本发明涉及一种乌奴龙胆苷a的提取方法及其制备止咳药物的用途。
背景技术：
千百年来藏药在解除藏族人民的疾病痛苦方面发挥着巨大作用。大花龙胆gentianaszechenyiikanitz和乌奴龙胆gentianaurnulah.smith均为常用藏药，属于龙胆科龙胆属植物，主产于西藏、青海西南部，多生长在海拔3000米以上的高山草地或高山砾石带、高山草甸及流石滩等地。以大花龙胆为主流品种的白花龙胆，应用于呼吸系统疾病已有一千多年的历史，且疗效显著。《藏药标准》(西藏等六省卫生局编1979)记载白花龙胆(处方名为龙胆花，藏文音译名为榜间嘎保)功效在于清热解毒，泻肝胆实火，用于喉部疾病，脑膜炎、肝炎、胃炎等。以白花龙胆为君药的十五味龙胆花丸、三味龙胆花丸和十味龙胆花丸等常用藏成药主要用于治疗肺热咳嗽等疾病，因疗效确切而行销全国。乌奴龙胆的应用历史也非常悠久，《月王药诊》就有记载(藏药音译为岗嘎穹)。《藏药标准》谓其功效于清热解毒，止热泻，用于咽喉肿痛、感冒发烧、热性病腹泻等。因化学成分和药理实验方面研究较少，大花龙胆(白花龙胆的主流品种)和乌奴龙胆的药效物质基础尚不明确。目前尚没有大花龙胆化学成分的研究报道。刘艳红等对乌奴龙胆的化学成分进行了研究(云南植物研究，1994，16(4)：417-423)，从中分离鉴定了5个环烯醚萜苷，即乌奴龙胆苷(gentioumoside)a-e，其中乌奴龙胆苷a、b和c是二聚环烯醚萜苷。本课题组对大花龙胆的化学成分进行了研究，发现乌奴龙胆苷a在大花龙胆中含量也很高，并以乌奴龙胆苷a为指标性成分分别建立了白花龙胆质量标准(宗留留等，中国中药杂志，2015，40(10)：1872-1876)和乌奴龙胆质量标准(宗留留等，中国中药杂志，2015，40(19)：3878-3882)。而对乌奴龙胆苷a的提取分离优化及其药效学研究，既可阐明所建立质量标准的科学性，也利于开发新的藏药止咳药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种乌奴龙胆苷a的提取方法及其在制备止咳药物中的用途，并通过实验性研究，阐明该化合物的止咳作用，以便能在临床更好应用。
本发明提供的所述乌奴龙胆苷a的分子式：c40h52o22，分子量：884.29。
所述的乌奴龙胆苷a采用如下的提取方法获得：取大花龙胆或乌奴龙胆药材粗粉，加10-50倍量的水，煎煮或回流提取1-3次，每次1-3小时，离心后取上清液，合并上清液全部通过大孔树脂柱吸附；依次用水、30-35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液冲洗大孔树脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脱流分，浓缩得40％乙醇洗脱部位；将40％乙醇洗脱部位先后经凝胶sephadexlh-20柱层析和硅胶柱层析分离，合并乌奴龙胆苷a流份，得到乌奴龙胆苷a纯品。
本发明所述的乌奴龙胆苷a可以是从含乌奴龙胆苷a的各种药材中如大花龙胆、乌奴龙胆中提取获得乌奴龙胆苷a粗品或乌奴龙胆苷a单体化合物。
优选的，其中水提取物通过d101大孔树脂柱洗脱，先后经凝胶sephadexlh-20柱层析(甲醇系统)和硅胶柱层析(乙酸乙酯-甲醇-水10∶1.5∶1系统)分离，合并乌奴龙胆苷a流份，得到乌奴龙胆苷a纯品。
本发明的另一个目的是提供乌奴龙胆苷a在制备治疗咳嗽药物中的应用。
优选的，其中所述乌奴龙胆苷a用于治疗肺热咳嗽、感冒咳嗽。
本发明的另一个目的是提供一种治疗咳嗽的药物制剂，该制剂以乌奴龙胆苷a作为活性成分与药学上可以接受的载体相结合制成药学上可以接受的剂型。
药效学实验证明：乌奴龙胆苷a可延长由浓氨水所致实验性小鼠咳嗽模型中小鼠的咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数，也可延长由枸橼酸所致实验性豚鼠咳嗽模型中豚鼠的咳嗽潜伏期及减少咳嗽次数，表明乌奴龙胆苷a具备良好的止咳效果，为临床治疗咳嗽提供新的选择，具有良好药用开发价值。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述，应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
实施例1：从大花龙胆药材中分离乌奴龙胆苷a
取大花龙胆药材粗粉20g，加25倍量的水，加热回流提取3次，每次1小时，离心后取上清液，合并上清液，全部通过d101大孔树脂柱吸附；依次用水、35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液冲洗大孔树脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脱流分；将40％乙醇洗脱流分减压浓缩干燥后得浸膏327.0mg，浸膏用甲醇溶解后采用甲醇系统经凝胶sephadexlh-20柱层析分离，收集乌奴龙胆a流份，减压浓缩干燥后得浸膏203.7mg，再采用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1.5∶1)系统为流动相经硅胶柱层析分离，合并乌奴龙胆苷a流份，减压浓缩干燥后得到乌奴龙胆苷a纯品119.8mg。经与文献(刘艳红等，云南植物研究，1994，16(4)：417-423)报道的乌奴龙胆苷a的1h-nmr、13c-nmr比较，确定为乌奴龙胆苷a结构。
实施例2：从乌奴龙胆药材中分离乌奴龙胆苷a
取乌奴龙胆药材粗粉20g，加25倍量的水，加热回流提取3次，每次1小时，离心后取上清液，合并上清液全部通过d101大孔树脂柱吸附；依次用水、35％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液冲洗大孔树脂柱，收集40％乙醇水溶液洗脱流分；将40％乙醇洗脱流分减压浓缩干燥后得浸膏142.0mg，浸膏用甲醇溶解后采用甲醇系统经凝胶sephadexlh-20柱层析分离，收集乌奴龙胆a流份，减压浓缩干燥后得浸膏81.6mg，再采用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1.5∶1)系统为流动相经硅胶柱层析分离，合并乌奴龙胆苷a流份，减压浓缩干燥后得到乌奴龙胆苷a纯品33.2mg。经与文献(刘艳红等，云南植物研究，1994，16(4)：417-423)报道的乌奴龙胆苷a的1h-nmr、13c-nmr比较，确定为乌奴龙胆苷a结构。
实施例3：对浓氨水所致的小鼠咳嗽的影响
(1)实验动物icr小鼠，雌雄各半，清洁级，20±2g，由上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(沪)2013-0016。
(2)试药与仪器25％浓氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸可待因片(30mg/片，中国医药工业有限公司，批号：20130401)；402ai型超声波雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；阳性药磷酸可待因片的人最大日用量为8片(30mg/片)，小鼠等效换算剂量为30mg/kg；乌奴龙胆苷a的给药剂量参照阳性药给药剂量，高、中、低剂量分别为60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg。
(3)实验方法采用随机区组设计方法，考虑性别和体重的组间均衡性，分成5组，每组10只。实验前小鼠禁食不禁水12h，然后各组小鼠按0.2ml/10g灌胃给药，1次/天，每天同一时间灌胃，连续3天。末次给药1h后将各组小鼠逐只放入1l密闭烧杯内，用超声雾化器以一固定雾量向内喷25％浓氨水5s后，保持密闭环境，观察并记录小鼠咳嗽潜伏期和2min内的咳嗽次数，每组实验完后更换新的25ml浓氨水。运用spss18.0统计软件对数据进行统计分析。
(4)实验结果
表1乌奴龙胆苷a对浓氨水所致小鼠咳嗽的影响
备注：与空白组比较：*为p＜0.05，**为p＜0.01，***为p＜0.001
(5)实验结论与空白组比较，乌奴龙胆苷a高、中剂量组均能延长浓氨水所致小鼠咳嗽的潜伏期(p＜0.05)，乌奴龙胆苷a高、中、低剂量组均能明显缩短浓氨水所致小鼠咳嗽的次数(p＜0.05)。可以认为乌奴龙胆苷a具有明显的止咳效果。
实施例4：对枸橼酸所致的豚鼠咳嗽的影响
(1)实验动物豚鼠，200±50g，清洁级，上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(沪)2012-0008。
(2)试药与仪器磷酸可待因片(30mg/片，中国医药工业有限公司，批号：20130401)；402ai型超声波雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；枸橼酸(分析纯，上海润捷化学试剂有限公司，批号：20150701)；阳性药磷酸可待因片的人最大日用量为8片(30mg/片)，豚鼠的等效剂量为20mg/kg；乌奴龙胆苷a的给药剂量参照阳性药给药剂量，高、中、低剂量分别为40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg。
(3)实验方法用17.5％枸橼酸水溶液喷雾筛选出咳嗽敏感豚鼠，雌雄各半。置于口朝上的4l玻璃钟罩内，盖好盖子形成密封可视容器，上端接通超声雾化器以最大雾量喷雾15s，5min钟内咳嗽次数10-30次为哮喘敏感。采用随机区组设计方法，考虑性别和体重的组间均衡性，将筛选哮喘敏感豚鼠分成5组，每组8只。实验前豚鼠禁食不禁水6h，然后各组豚鼠按1ml/200g灌胃给药，1次/天，每天同一时间灌胃，连续3天。末次给药1h后以最大雾量喷雾15s，记录5min内豚鼠咳嗽次数。每组完后更换新的25ml17.5％枸橼酸水溶液。运用spss18.0统计软件对数据进行分析。
(4)实验结果
表2乌奴龙胆苷a对枸橼酸所致豚鼠咳嗽的影响
备注：与空白组比较：*为p＜0.05，**为p＜0.01，***为p＜0.001
(5)实验结论与空白组比较，乌奴龙胆苷a高、中、低剂量组均能明显缩短浓氨水所致豚鼠咳嗽的咳嗽潜伏期和咳嗽次数(p＜0.05)。可以认为乌奴龙胆苷a具有明显的止咳效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，只用于对本发明技术方案做进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。