本发明涉及肺癌超早期筛查检测
技术领域：
，特别是一种以血浆游离dna为基础的针对肺癌0期及i期的无创筛查技术。
背景技术：
：据全国肿瘤登记中心的最新的数据显示，全国肺癌新发病例约73.3万例，位居所有恶性肿瘤发病率的第一位(19.9％)；死亡病例约59.1万，占全部恶性肿瘤死亡病例的第一位(26.5％)。在当前的医疗体系下，中晚期肺癌患者五年的生存率仅为10-20％，但对于早期肺癌病人的治疗，通过手术切除的方法约有80-90％以上可以治愈。因此肺癌早筛意义重大，有效的早期筛查和干预治疗可使肺癌的发生率下降60％，病死率下降80％。然而绝大多数的早期肺癌(尤其是0期和i期)患者无任何明显的临床症状。患者在初次诊断出肺癌时，85％为中晚期，早期诊断的比例仅约14％。早期肺癌没有明显的临床症状，待出现相关临床症状时已是肺癌的中晚期，只有约15.8％的患者生存期能达到五年以上，此时病人的临床症状较为明显，相关的体外辅助诊断已无太大意义。“防患于未然”是当前精准医疗及医疗大数据时代背景下的核心目标。肺癌的早期发现、早期诊断、早期治疗是降低肺癌死亡人数的重要措施。然而当前肺癌的超早期诊断技术极具挑战，有诸多技术难点尚未克服。目前对于肺癌早期筛查的方法有多种，比如低剂量ct诊断、组织细胞层面的肺癌诊断、基因层面的肺癌诊断等。但这些技术手段存在诸多弊端：低剂量ct检测存在较多的假阳性，并且检测成本高；组织层面的肺癌诊断在取样方面会给患者带来较大痛苦，且有可能导致癌细胞扩散或转移；基因层面的肿瘤特异性分子标志物检测可作为肺癌早期诊断的一种手段，但技术尚未成熟。液态活检是一种极具临床应用前景的无创检测技术，可以通过采血来检测血液中游离ctdna，而在肿瘤早期筛查的临床应用中最重要的是寻找与早期肺癌相关性强的肿瘤标志物，通过基因检测的技术手段实现早期发现肿瘤的目的。近几年，多个临床实验结果表明，肿瘤发生过程中某些特定基因的甲基化程度可作为肿瘤诊断的一种分子标志，并且这种改变是肿瘤所特有的。dna甲基化发生在肿瘤的早期阶段，因而能够在肿瘤形成初期利用基因检测手段提前发现，为之后的预防、治疗、疾病监控以及预后提供一个直观的潜在指标。在本发明中，我们采用检测血液中的循环肿瘤dna(ctdna)中与早期肺癌相关基因的甲基化状态判断是否发生肿瘤。dna甲基化是表观遗传学水平基因表达、细胞发育和细胞分化等过程调控的重要方式。异常的dna甲基化在癌症发生过程中有重要作用。dna甲基化主要发生在-c-磷酸-g-(cpg)位点。以肺癌组织或细胞为对象的甲基化研究均发现，shox2和ptger4基因cpg岛的甲基化水平比正常组织或细胞明显升高，即超甲基化现象。另外，有报道显示，癌症相关基因在不同时期的癌症以及不同恶性程度的肿瘤中发生超甲基化的dna靶序列有差异，说明早期肺癌的发生具有一定的序列特异性。本专利涉及两个肺癌相关的标志物：1、人矮小同源盒基因shox2(shortstaturehomebox2)是同源盒基因家族的一员，其表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要的作用。有研究发现，96％的肺癌患者shox2发生高度甲基化，并且与基因拷贝数明显相关。并且最新的研究表明，shox2基因的甲基化与肺癌密切相关，这也提示了shox2基因的甲基化可能成为肺癌的早期筛查指标。并且有相关研究表明在-800bp到-900bp、-1550bp到-1650bp和+2700bp到+2800bp等几个位点shox2基因发生甲基化的概率较高。2、前列腺素e受体基因ptger4(prostaglandinereceptor4gene)甲基化程度与肺癌的发生密切相关，并且与shox2基因联合检测，能够提高肺癌检出率以及准确性。对于ptger4基因与肺癌发生密切相关的甲基化区域位于第二外显子3’末端区域的部分序列。dna异常甲基化是人类肿瘤常见的改变。发生在启动子区以及基因内部的cpg岛异常甲基化是基因失活的最常见机制。目前检测dna甲基化检测方法有：甲基化特异性的pcr(methylation-specificpcr，msp)、亚硫酸氢盐测序法(bisulfitesequencingpcr，bsp)、高分辨率熔解曲线法(highresolutionmelting，hrm)和高通量测序方法等。相对于其他的检测方法而言，亚硫酸氢盐测序法(bisulfitesequencingpcr，bsp)是dna甲基化检测中的“金标准”，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。高分辨率熔解曲线法(highresolutionmelting，hrm)在pcr扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断dna是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂。高通量测序检测方法主要是涉及到的成本太高，不利于临床上的推广。随着对肿瘤研究的深入，逐渐发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为：肿瘤具有异质性，对于癌细胞已经发生转移的患者而言，仅仅取某个部位的肿瘤组织，并不能反映患者的整体情况，但对所有的肿瘤组织都取样检测又不切实际；某些患者自身的情况决定了他不适合做组织活检；受到手术的扰动之后，有些肿瘤有加速转移的风险；组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。因此对于癌症的诊断和检测技术有更高的要求。液态活检技术的出现，解决了上述的问题，也提前了癌症的诊断时间。液态活检是一种技术，更是一种临床解决方案。在液态活检的背景下可以有很多应用，包括临床和面对消费者。当前基因检测的靶点主要包括dna的突变、基因扩增、基因融合、缺失/插入等，这种是一种不可逆的变化。而dna的变化远远不止这些，一些表观修饰会对基因功能产生影响，进而影响细胞功能和个体健康，如基因启动子区的甲基化发生在多数情况下会抑制转录因子与启动子的结合，激活或抑制基因的功能。拿一个常见的例子说明，很多人喜欢健身塑体，在肌肉的强化过程中，就包含了特定基因的甲基化动态变化过程。这种动态监测过程，不可能多次获取组织，通过无创的液态活检可以实现多次、实时的监控。我们会逐渐发现这种技术会在很多层面的应用。液态活检的优势就在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，而且有效延长患者生存期，性价比高。相对组织较易获得，且对患者无创。但血浆中肿瘤循环dna的量较少，且易发生降解。因此，检测血浆中基因的甲基化难度相对较大，不仅需要得到高质量的肿瘤循环dna以及高质量的重亚硫酸盐转化后dna，而且需要将基因的甲基化高灵敏度、高准确度地检测出来。因此，对于此类检测试剂盒的开发需要具备两个方面的要求：高特异性以及高灵敏度。技术实现要素：本发明的目的是提供一种针对肺癌早期检测具有高灵敏度和特异性的组合物及其试剂盒，通过检测肺癌高风险人群血液中游离dna的shox2基因和ptger4基因启动区、基因编码及非编码区域中的3个目标位点甲基化情况来筛查早期肺癌患者，并辅助肺癌的早期诊断。对于甲基化特异性的pcr(methylation-specificpcr，msp)检测方法，操作简便、耗时较短，结果易于分析。为了实现上述目的，本发明提供的一种用于早期肺癌无创筛查的组合物，所述组合物包括分别用于检测待检样品中与早期肺癌相关的甲基化区域的3个shox2基因的核酸序列、3个ptger4基因的核酸序列和1个内参基因的核酸序列，其中，针对shox2基因的3对甲基化特异性引物、针对ptger4基因的3对甲基化特异性引物和1对内参基因引物的序列如下：shox2基因1正向引物f：tgatgtttttttgtcggag，shox2基因1反向引物r：tcaaaacaaaaaaccgc；shox2基因2正向引物f：gtttgtatttttttcgat，shox2基因2反向引物r：cacgaataataaaacgaat；shox2基因3正向引物f：ttttttgggtagttaatatgg，shox2基因3反向引物r：ccaaataatctccgtcc；ptger4基因1正向引物f：tagttttgtcgcgttttagptger4基因1反向引物r：taaccatctaaatctcgacgptger4基因2正向引物f：gaggtagcggggtggtttptger4基因2反向引物r：acctcgctaaacaccgaacaaptger4基因3正向引物f：gttttcgggttattggtttptger4基因3反向引物r：accgacctattaaacacttt内参基因(β-actin)正向引物f：gtgatggaggaggtttag，内参基因(β-actin)反向引物r：aaattacaaaaaccacaa。优选地，所述组合物还包括shox2基因的3个甲基化位点对应的mgb探针、ptger4基因的3个甲基化位点对应的mgb探针以及内参基因对应的mgb探针，具体核苷酸序列如下：shox2基因1探针：fam-agcgacgttgcgt-mgb-bhq1；shox2基因2探针：fam-ttcggttcgtaggt-mgb-bhq1；shox2基因3探针：fam-tgcgatttcggtcg-mgb-bhq1；ptger4基因1探针：cy5-ttcggcgtcgtcg-mgb-bhq2ptger4基因2探针：cy5-gcggtcgcggtcg-mgb-bhq2ptger4基因3探针：cy5-cgtggcgatggttatcmgb-bhq2内参基因(β-actin)探针：vic-caccacccaacacacaat-mgb-bhq1；其中探针序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。优选地，所述组合物还包括shox2基因的3个非甲基化目的基因对应的mgb探针和ptger4基因的3个非甲基化目的基因对应的mgb探针，具体核苷酸序列如下：shox2基因1简并封闭引物：agygaygttgygt-cy3-spacer；shox2基因2简并封闭引物：ttyggttygtaggt-cy3-spacer；shox2基因3简并封闭引物：tgygatttyggtyg-cy3-spacer；ptger4基因1简并封闭引物：ttyggygtygtyggagt-cy3-spacer；ptger4基因2简并封闭引物：tygaggyggtygyggtyg-cy3-spacer；ptger4基因3简并封闭引物：aygtggygatggttatyggg-cy3-spacer；其中探针序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。用于早期肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒，包括shox2基因的3对甲基化特异性引物和ptger4基因的3对甲基化特异性引物及1对内参基因引物、还包括shox2基因的3个甲基化位点对应的mgb探针和ptger4基因的3个甲基化位点对应的mgb探针以及内参基因对应的mgb探针，还包括shox2基因的3个非甲基化目的基因对应的mgb探针和ptger4基因的3个非甲基化目的基因对应的mgb探针。优选地，所述试剂盒包括pcr反应液、udg酶。优选地，所述pcr反应液包括dnataq聚合酶、dntps和mg2+、10×dna聚合酶buffer。优选地，其判读方法为，所检测shox2和ptger4基因至少两个位点发生甲基化或者shox2和ptger4至少有一个位点同时发生甲基化，用于评估早期肺癌的发生。用于早期肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒的样本处理方法，包括：(1)提供样本，所述样本来源于健康人、肺癌高危人群以及早期肺癌患者的外周血或者分离得到的血浆；(2)由步骤(1)中血浆样本进行游离dna的提取，进行dna质量监控，选取od260/280在1.8～2.0之间的dna；(3)由步骤(2)中得到的游离dna，进行重亚硫酸盐转化，使dna中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到bis-dna；(4)由步骤(3)中得到的bis-dna为模板，使用权力要求1-3中任一项所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物进行pcr扩增。优选地，步骤(4)中pcr扩增，优选地，pcr混合物包括75-150ngbis-dna模板和200-400nm引物，100-300nm探针，1utaq聚合酶，1-10mm的mgcl2等，所述pcr反应过程为：37℃下udg酶反应2min，95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火延伸35s，45个循环。本发明提供的一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用,具有如下有益效果。本发明试剂盒检测shox2和ptger4基因甲基化的位点不仅包括基因的启动子区域，还包括基因的编码区域和非编码区，这样进行多区域检测有利于发现与早期肺癌高度相关的shox2基因和ptger4基因的靶序列，同时也能够提高检测的准确性及特异性，提高shox2和ptger4基因甲基化的检出率。该试剂盒在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性，具有检测特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点，这样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防以及采取相应的治疗措施。本发明试剂盒主要采用taqman-mgb探针检测的手段，通过探针与甲基化序列特异性结合，以及优化的反应体系，对shox2和ptger4基因甲基化位点精确检测。对比于用pcr特异性引物进行检测的方法，利用探针对甲基化位点进行识别，具有更高的灵敏度、精准性。并且在mgb探针的基础上，引入简并封闭引物技术。本发明采用这种技术进行相关基因的甲基化检测，通过无创的液态活检，操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个pcr过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。试剂盒检测的高灵敏性适用于肺癌的早期筛查。附图说明图1为实施例1的检测结果。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。实施例1：检测i期肺癌患者血浆游离dna中shox2和ptger4基因的甲基化。试剂盒组分如下表：选取5个健康人的血浆样本，以及已知病理信息为肺癌i期的5个肿瘤血浆样本。1、对上述10例血浆样本进行提取游离dna。2、游离dna提取完成，对提取好的dna进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞嘧啶(c)转变为尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶(c)不变。得到纯化好的bis-dna。3、配制pcr反应液：dna聚合酶、dntps、mg2+、10×dna聚合酶buffer、shox2和ptger4基因1引物探针、shox2和ptger4基因2引物探针、shox2和ptger4基因3引物探针、内参基因引物探针、shox2和ptger4基因1简并封闭引物、shox2和ptger4基因2简并封闭引物、shox2和ptger4基因3简并封闭引物。4、pcr反应条件为：37℃udg酶反应2min；95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火延伸35s，45个循环；5、pcr反应体系的配置dnapcr扩增mix:组分一人份加入量(μl)dna聚合酶0.25dntps2mg2+3-3.510×dna聚合酶buffer2.5udg酶0.1dutp0.01pcr扩增反应体系:组分一人份加入量(μl)dnapcr扩增mix12.5shox2基因1/2/3-f(10μm)0.5shox2基因1/2/3-r(10μm)0.5shox2基因1/2/3-fp(10μm)0.2ptger4基因1/2/3-f(10μm)0.5ptger4基因1/2/3-r(10μm)0.5ptger4基因1/2/3-fp(10μm)0.2shox2基因blocker1/2/3(20μm)0.2ptger4基因blocker1/2/3(20μm)0.2内参基因-f(10μm)0.3内参基因-r(10μm)0.3内参基因-fp(10μm)0.2纯化水6.9模板2pcr扩增程序如下：第一扩增阶段：37℃udg酶反应2min；第二扩增阶段：95℃预变性3min；第三扩增阶段：94℃变性15s，60℃退火延伸35s，45个循环；信号收集，第三阶段60℃收集fam、vic以及cy5信号。6、检测结果分析利用上述反应体系对10例样本进行检测，检测结果如图1所示。显示本发明试剂盒能够准确检出5例肺癌i期阳性样本，目的基因1/2/3ct值与内参基因ct值之差均小于8，说明shox2和ptger4基因发生甲基化。对剩下的5例阴性样本没有扩增曲线，目的基因1/2/3ct值与内参基因ct值之差均大于8，说明shox2和ptger4没有发生甲基化。7、结果判读分析(如表1)1)满足内标通道有s型扩增曲线，且ct值≤32，shox2和ptger4基因通道无s型扩增曲线或ct值＞40，△ct值＞8，且则判定结果为阴性；2)满足内标通道有s型扩增曲线，且ct值≤32，shox2或ptger4基因通道至少两个甲基化区域检测ct值≤40，△ct值≤8，则判定结果为阳性；3)满足内标通道有s型扩增曲线，且ct值≤32，shox2和ptger4基因通道至少有一个甲基化区域同时满足检测ct值≤40，△ct值≤8，则判定结果为阳性；4)若内标通道无s型扩增曲线或ct值＞32，则判定结果无效，建议重新提取样本进行检测。表1结果判读参考实施例2：收集来自上海肺科医院的93例早期肺癌患者(0期27例，i期66例)的血浆样本和来自山东齐鲁医院的100例正常人血浆样本，对这193例血浆样本进行shox2和ptger4基因甲基化的检测，具体操作步骤如实施案例1所述。100例正常血浆样本检测结果中，95例样本的目的基因1/2/3ct值与内参基因ct值之差均大于8，特异性达到95％；而对于93个早期肺癌血浆样本，检测出88例样本结果目的基因1/2/3ct值与内参基因ct值之差均小于8，其敏感性达到95％，其中0期肺癌为89％，i期肺癌为97％。本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司<120>一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用<130>p20170065<160>27<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tgatgtttttttgtcggag19<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<400>2tcaaaacaaaaaaccgc17<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3gtttgtatttttttcgat18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4cacgaataataaaacgaat19<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5ttttttgggtagttaatatgg21<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6ccaaataatctccgtcc17<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7tagttttgtcgcgttttag19<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8taaccatctaaatctcgacg20<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<400>9gaggtagcggggtggttt18<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10acctcgctaaacaccgaacaa21<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11gttttcgggttattggttt19<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12accgacctattaaacacttt20<210>13<211>18<212>dna<213>人工序列<400>13gtgatggaggaggtttag18<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列<400>14aaattacaaaaaccacaa18<210>15<211>13<212>dna<213>人工序列<400>15agcgacgttgcgt13<210>16<211>14<212>dna<213>人工序列<400>16ttcggttcgtaggt14<210>17<211>14<212>dna<213>人工序列<400>17tgcgatttcggtcg14<210>18<211>13<212>dna<213>人工序列<400>18ttcggcgtcgtcg13<210>19<211>13<212>dna<213>人工序列<400>19gcggtcgcggtcg13<210>20<211>16<212>dna<213>人工序列<400>20cgtggcgatggttatc16<210>21<211>18<212>dna<213>人工序列<400>21caccacccaacacacaat18<210>22<211>13<212>dna<213>人工序列<400>22agygaygttgygt13<210>23<211>14<212>dna<213>人工序列<400>23ttyggttygtaggt14<210>24<211>14<212>dna<213>人工序列<400>24tgygatttyggtyg14<210>25<211>17<212>dna<213>人工序列<400>25ttyggygtygtyggagt17<210>26<211>18<212>dna<213>人工序列<400>26tygaggyggtygyggtyg18<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27aygtggygatggttatyggg20当前第1页12