本发明涉及医药，特别是一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其应用。
背景技术：
植物雌激素是来源于植物，与哺乳动物的类固醇激素—17β-雌二醇有相似结构的多羟基化合物。天然的植物雌激素相比于合成的雌激素，其雌激素样活性要低，但是所引起的乳腺癌、子宫内膜癌等副作用也更少，使用会更安全。因此对含有植物雌激素的研究逐渐成为热点。
葶苈子为常用中药材，始载于《神农本草经》，列为下品，该药味辛、苦，性大寒，归肺与膀胱经，具有宣泄平喘、行水消肿的功效。2015版《中国药典》收录的“葶苈子”有南北之分，其中十字花科植物独行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟种子习称“北葶苈子”，而播娘蒿descurainiasophia(l.)webbexprantl.的干燥成熟种子习称“南葶苈子”。虽然南北葶苈子都做正品葶苈子用，但其植物来源、外观性状和药理活性均有所差异。更未有关于从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物及其在制备雌激素药物中应用的公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其应用，可有效解决从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物及其在制备治疗雌激素缺乏症的药物问题。
本发明解决的技术方案是，一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，将炒北葶苈子7.5-8.5kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，减压浓缩至260-280g的浸膏，浸膏用体积浓度为80％的乙醇19-21l醇沉2h，弃沉淀，将上清液离心过滤，浓缩至无醇味(约1000ml)，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脱，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脱部位，用水离散溶解，离心过滤，浓缩至30-40ml，过toyopearlhw-40色谱柱，依次用水3l和体积浓度10％甲醇水溶液3l洗脱，流速8ml/min，收集体积浓度10％甲醇水溶液洗脱部分，用甲醇溶解，静置24h，析出无色结晶，将上层溶液吸出，无色结晶干燥，再次用甲醇溶解，静置24h，如此反复5次，得无色结晶即为2-苯乙酰胺，质量含量达到95％以上。
该制备物2-苯乙酰胺可有效用于制备治疗雌激素缺乏症的药物，实现2-苯乙酰胺作为唯一活性成分在制备治疗雌激素缺乏症药物中的应用。
本发明方法新颖独特，易操作，可有效用于从北葶苈子中制备2-苯乙酰胺，并有效用于制备治疗雌激素缺乏症的药物，开拓了治疗雌激素缺乏症的新途径，开拓了北葶苈子的药用价值和商业价值，有良好的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，将炒北葶苈子8kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，减压浓缩至270g的浸膏，浸膏用体积浓度为80％的乙醇20l醇沉2h，弃沉淀，将上清液离心过滤，浓缩至1000ml(无醇味)，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脱，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脱部位，用水离散溶解，离心过滤，浓缩至35ml，过toyopearlhw-40色谱柱，依次用水3l和体积浓度10％甲醇水溶液3l洗脱，流速8ml/min，收集体积浓度10％甲醇水溶液洗脱部分，用甲醇溶解，静置24h，析出无色结晶，将上层溶液吸出，无色结晶干燥，再次用甲醇溶解，静置24h，如此反复5次，得无色结晶即为2-苯乙酰胺，质量含量达到95％以上。
实施例2
本发明在具体实施中，一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，将炒北葶苈子7.5kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，减压浓缩至260g的浸膏，浸膏用体积浓度为80％的乙醇19l醇沉2h，弃沉淀，将上清液离心过滤，浓缩至无醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脱，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脱部位，用水离散溶解，离心过滤，浓缩至30ml，过toyopearlhw-40色谱柱，依次用水3l和体积浓度10％甲醇水溶液3l洗脱，流速8ml/min，收集体积浓度10％甲醇水溶液洗脱部分，用甲醇溶解，静置24h，析出无色结晶，将上层溶液吸出，无色结晶干燥，再次用甲醇溶解，静置24h，如此反复5次，得无色结晶即为2-苯乙酰胺，质量含量达到95％以上。
实施例3
本发明在具体实施中，一种从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，将炒北葶苈子8.5kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，减压浓缩至280g的浸膏，浸膏用体积浓度为80％的乙醇21l醇沉2h，弃沉淀，将上清液离心过滤，浓缩至无醇味(约1000ml)，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脱附树脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脱，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脱部位，用水离散溶解，离心过滤，浓缩至40ml，过toyopearlhw-40色谱柱，依次用水3l和体积浓度10％甲醇水溶液3l洗脱，流速8ml/min，收集体积浓度10％甲醇水溶液洗脱部分，用甲醇溶解，静置24h，析出无色结晶，将上层溶液吸出，无色结晶干燥，再次用甲醇溶解，静置24h，如此反复5次，得无色结晶即为2-苯乙酰胺，质量含量达到95％以上。
实施例1-3所制备的无色结晶，经液相色谱法测定，鉴定为2-苯乙酰胺，并经实验，具有雌激素样作用，有效用于制备治疗雌激素缺乏症药物，并经实验得到了充分证明，有关资料如下：
1仪器与材料
核磁共振用brukeravanceⅲ500核磁共振仪(tms内标)(bruker)，红外光谱用nicoletis10microscopespectrometer(thermoscientific,usa)，高分辨质谱用brukermaxishdmassspectrometer，紫外光谱用shimadzuuv-2401pcapparatus，高效液相色谱用watersalliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，empower3色谱数据工作站，lc50型高压制备液相色谱仪，uv200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，ymc-packods-a色谱柱(250×10mm.d.s-5mm,12mm)(ymc有限公司)，其余有n-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，a-1000s型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，n-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，fdu-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，dfz-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，ab204-n万分之一精密分析天平(mettlertoledo)，imark型酶标仪(美国bio-rad)，二氧化碳培养箱(上海stik)，超净工作台(苏净集团)，arium611vf超级组合型超纯水器(sartorius)，倒置显微镜(nikon)，pb-10酸度计(德国赛多利斯集团)。
柱层析填料diaionhp-20、mcigelchp-20(日本三菱化学公司)，toyopearlhw-40(日本tosoh公司)，sephadexlh-20(parmaciabiotech公司)，柱层析所用硅胶h(160-200目)为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。去雌激素胎牛血清(广州四季青)；无酚红dmem高糖培养基、葡聚糖-活性炭去激素胎牛血清(hyclone)；17β-雌二醇(17β-estrogen，e2)、氨苄青霉素、tris碱(sigma)；戊酸雌二醇片(拜耳医药)；edta、mtt及dmso(amresco)；e2、fsh、lhelisa试剂盒(r&d)。
清洁级昆明种小鼠，雌性，出生21天(刚断乳)，体重9～12g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：scxk(京)2016-0011)。人乳腺癌细胞(mcf-7)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
北葶苈子于2014年采自河南南阳，经河南中医学院陈随清教授及董诚明教授鉴定为十字花科植物独行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟种子。
2实验药物
本发明方法从炒北葶苈子中制备的2-苯乙酰胺。
3实验方法
3.1小鼠子宫增重实验
将小鼠按体重均衡和随机的原则分组，持续给药7天。正常组每日蒸馏水0.02ml/g灌胃；阳性对照组隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；北葶苈子中提取2-苯乙酰胺按0.5mg/10g/d，配成混悬液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次给药24h后，摘眼球取血，脱颈椎处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数(子宫湿重×(体重)-1×100％)。实验平行重复三次。结果与正常组相比，计算p值，考察有无统计学意义。
3.2mcf-7细胞增殖实验
mcf-7细胞经含5％去雌激素胎牛血清的无酚红dmem培养基培养1周后，选取对数生长期细胞，pbs洗两次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入无酚红dmem培养基吹打均匀，以2×104个/ml的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μl。培养24h待细胞贴壁后，换为含北葶苈子中提取2-苯乙酰胺培养液(10μm)继续培养。37℃、5％co2培养48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150μldmso，震荡5-10min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值(a)，计算平均a值和细胞活力。实验平行重复三次。
细胞活力＝各组od值/正常组od值
3.3elisa法检测血清e2、lh、fsh
小鼠摘眼球取血，血液室温静置1h后，3000转离心10min，取上清。按照elisa试剂盒说明书仔细操作。
4统计处理
实验数据以
5实验结果
5.1北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响
与正常组相比，北葶苈子中提取2-苯乙酰胺能显著诱导性未成熟雌性小鼠子宫系数的增加(p<0.05)。提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体内具有雌激素样作用。见表1。
表1北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对性未成熟雌性小鼠子宫系数的影响
注:与正常组比较，表示p<0.05，表示p<0.01。
5.2北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对mcf-7细胞促增殖作用
北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在10μm时与正常组比，对mcf-7细胞有显著的促增殖作用(p<0.05)。提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体外具有雌激素样作用。见表2。
表2北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对mcf-7细胞增殖的影响
5.3北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对血清e2、lh、fsh的影响
与正常组相比，北葶苈子中提取2-苯乙酰胺能显著增加小鼠血清e2、lh的水平，但基本不影响血清fsh的水平(p<0.05)。提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体具有雌激素样作用，可能与其增加体内e2以及lh的水平有关。见表3。
表3北葶苈子中提取2-苯乙酰胺对血清e2、lh、fsh的影响
注:与正常组比较，表示p<0.05，表示p<0.01。
子宫中含有大量的雌激素受体(ers)，雌激素类物质通过与该受体结合，可诱导子宫靶蛋白(ips)含量增加，表现为子宫组织增生等，因此可以通过测定外源雌激素对性未成熟小鼠子宫促增长作用来评价药物的雌激素样活性。本实验采用性未成熟雌性小鼠子宫湿重与体重之比(子宫系数)作为评价雌激素样活性的指标。实验结果表明，从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物可显著增加性未成熟小鼠子宫系数，而北葶苈子生品不能显著增加性未成熟小鼠子宫系数。提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体内具有雌激素样作用。
mcf-7细胞是雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株，能特异地受雌激素或雌激素样活性物质调节而增殖，是最常用的检测雌激素样活性的细胞株。实验结果发现，北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在浓度为10μm时对mcf-7细胞有显著的促增殖作用。提示北葶苈子中提取2-苯乙酰胺在体内、体外均有一定的雌激素样作用。
雌二醇是体内主要由卵巢成熟滤泡分泌的一种天然雌激素，能促进和调节女性性器官及副性征的正常发育。促黄体生成素由垂体产生的一种激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，主要作用为促进卵泡成熟，促进整个卵巢长大。研究发现，北葶苈子中提取2-苯乙酰胺可以显著性增加未成熟雌性小鼠的血清e2以及lh的水平，但对fsh的影响不大。推测北葶苈子中提取2-苯乙酰胺增加小鼠子宫系数发挥雌激素样活性可能与其增加体内e2以及lh的水平有关。
实验证明，从北葶苈子中提取2-苯乙酰胺化合物作为唯一活性成分有效用于制备雌激素药物，实现2-苯乙酰胺作为唯一活性成分在制备雌激素药物中的应用，开拓了制备雌激素类药物的新途径，提高了北葶苈子的药用价值和商业价值，有良好的经济和社会效益。