一种四甲基罗丹明的制备工艺的制作方法

本发明涉及一种荧光染料的制备工艺，具体涉及一种四甲基罗丹明的制备工艺。

背景技术：

罗丹明类化合物是以氧杂蒽为母体的染料，由于其特殊的结构，罗丹明类荧光染料与其它常用的荧光染料相比，具有如下优点：光稳定性好、对ph不敏感、较宽的波长范围和较高的荧光量子产率。因此被广泛应用在药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、环境化学、单个分子检测、信息科学、荧光标记、激光染料等方面。其中，四甲基罗丹明(tamra)有亲脂性强、斯托克斯位移(stokesshift)较小、荧光量子产率较高、发射波长较长以及吸光系数较大的优点，被广泛应用于dna测序、免疫荧光染色和标记抗体等方面(u.s.patent,637290781)。此外，四甲基罗丹明(tamra)还可以被广泛应用于研究蛋白质的结构、性能、内部的相互作用关系，其用来分析研究粘度比较大、分子量大于4×10⁶的蛋白质效果很好，并且四甲基罗丹明分析速度快且不会污染蛋白多糖结构，而其它类探针很难对该蛋白进行分析检测；因此，四甲基罗丹明是分析化学和生物医药科学等生物技术领域中最常用的荧光染料(anal.biolchem.；1995,227,394～396)。

四甲基罗丹明有着十分广阔的应用前景，现有的制备方法包括传统的直接缩合合成法、分步缩合合成法、氨基酚与醛基化合物的缩合、氨基酚与1-羟基-3氧代-1，3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸缩合氧化反应；上述制备方法收率较低(一般只有百分之十几)，纯化过程繁琐(制备柱纯化)，致使四甲基罗丹明的价格十分昂贵。

其中传统的直接缩合合成法是以n,n-二甲基间胺基苯酚和偏苯酸三酐为原料，在布朗斯德酸或者路易斯酸中高温缩合制得，(thejournaloforganicchemistry,1989,54(23):5642-5644；j.chem.soc,perkintransii,1993:1195；curr.org.chem.2016,20,1584.)。该方法的优点是原料易得，都是工业化产品，成本低廉；但四甲基罗丹明的收率较低，一般只有百分之十几；并且对反应条件的要求比较苛刻，一般都需要高温甚至熔融。该合成法首先得到的是5位取代基和6位取代基的异构体混合物，这类5位和6位取代基异构体大多采用色谱方法进行分离(如制备柱或者硅胶柱层析)，该分离方法除成本高，并且只能得到克级甚至毫克级的成品，难于批量制备。

技术实现要素：

基于上述背景技术，本发明的目的在于一种原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的四甲基罗丹明(tamra)制备工艺；本发明以n,n-二甲基间胺基苯酚和偏苯酸三酐为原料，依次进行环合反应处理，纯化处理，拆分反应处理及酸析反应处理，即得到四甲基罗丹明。

即本发明是通过环合反应直接制得到5位取代基和6位取代基的5(6)-四甲基罗丹明异构体混合物，混合物与有机胺反应形成成盐，通过这种盐在溶剂中的溶解性不同，从而达到分离纯化的目的。

所述的一种四甲基罗丹明(tamra)制备工艺，具体包括如下步骤：

1)5(6)-四甲基罗丹明的合成：取n,n-二甲基间胺基苯酚、偏苯酸三酐及第一溶剂混合，加入酸反应，即得5(6)-四甲基罗丹明；

2)5(6)-四甲基罗丹明铵盐制备：将步骤1)得到的5(6)-四甲基罗丹明加入第二溶剂中溶解，加入有机胺反应，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明铵盐，滤液浓缩即得6-四甲基罗丹明铵盐；

3)5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明的制备：以步骤2)得到的5-四甲基罗丹明铵盐和6-四甲基罗丹明铵盐分别与第三溶剂混合，得到的溶液分别加入酸反应，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明。

优选地，所述制备工艺包括以下步骤：

1)5(6)-四甲基罗丹明的合成：取n,n-二甲基间胺基苯酚、偏苯酸三酐及第一溶剂混合，加入酸，在120～220℃下，反应2～8小时，过滤，即得5(6)-四甲基罗丹明(5，6-isomer,异构体混合物)；

2)5(6)-四甲基罗丹明铵盐制备：将步骤1)得到的5(6)-四甲基罗丹明加入第二溶剂溶解，加入有机胺，在25～40℃下，反应0.5～4小时，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明铵盐，滤液浓缩即得6-四甲基罗丹明铵盐；

3)5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明的制备：以步骤2)得到的5-四甲基罗丹明铵盐和6-四甲基罗丹明铵盐分别与第三溶剂混合，得到的溶液分别加入酸，在0～25℃下，反应0.5～3小时，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明；

进一步优选地，所述制备工艺包括以下步骤：

1)5(6)-四甲基罗丹明的合成：取n,n-二甲基间胺基苯酚、偏苯酸三酐及第一溶剂混合，加入酸，在140～160℃下，反应3～5小时，过滤，即得5(6)-四甲基罗丹明；

2)5(6)-四甲基罗丹明铵盐制备：将步骤1)得到的5(6)-四甲基罗丹明加入第二溶剂溶解，加入有机胺，在25～30℃下，反应1～3小时，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明铵盐，滤液浓缩即得6-四甲基罗丹明铵盐；

3)5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明的制备：以步骤1)得到的5-四甲基罗丹明铵盐和6-四甲基罗丹明铵盐分别与第三溶剂混合，得到的溶液分别加入酸，在0～25℃下，反应1.5～2.5小时，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明。

所述n,n-二甲基胺基苯酚与偏苯三酸酐的质量比为2.05～2.5:1。

步骤1)中所述第一溶剂选自乙腈、甲苯、二甲苯、氯苯或邻二氯苯中的一种，优选为邻二氯苯；

步骤1)中所述第一溶剂与偏苯三酸酐的质量比为1～20:1，优选为10～12:1。

步骤1)中所述酸选自甲磺酸、三氟甲磺酸，硫酸或磷酸中的一种，优选为甲磺酸或三氟甲磺酸

步骤1)中所述酸与偏苯三酸酐的质量比为1～10:10；优选为2～5:10。

步骤2)中所述5(6)-四甲基罗丹明、所述有机胺、所述第二溶剂的质量比为1∶2～5∶2～10；

所述有机胺选自二甲胺，二乙胺，三乙胺，正丁胺，二异丙胺或二异丙基乙基胺中的一种，优选为二异丙胺；

步骤2)中所述第二溶剂选自乙腈、四氢呋喃、二氧六环、n,n-二甲基甲酰胺或乙二醇二甲醚中的一种，优选为二氧六环。

步骤3)中5-四甲基罗丹明二异丙基胺盐或6-四甲基罗丹明二异丙基胺盐与所酸、所述第三溶剂的质量比互相独立地为1：2～5：2～10；所述酸的浓度为2～5mol/l；

步骤3)中所述酸选自盐酸，硫酸，硝酸，磷酸，甲磺酸或三氟乙酸中的一种，优选为盐酸。

步骤3)中所述第三溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或水中的一种，优选为水。

进一步地，本发明提出的一种四甲基罗丹明的制备工艺，其中，所述5(6)-四甲基罗丹明的合成后还包括5(6)四甲基罗丹明的纯化处理：

所述纯化处理具体为：将步骤1)制得的5，6-四甲基罗丹与纯化溶剂混合，搅拌，静置，过滤即得5(6)-四甲基罗丹明纯品；

优选地，所述5(6)-四甲基罗丹明的纯化具体为：将步骤1)制得的5(6)-四甲基罗丹与纯化溶剂混合，在40～80℃下，搅拌45～90分钟，室温静置12～24小时，过滤得到5，6-四甲基罗丹明纯品；

进一步优选地，所述5(6)-四甲基罗丹明的纯化具体为：将步骤1)制得的5(6)-四甲基罗丹与纯化溶剂混合，在70～80℃下，搅拌50～70分钟，室温静置12～14小时，过滤得到5，6-四甲基罗丹明纯品。

所述纯化溶剂选自乙腈、四氢呋喃、二氧六环、乙醇、或乙二醇二甲醚中的一种，优选为乙腈；

所述纯化溶剂与5(6)-四甲基罗丹明的质量比为1～10:1，优选为3～6:1。

进一步地，本发明提出的一种四甲基罗丹明的制备工艺，其中，所述5(6)-四甲基罗丹明的合成及5(6)-四甲基罗丹明的纯化在氮气气氛中进行。

作为优选方案，本发明提供的一种四甲基罗丹明的制备工艺包括以下步骤：

1)5(6)-四甲基罗丹明的合成：取n,n-二甲基间胺基苯酚、偏苯酸三酐及二氯苯混合，在氮气气氛下，加入甲磺酸，在140～160℃下，反应3～5小时，过滤，即得5(6)-四甲基罗丹明粗品；

2)5(6)-四甲基罗丹明的纯化：将步骤1)制得的5(6)-四甲基罗丹粗品与乙腈混合，在氮气气氛下，加热至70～80℃，搅拌50～70分钟，室温静置12～14小时，过滤得到5(6)-四甲基罗丹明纯品；

3)5(6)-四甲基罗丹明铵盐制备：将步骤2)得到的5(6)-四甲基罗丹明纯品加入二氧六环中溶解，加入二异丙胺，在25～30℃下，反应1～3小时，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明铵盐，滤液浓缩即得6-四甲基罗丹明铵盐；

4)5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明的制备：以步骤3)得到的5-四甲基罗丹明铵盐和6-四甲基罗丹明铵盐分别与水混合，在0～25℃下，反应1.5～2.5小时，过滤，滤饼烘干即得5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明。

本发明的至少具有如下有益结果：

1)本发明采用的是n,n-二甲基间胺基苯酚和偏苯酸三酐为原料，直接环合法合成中间体5(6)-四甲基罗丹明，与一般环合法不同的是采用的高沸点溶剂作为环合媒介，而且环合产物在溶剂中的溶解度较差，从而在反应体系中沉淀出来，从而显著的提高反应转化率和提纯的简便性。

2)本发明采用重结晶的方法，将步骤1)制得的5(6)-四甲基罗丹明粗品，能够高效的提纯。

3)本发明通过5(6)-四甲基罗丹明与有机胺成盐，并利用异构体铵盐在溶剂中溶解性的不同，从而达到分离两个异构体的目的，极大降低了分离成本，简化了操作步骤，从而使四甲基罗丹明工业化生产成为可能。

4)本发明采用酸析的方法，将制得的5-四甲基罗丹明铵盐和6-四甲基罗丹明铵盐高效转化为5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明。

5)本发明操作简便、对设备要求低、成本低，设备使用效率高等特点，达到工业化生产应用的要求。

附图说明

图1为5(6)-四甲基罗丹明核磁氢谱图

图2为5(6)-四甲基罗丹明质谱图

图3为5-四甲基罗丹明核磁氢谱图

图4为5-四甲基罗丹明质谱图

图5为6-四甲基罗丹明核磁氢谱图

图6为6-四甲基罗丹明质谱图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例所用试剂未加特别说明均为市售分析纯，使用前未经特别纯化。

实施例1

5(6)-四甲基罗丹明的合成：将4千克n,n-二甲基间胺基苯酚和2680克偏苯酸三酐，以及20l邻二氯苯加入50l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜内。抽去反应釜中的空气，通入氮气，反应体系逐渐升温至40℃，加入500克甲磺酸，反应体系升温至150℃，反应4h，观察发现有大量的固体生成，从体系中沉淀出来并黏附在反应釜内壁上。停止反应后，静置15min，反应完成。

取样检测，液相相色谱结果表明，偏苯酸三酐的转化率为99％，5(6)-四甲基罗丹明收率为82％。由反应釜下层放料口将放出邻二氯苯溶剂，加入20l甲醇至反应釜内，搅拌并缓慢加热至50℃，带溶剂将黏附在反应釜内壁上固体溶解完全，完全溶解大约需2小时，将甲醇溶液放出并浓缩，即得到4780克5(6)-四甲基罗丹明粗品。

实施例2

5(6)-四甲基罗丹明的纯化：将实施例1所得的4780克5(6)-四甲基罗丹明粗品与20l乙腈加入50l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜中。抽去反应釜中的空气，通入氮气，反应体系逐渐升温至80℃，热熔约1小时，体系中的固体溶解完全，之后停止加热，停止搅拌，静置至室温，发现有固体析出，继续静置12小时，过滤；滤液浓缩后再重复这一过程，合并两次的滤饼，用冷却的2l乙腈洗涤两次，烘干得4386克5(6)-四甲基罗丹明纯品，为墨绿色固体，收率72％，纯度97.6％，其中5-四甲基罗丹占比54.49％，6-四甲基罗丹占比43.04％。

如图1和图2所示，1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:6.983-6.988(d,4h,j＝9.3),7.052-7.077(m,4h,j＝11.2),7.129-7.137(m,4h,j＝12.3),7.535-7.555(d,2h,j＝5.9),7.978-7.982(d,1h,j＝3.7),8.411-8.431(m,1h,j＝7.8),8.920-8.923(d,1h,j＝3.5).esi-ms(m/z):431,m+。

实施例3

5，6-四甲基罗丹明铵盐制备：将实施例2制得的4300克5(6)-四甲基罗丹明纯品与43l二氧六环加入100l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜内，加热至40℃搅拌2小时，使固体充分溶解，待固体充分溶解后，停止加热，反应体系逐渐冷却至室温，滴加加入3036克二异丙胺，滴加过程，放热，控制反应体系温度不超过30℃。体系逐渐变为紫黑色溶液，滴加完毕继续搅拌1小时，体系变为紫红色悬浮液，停止搅拌，静置1小时，发现有大量红色固体析出，继续静置2小时，抽滤，其中滤饼为5-四甲基罗丹明二异丙胺盐，滤饼用5l二氧六环洗涤后，在60℃下干燥5h，得到5-四甲基罗丹明二异丙胺盐2434g。

合并滤液，其中滤液中5-四甲基罗丹明二异丙胺盐占15.71％，6-四甲基罗丹明二异丙胺盐占80.77％；浓缩旋干滤液，重复以上操作一次，得到5-四甲基罗丹明二异丙胺盐115g，合并得到2549克，收率88％，hplc＝97.8％。母液浓缩旋干后用25l乙腈打浆得到6-四甲基罗丹明二异丙胺盐2080克，收率91％，hplc＝98.6％.

如图3和图4所示，1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:6.985(s,2h),7.072-7.078(dd,2h,j＝8.7),7.130-7.153(dd,2h,j＝10.3),7.534-7.554(d,1h,j＝5.7),8.425-8.449(d,1h,j＝7.8),8.919(s,1h).esi-ms(m/z):431,m+。

hplc97.37％，收率为：86％。

实施例4

5-四甲基罗丹明和6-四甲基罗丹明的制备：将实施例3制得的2549克5-四甲基罗丹明二异丙胺盐,8l水加入25l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜，25℃搅拌1小时，使固体充分溶解，待固体充分溶解后，滴加加入4l3mol/l盐酸，有红色固体析出，滴加完毕继续搅拌1小时，抽滤，得到粘稠状褐红色固体5-四甲基罗丹明1775克。

将实施例3制得的2080克6-四甲基罗丹明二异丙胺盐与7l水加入25l带有温度计和搅拌的玻璃反应釜，25℃搅拌1小时，使固体充分溶解，待固体充分溶解后，滴加加入3.l3mol/l的盐酸，有红色固体析出，滴加完毕继续搅拌1小时,抽滤，得到粘稠状褐红色固体6-四甲基罗丹明1465克。

如图5和图6所示，1h-nmr:(400mhz,cd3od,ppm)δ:6.972(s,2h),7.112-7.148(d,2h,j＝8.3),7.160-7.178(d,2h,j＝8.7),7.975(s,1h),8.404-8.412(d,2h,j＝5.3).esi-ms(m/z):431,m+。

hplc98.89％，收率为：87％。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。