一株小单孢菌属放线菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物肥料及农作物逆境保护研究领域，涉及一株小单孢菌属放线菌及其应用。
背景技术：
：土壤盐碱化是当前威胁全球农业生产及农作物产量的主要非生物胁迫因素之一，目前全球近50％的灌溉土地都受到不同程度的盐胁迫威胁。据统计，全世界盐碱土面积约占土地总面积的7％左右，并有逐年增加的趋势。我国盐渍化土壤面积约为1.0×108hm2，约占土地总面积37％。土壤盐渍化不仅影响植物代谢和光合作用，而且能够降低植物对土壤养分和微量元素的摄入。已有研究表明，nacl是盐渍化土壤最主要的成分，在其胁迫下植物会出现营养失衡、渗透功能受损和活性氧过量，进而导致膜完整性破坏、光合电子传递系统失活、激素平衡破坏、生物量积累下降甚至细胞死亡。因此，如何改良盐碱化土壤、以及保护并提高重要的经济农作物抵抗盐胁迫已成为目前急需解决的问题之一。目前，对于土壤盐渍化主要采用农业措施、水利工程和化学改土等传统措施，但这些措施均存在投入大、周期长和见效慢等缺点。目前主要的生物改良方法措施是培育并种植耐盐碱的作物，如种植甜菜、玉米、大豆，以及耐盐植物碱篷、柽柳等，此外还有耐盐转基因植物的研究，但是该类方法往往周期长、花费巨大，而且植物转基因方法还未被社会广泛接受认可。鉴于此，近年来利用植物有益微生物提高植物耐盐性和改良土壤盐碱化水平已有相关研究，植物有益微生物不仅可以促进植物生长发育和提高产量，而且可以提高作物耐受逆境条件的能力，但目前研究较多的植物促生菌为细菌以及菌根真菌等真菌资源，而有关放线菌尤其是非链霉菌属的稀有放线菌提高作物在盐胁迫下生长及相关菌剂研究鲜有报道。小麦是我国的主要粮食作物，具有广泛的种植区域，但是对于大面积的盐碱土地，如何提高小麦的盐环境适应能力和产量是目前在盐碱地种植小麦亟待解决的问题。微生物具有体积小、生长快、易控制等优势，而放线菌是能够产生活性物质最多的微生物，已经在医药开发、农林业保护等领域中得到了广泛应用。因此，从盐碱地土著生长的植物根际土壤中获取具有耐盐并促进小麦在盐胁迫下生长的放线菌，对于提高小麦的抗盐能力、促进小麦在盐碱地的生长与耐受能力，对于扩大小麦的种植面积、改善盐渍化土壤具有重要意义。目前有关小单孢菌属的稀有放线菌对于小麦盐胁迫下促生长的研究还未见有报道。技术实现要素：本发明的目的是针对上述技术问题，提供一株放线菌桔橙小单孢菌。本发明的另一目的是提供包含放线菌桔橙小单孢菌的小麦耐盐促生剂。本发明的又一目的是提供放线菌桔橙小单孢菌在小麦抗盐生长过程中的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现：一方面，本发明提供一株放线菌桔橙小单孢菌，其特征在于，该菌种属放线菌桔橙小单孢菌于(micromonosporaaurantiaca)，代号rs019，2017年5月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc60177。进一步的，所述的放线菌桔橙小单孢菌于(micromonosporaaurantiaca)，代号rs019的16srrna基因序列如seqidno.1所示。进一步的，所述的放线菌桔橙小单孢菌于(micromonosporaaurantiaca)，代号rs019生长初期表面呈橘色，后期颜色逐渐变深至黑色；扫描电镜下可清晰地观察到孢子单生、无柄，或着生在孢子梗上，孢子梗时常分枝成簇。进一步的，所述的rs019的菌种能够产生吲哚乙酸，能够产氮，固氮；小麦抗盐生长过程中的应用。一方面，本发明提供一种含有权利要求1所述的保藏号为gdmcc60177的rs019菌株的小麦耐盐促生剂；含rs019菌株的小麦耐盐促生剂在小麦抗盐生长过程中的应用。一方面，本发明提供一种包含放线菌桔橙小单孢菌的小麦耐盐促生剂，其特征在于，是通过以下方法生产而成：1)将保藏编号为gdmcc60177的放线菌桔橙小单孢菌rs019，接种于250ml的isp2液体培养基中(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)；2)28℃，150rpm摇瓶培养3天后，待菌体生长至对数生长期时8000rpm离心收集菌体；3)用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，菌体浓度约为105-106cfu/ml，即为所述的小麦耐盐促生剂。另一方面，所述的rs019的菌种在促进小麦生长过程中的应用。发明详述：本发明通过对海岸带根际土壤放线菌的分离和耐盐及促生长特征的筛选，获得一株较强耐盐促生活性的菌株，编号为rs019。通过形态特征、生理生化以及16srrna基因测序与系统发育分析，确定了其分类学地位。通过平皿种子萌发以及盆栽实验验证，采用本发明提供的放线菌桔橙小单孢菌micromonosporaaurantiacars019，具有促进小麦在盐胁迫种子萌发和幼苗生长、显著提高其盐胁迫下的适应能力，该方法可发酵用于菌肥，提高小麦的耐盐能力，促进小麦在盐碱地的种植。分离菌株为桔橙小单孢菌，代号为rs019，该菌株于2017年5月5日在广东省微生物菌种保藏中心登记保藏，保藏编号为gdmcc60177。同时本发明提供了该桔橙小单孢菌的16srrna基因序列(1393bp)，基于序列如seqidno.1所示。此外，本发明提供了桔橙小单孢菌rs019的菌悬液制备方法，具体步骤为：挑取在isp2固体平板上生长3-5天的桔橙小单孢菌rs019单菌落，接种于250ml的isp2液体培养基中(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm摇瓶培养3天后，待菌体生长至对数生长期时8000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，菌体浓度约为105-106cfu/ml。同时提供了上述菌悬液的催芽与施肥方法，包括以下步骤：对小麦种子进行表面消毒，首先用有效氯含量为5％的naclo浸泡3min后，用无菌水漂洗4-5次；然后用75％的酒精浸泡5min，用无菌水漂洗数次至种子表面不发黄，最后用上述制备的rs019菌悬液浸泡24h，同时以无菌水处理作为对照。将浸泡后的种子在超净工作台中放入加有两层滤纸的无菌平板上，加入15ml无菌水，放于28℃恒温培养箱中培养，5天后平皿中加入10ml浓度为100mmnacl盐胁迫处理。12天后观察并记录小麦种子的萌发情况。采用营养土与蛭石以体积比4:1混合得到盆栽基质，然后于121℃灭菌一小时，冷却后分装至盆栽花盆中(9cm长×9cm宽×9cm高)，每盆约200g。选取长势一致的小麦幼苗，移栽含营养土的花盆中，放于温室中生长(温度为25℃，每天光照12h，无光照12h交替)，用50ml无菌水和菌液浇灌小麦每盆幼苗，每周浇灌2次，以浇无菌水的小麦幼苗作为对照；3周以后，用2％的nacl溶液进行盐胁迫灌根处理，每周灌根一次，连续灌根3次。平皿上小麦种子催芽实验可以发现盐胁迫的对照组小麦苗已经发黄，而接菌组小麦幼苗鲜绿、长势明显更好。在nacl浓度为100mm条件下，对照组发芽率为29.3％，用桔橙小单孢菌rs019菌悬液浸种的小麦发芽率为58％，为对照组的近两倍。以盐胁迫30天的盆栽测量结果统计可以发现，接种桔橙小单孢菌rs019后小麦在0、2％nacl处理下鲜重分别提高了61.5％、27.1％，可见盐胁迫下菌株rs019对小麦种子的萌发与幼苗的生长具有显著促进作用。有益效果：与现有技术相比，本发明分离筛选的海岸带土壤桔橙小单孢菌rs019具有固氮、产生植物生长激素吲哚乙酸(iaa)和产氨等多种促生特征，并能够耐受5％的nacl，通过菌悬液处理后的小麦在nacl浓度为100mm条件下能显著提高种子发芽率，菌悬液灌根回接小麦幼苗，具有盐胁迫下显著减缓盐害症状、增加生物量从而促进小麦生长的效果，有助于提高植物的耐盐性，减少化学肥料的使用。附图说明图1.菌株桔橙小单孢菌rs019在isp2平板上培养7天的菌落照片及扫描电镜照片图2.基于16srrna基因构建的菌株rs019系统发育树图3.盐胁迫条件下接菌与不接菌小麦在平皿中的萌发生长状态的比较图4.高盐及无盐胁迫条件下接菌与不接菌小麦盆栽试验生长状态的比较图5.高盐及无盐胁迫条件下接菌与不接菌小麦幼苗鲜重的比较生物材料保藏信息放线菌桔橙小单孢菌rs019，分类命名为放线菌桔橙小单孢菌(micromonosporaaurantiaca)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼广东微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc60177，保藏日期为2017年5月5日。具体实施方式实施例11.放线菌分离土壤样本采集自江苏沿海滩涂的盐碱地，土样采集带回实验室后于48小时内完成菌株分离。称取2个土样，经过成分研磨后加入含有18ml无菌水的试管中，并稀释至10-1-10-4浓度梯度，取10-2-10-4浓度的样本稀释液涂布于分离培养基上(可溶性淀粉2.0g，精氨酸1.0g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，kno31.0g，nacl3.0g，feso40.01g，h2o1000ml，ph7.2)。28℃培养7-14d，长出的菌落及时纯化并用isp2固体斜面4℃保藏。2.菌株鉴定菌株rs019的形态与生理生化特征：在生长初期表面呈橘色，后期颜色逐渐变深至黑色。扫描电镜下可清晰地观察到孢子单生、无柄，或着生在孢子梗上，孢子梗时常分枝成簇(图1)。菌株在酵母膏-麦芽膏(isp2)和土豆琼脂培养基(pda)上生长良好，无可溶性色素产生。能耐受最高浓度为5％的nacl，具有酪蛋白水解酶活性、纤维素酶活性、以及几丁质酶活性。能够在15-42℃温度范围能够生长，在ph6-9范围能够生长。使用isp2液体培养基于28℃，150rpm摇瓶培养5天后8000rpm离心收集菌体，微波法提取菌体基因组dna，用细菌通用引物27f5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-aaggaggtgatccagccgca-3'进行16srrna基因pcr扩增。pcr反应体系为：模板dna2μl，10×buffer5μl，mgcl2(25mmol)3μl，dntp(10mmol/l)1μl，27f(10μmol/l)1μl，1492r(10μmol/l)1μl，taq酶(5u/μl)0.5μl，pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工(上海)有限公司测序。测序结果在ncbi以及ezbiocloud网站上比对测序结果，然后用mega6.0软件进行序列比对及分析，最后用邻接法(neighbor-joining，nj)构建系统进化树并进行系统发育分析，序列比对发现该菌株与小单孢菌属的有效种序列相似性最高，与桔橙小单孢菌micromonosporaaurantiaca的相似性为100％(图2)。因此，菌株rs019应属于小单孢菌属的成员，命名为桔橙小单孢菌rs019(micromonosporaaurantiacars019)。3.菌株促生长性能固氮潜在性检测：挑取少量的菌体用点植法接种到无氮培养基上(蔗糖10.0g，caco31.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.2g，nacl0.2g，agar15g，h2o1000ml，ph7.2)，放置在28℃恒温培养箱中培养7天左右，观察其是否生长，若菌株转接5次后还能生长，则说明该菌株具有固氮潜在活性。菌株rs019传代5次后仍然能在无氮培养基上生长良好，说明rs019具有固定空气中氮元素的潜能。产氨活性检测：挑取少量待测菌株接种于5ml蛋白胨液体(10g/l)培养基中，三次重复，于28℃120r/min摇床振荡培养3天后，每个试管中加入0.5ml的nessler’s试剂，若出现黄褐色沉淀则说明具有产氨活性，若无则不产氨。菌株rs019培养后显色反应呈阳性，说明rs019具有产氨的能力。产植物生长激素吲哚乙酸(iaa)检测：将有氮培养液分装于试管，每管分装4ml，121℃高压灭菌。配制5mg/ml的色氨酸溶液，使用微孔滤膜过滤除菌后，加入到已经经过高压灭菌的有氮培养基中，使得色氨酸的最终浓度为0.5mg/ml。挑取菌株接种于分装后的试管中，28℃的摇床避光培养7天后，使用移液枪取出1ml菌液于灭菌后的离心管中，加入2ml的sackowcki’s显色剂(将150ml的浓硫酸缓缓加入到250ml的去离子水中，边加边搅拌，待溶液冷却后加入7.5ml0.5mol/l的fecl3·6h2o溶液)充分混匀，室温下显色30分钟，溶液呈粉红色，则为阳性，说明该菌株rs019产iaa。4.菌株应用试验菌株菌悬液制备方法：挑取在isp2固体平板上生长3-5天的桔橙小单孢菌rs019单菌落，接种于250ml的isp2液体培养基中(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm摇瓶培养3天后，待菌体生长至对数生长期时8000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，菌体浓度约为105-106cfu/ml，作为生物菌剂。平皿中小麦催芽试验：对小麦种子进行表面消毒，首先用有效氯含量为5％的naclo浸泡3min后，用无菌水漂洗4-5次；然后用75％的酒精浸泡5min，用无菌水漂洗数次至种子表面不发黄，最后用上述制备的rs019菌悬液浸泡24h，同时以无菌水处理作为对照。将浸泡后的种子在超净工作台中放入加有两层滤纸的无菌平板上，加入15ml无菌水，放于28℃恒温培养箱中培养，5天后平皿中加入10ml浓度为100mmnacl盐胁迫处理。12天后观察并记录小麦种子的萌发情况。结果如图3所示，平皿上小麦种子催芽实验可以发现盐胁迫的对照组小麦苗已经发黄，而接菌组小麦幼苗鲜绿、长势明显更好。在nacl浓度为100mm条件下，对照组发芽率为29.3％，用桔橙小单孢菌rs019菌悬液浸种的小麦发芽率为58％，为对照组的近两倍。盆栽施肥实验：采用营养土与蛭石以体积比4:1混合得到盆栽基质，然后于121℃灭菌一小时，冷却后分装至盆栽花盆中(9cm长×9cm宽×9cm高)，每盆约200g。选取长势一致的小麦幼苗，移栽含营养土的花盆中，放于温室中生长(温度为25℃，每天光照12h，无光照12h交替)，用50ml无菌水和菌液浇灌小麦每盆幼苗，每周浇灌2次，以浇无菌水的小麦幼苗作为对照；3周以后，用2％的nacl溶液进行盐胁迫灌根处理，每周灌根一次，连续灌根3次。在盐胁迫后30天随机选取植物进行拍照、测量、检测。结果如图4所示，左边两盆为无盐胁迫下不接菌(第1盆)与接菌(第2盆)处理的小麦植株幼苗，可以看出，无盐胁迫下接种rs019菌悬液的小麦幼苗长势更好。右边两盆为2％的nacl盐胁迫下不接菌(第3盆)与接菌(第4盆)处理的小麦植株幼苗，可以看出，盐胁迫下接种桔橙小单孢菌rs019的小麦幼苗生长地更好，而未接菌的幼苗，长势明显较差。统计可以发现，接种桔橙小单孢菌rs019后小麦在0、2％nacl处理下鲜重分别提高了61.5％、27.1％(表1，图5),株高得到显著提高。可见盐胁迫下菌株rs019对小麦种子的萌发与幼苗的生长具有显著促进作用。表1.接种放线菌rs019对小麦幼苗生长的影响株高(cm)植株鲜重(g)最大叶长(cm)0mmnacl35±1.20b1.3±0.20b360mmnacl+rs01943±2.11c2.1±0.14c442％nacl30.6±1.35a1.07±0.21a332％nacl+rs01938±1.67b1.36±0.22b40实施例2、一种小麦耐盐促生剂，是通过以下方法制备而得的：挑取在isp2固体平板上生长3-5天的桔橙小单孢菌rs019单菌落，接种于250ml的isp2液体培养基中(4g酵母浸膏，10g麦芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm摇瓶培养3天后，待菌体生长至对数生长期时8000rpm离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，无菌水调节菌体浓度，菌体浓度约为105-106cfu/ml，即得小麦耐盐促生剂。sequencelisting<110>江苏师范大学<120>一株小单孢菌属放线菌及其应用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1393<212>dna<213>桔橙小单孢菌rs019<400>1ctaccatgcagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagcggcgaacgggtgagtaac60acgtgagcaacctgccccaggctttgggataaccccgggaaaccggggctaataccgaat120atgacctctgaccgcatggttggtggtggaaagtttttcggcttgggatgggctcgcggc180ctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgaga240gggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtgg300ggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggcct360tcgggttgtaaacctctttcascagggacgaagcgtaagtgacggtacctgcagaagaag420cgccggccaactacgtgccagcagccgcggtaagacgtagggcgcgagcgttgtccggat480ttattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcgaccgtgaaaacttggggctc540aaccccaagcctgcggtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagactggaattcc600tggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctct660gggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctgg720tagtccacgctgtaaacgttgggcgctaggtgtggggggcctctccggttccctgtgccg780cagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagga840attgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaa900ccttacctgggtttgacatggccgcaaaactgtcagagatggcaggtccttcgggggcgg960tcacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgca1020acgagcgcaaccctcgttcgatgttgccagcgcgttatggcggggactcatcgaagactg1080ccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccag1140ggcttcacgcatgctacaatggccggtacaatgggctgcgataccgtgaggtggagcgaa1200tcccaaaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggag1260tcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacac1320cgcccgtcacgtcacgaaagtcggcaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagg1380agccgtcgaagtg1393当前第1页12