的6倍、8倍、10倍、15倍或50倍，所述乙醇溶液的质量百分数不大于15％，例如5％、10％或15％；而加热提取为在80-100℃加热提取15-60min，更具体地可以是在100℃加热提取15min、在80℃加热提取60min、在95℃加热提取30min、在85℃加热提取25min或在90℃加热提取40min。

作为优选，步骤2为将黑蒜提取液在低于80℃条件下回收溶剂，得黑蒜浓缩液；在本发明具体实施过程中，回收溶剂时的温度也可以在70℃以下、68℃以下、62℃以下、60℃以下或58℃以下，同时也可以包含这些端点值。

作为优选，步骤3为向黑蒜浓缩液中加入其体积2-5倍的质量百分数为90-100％的乙醇溶剂，搅拌均匀，放于0～25℃的条件下静置3-12小时，所得沉淀物经过处理，获得黑蒜多糖提取物；对于所加入的乙醇溶剂，可以是2倍于黑蒜浓缩液体积的质量分数为100％的乙醇溶剂、5倍于黑蒜浓缩液体积的质量分数为90％的乙醇溶剂、3倍于黑蒜浓缩液体积的质量分数为95％的乙醇溶剂、4倍质量分数为95％的乙醇溶剂或3.5倍于黑蒜浓缩液体积的质量分数为95％的乙醇溶剂；对于静置环境，可以是在0℃的条件下静置3小时、在25℃的条件下静置12小时、在4℃的条件下静置6小时、在10℃的条件下静置8小时或在15℃的条件下静置10小时。

作为优选，所述经过处理具体为：将沉淀物用质量百分数为75-85％的乙醇溶剂洗涤1-5次，接着取沉淀物用水溶解。在具体实施过程中，可以用质量百分数为85％的乙醇溶剂洗涤1次、用质量百分数为75％的乙醇溶剂洗涤2次、用质量百分数为80％的乙醇溶剂洗涤3次、用质量百分数为78％的乙醇溶剂洗涤4次或用质量百分数为83％的乙醇溶剂洗涤2次。

本发明所获得的黑蒜多糖提取物药理学试验结果显示，其具有很好的促进斑马鱼血管生成作用，且具有显著性差异。同时在对转基因斑马鱼胚胎的毒性试验中，没有毒性。同时，所述黑蒜多糖提取物具有很好的抗血小板聚集作用，与对照组相比，效果明显。正是基于上述优异的技术效果，本发明提出了黑蒜及其提取物在上述两个方面的药物和/或保健品的制备中的应用。

对于药物和保健品，可以采用医学或食品可接受的载体、赋形剂、赋形剂和/或填充剂，制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型的药物，或者符合保健食品要求的保健品，如可将其制成口服制剂、注射剂等。口服制剂如常规的固体制剂如片剂、胶囊、软胶囊等；液体制剂如口服液，合剂、糖浆剂等。

由以上技术方案可知，通过本发明工艺制备的黑蒜多糖提取物，在药理学试验中具有很好的抗血小板聚集以及促进血管生成的作用，且在基因斑马鱼胚胎的毒性试验中无毒，可以通过制剂学知识，运用于抗血小板聚集和/或促进血管生成相关产品中。

附图说明

图1所示为各实施例样品对斑马鱼胚胎毒性实验结果；

图2所示为斑马鱼完整与缺陷节间血管示意图；其中，1为缺陷性血管(defective)；2为节间血管(isvs)；3为背部脊索血管(dlav)；4为主动脉(da)；5为完整血管(intact)；

图3所示为各实施例样品对促斑马鱼血管生成作用结果；

图4所示为实施例2、3样品对斑马鱼节间血管长度的实验结果；

图5所示为实施例2、3样品对斑马鱼节间血管数量的实验结果，defective表示缺陷型血管，intact表示完整血管，完整血管柱形均高于缺陷型血管柱形。

具体实施方式

本发明公开了一种黑蒜多糖提取物的制备工艺及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用及制备工艺已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的工艺和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种黑蒜多糖提取物的制备工艺及应用做进一步说明。

实施例1：黑蒜多糖提取物的制备

取黑蒜500g，按重量份比，加入黑蒜重量10倍份的水，加热至100℃时，继续加热提取15min，直接过滤，固液分离，取上清液，得黑蒜提取液；将黑蒜提取液在温度低于80℃下回收溶剂，得黑蒜浓缩液；按体积比，向黑蒜浓缩液中加入2倍其体积的质量分数为100％的乙醇溶剂，搅拌均匀，放于0℃的条件下静置3小时，取沉淀物，用质量分数为85％的乙醇溶剂洗涤1次，接着取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

实施例2：黑蒜多糖提取物的制备

取黑蒜100g，按重量份比，加入黑蒜重量50倍份的质量分数为15％的乙醇溶剂，加热至80℃，继续加热提取60min，固液分离，取上清液，得黑蒜提取液；将黑蒜提取液在温度低于62℃下回收溶剂，得黑蒜浓缩液；按体积比，向黑蒜浓缩液中加入5倍其体积的质量分数为90％的乙醇溶剂，搅拌均匀，放于25℃的条件下静置12小时，取沉淀物，用质量分数为75％的乙醇溶剂洗涤2次，接着取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

实施例3：黑蒜多糖提取物的制备

取黑蒜500g，加入黑蒜重量6倍份的水，加热至95℃，继续加热提取30min，离心，固液分离，取上清液，再取沉淀物加入沉淀物重量8倍的水，依上法继续提取2次，离心，固液分离，合并上清液，得黑蒜提取液；将黑蒜提取液在温度为58℃下回收溶剂，得黑蒜浓缩液；按体积比，向黑蒜浓缩液中加入3倍其体积的质量分数为95％的乙醇溶剂，搅拌均匀，放于4℃的条件下静置6小时，取沉淀物，用质量分数为80％的乙醇溶剂洗涤3次，接着取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

实施例4：黑蒜多糖提取物的制备

取黑蒜500g，按重量份比，加入黑蒜重量8倍份的质量分数为5％的乙醇溶剂加热至85℃，继续加热提取25min，匀浆、离心，固液分离，取上清液，再取沉淀物加入沉淀物重量2倍的5％的乙醇溶剂，依上法继续提取1次，匀浆、离心，合并上清液，得黑蒜提取液；将黑蒜提取液在温度为60℃下回收溶剂，得黑蒜浓缩液；按体积比，向黑蒜浓缩液中加入4倍其体积的质量分数为95％的乙醇溶剂，搅拌均匀，放于10℃的条件下静置8小时，取沉淀物，用质量分数为78％的乙醇溶剂洗涤4次，接着取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

实施例5：黑蒜多糖提取物的制备

取黑蒜500g，按重量份比，加入黑蒜重量15倍份的水，加热至90℃，继续加热提取40min，过滤，固液分离，取上清液，再取沉淀物加入沉淀物重量10倍的水，依上法继续提取1次，过滤，合并上清液，得黑蒜提取液；将黑蒜提取液在温度为70℃下回收溶剂，得黑蒜浓缩液；按体积比，向黑蒜浓缩液中加入3.5倍其体积的质量分数为95％的乙醇溶剂，搅拌均匀，放于15℃的条件下静置10小时，取沉淀物，用质量分数为83％的乙醇溶剂洗涤2次，接着取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

实施例6：黑蒜多糖提取物抗血小板聚集药理试验

1.实验动物

雄性家兔7只，体重2.0～2.2kg，购自江宁县青龙山动物养殖场。动物于25℃、相对湿度60～75％条件下饲养1周后用于实验。

2.仪器和试剂

lg-paber-i血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)，80-2台式低速离心机(上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)，sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)。

二磷酸腺苷钠盐(adp)，花生四烯酸(aa，sigma公司进口分装)，枸橼酸钠(南京化学试剂有限公司)，盐酸普鲁卡因(上海旭东海普药业有限公司)，0.9％氯化钠注射液(安徽双鹤药业有限责任公司)。

3.实验样品制备

取实施例1-5所制备的黑蒜多糖提取物，用生理盐水进行溶解，样品浓度按提取物干燥品计，单位为mg/ml；分别编号为样品1-5。

白蒜对照组：取白蒜1kg，按实施例3方法进行制备，得到白蒜多糖提取物，用生理盐水进行溶解，样品浓度按提取物干燥品计，单位为mg/ml；编号为白蒜对照组。

空白对照组：以等体积的生理盐水替代作为空白对照组。

4.实验方法和实验结果

实验方法：取实验家兔用盐酸普鲁卡因局部麻醉后，手术分离颈总动脉取血，用3.8％枸橼酸钠1：9抗凝，以500r/min离心10min，制备富血小板血浆(prp)，剩余部分再以3000r/min离心10min，制备贫血小板血浆(ppp)，按born氏比浊法进行血小34板聚集实验。测定管中加入prp260μl、各实验样品30μl，温孵5min，分别以10μlaa(终浓度0.35mmol/l)和10μladp(终浓度10μmol/l)为诱导剂，观察记录5min内最大聚集率。计算各实验样品对aa和adp诱导的血小板聚集抑制率，结果分别见表1和表2。

表1各实验样品对aa诱导血小板聚集抑制结果

表2各实验样品对adp诱导血小板聚集抑制结果

由表1和表2的实验结果可以看出，实施例1-5对aa、adp诱导血小板聚集均有抑制作用，而白蒜对照组和空白对照组样品则没有这个功效。

实施例7：黑蒜多糖提取物促血管生成作用药理试验

1.实验动物

细胞转基因斑马鱼鱼系tg(fli-1:egfp)在标准条件下即14小时白天/10小时夜晚周期进行喂养和繁殖，斑马鱼(3－12月)胚胎在自然交配条件下获得，并在28.5℃的胚胎培养液中孵育。

2.仪器和试剂

转盘式共聚焦显微镜系统(olympus)；vegfrtyrosinekinaseinhibitorii(vri)购自calbiochem公司。

3.实验样品制备

取实施例1-5所制备的黑蒜多糖提取物，用斑马鱼培养液溶解样品，样品浓度按提取物干燥品计，溶解制成10mg/ml溶液，于-20℃保存备用；分别编号为样品1-5。

白蒜对照组：取白蒜1kg，按实施例3方法进行制备，得到白蒜多糖提取物，用斑马鱼培养液进行溶解，样品浓度按提取物干燥品计，溶解制成10mg/ml溶液，于-20℃保存备用；编号为白蒜对照组。

空白对照组：以等体积的斑马鱼培养液替代作为空白对照组。

4.实验方法和实验结果

4.1毒性检测

实验方法：选择状态良好，受精后发育至48h血管转基因斑马鱼胚胎，将其放入含1ml培养液的24孔培养板中，每孔8个胚胎，于28.5℃培养。以仅有斑马鱼培养液培养的胚胎为空白对照组，vri处理为模型组，以50、100、200、400μg/ml不同样品作为处理组，观察48h内胚胎存活情况。

实验结果：各实施例400μg/ml样品对斑马鱼胚胎毒性实验结果如图1所示。从实验结果可以看出，样品1-5和白蒜对照组处理48h后，斑马鱼胚胎数无变化、无病变，其他观察浓度下样品也均无毒性。

4.2样品对斑马鱼血管生成影响

实验方法：选择状态良好，受精后发育至48h血管转基因斑马鱼胚胎，将其放入含1ml培养液的24孔培养板中，每孔8个胚胎，于28.5℃培养。以仅有斑马鱼培养液培养的胚胎为空白对照组，vri处理为模型组，以不同浓度(在考察的无毒浓度范围内，<400μg/ml)样品为药物样品处理组。药物作用24h后，在荧光显微镜下观察不同浓度样品对斑马鱼节间血管(isvs)的影响，其中本发明定义在vri诱导的斑马鱼血管损伤模型中，从主动脉(da)发芽延伸并连接到背部脊索血管(dlavs)的isvs定义为完整血管(intact)，而未与dlavs相连的isvs定义为缺陷型血管(defective)，同时用imagej软件(版本：1.51f)测量每条斑马鱼新生isvs的长度，每个实验重复三次，结果以平均值±标准差(mean±sd)表示，并以t检验作显著性分析。

实验结果：斑马鱼节间血管完整与缺陷节间血管示意图如图2所示。实例1-5和白蒜对照组在200μg/ml浓度时对促斑马鱼血管生成作用如图3所示。其实中实施例3在处理斑马鱼胚胎24h后，斑马鱼节间血管(isvs)长度和数量明显增加(p＜0.05)，实施例3对斑马鱼节间血管(isvs)长度的结果如图4所示，实施例3对斑马鱼节间血管(isvs)数量的结果如图5所示。

从结果可以看出，白蒜对照组对斑马鱼isvs生成无影响，实施例1-5对有促斑马鱼血管生成作用，在处理斑马鱼胚胎24h后，isvs数量明显增加。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。