基于碱基编辑的基因敲除方法及其应用与流程

文档序号：11246295阅读：1298来源：国知局

本发明涉及基因敲除策略，更具体来说，涉及基于碱基编辑的基因敲除方法及其应用。

背景技术：

传统的真核生物靶向基因操作是通过全能胚胎干细胞的同源重组和囊胚注射实现的。由于受到建立全能胚胎干细胞这一限制，主要是小鼠(也有大鼠的报道)可以通过全能胚胎干细胞的同源重组完成基因靶向改造[capecchi,2005]。进行基因靶向操作的另一种途径是克隆，即体细胞的基因改造和核移植。不过，克隆技术存在一些缺陷[carteretal.,2002；zhuetal.,2004]。比如，1、终末分化的体细胞克隆后很难完全去分化成未分化细胞，影响胚胎发育，造成发育缺陷；2、所有的遗传物质仅为母源；3、成功率低等。传统的基因靶向操作技术制约了基因敲除。

可编程核酸内切酶技术包括锌指核酸酶(zinc-fingernucleases,zfns)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectorsnucleases,talens)技术，以及规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；crispr-associated，crispr/cas9)[kimandkim,2014]。这类技术的发明和推广打破了全能胚胎干细胞的限制，使得不同物种的基因操作变得可能。特别是crispr/cas9系统，由于简便、高效、价廉，出现之后立即席卷全球，成为了基因编辑领域最新，但发展最快、应用最广的技术，引发了基因编辑领域的革命。现在crispr/cas9系统已经被成功地用于dna敲除、dna敲入、dna替代、dna修饰、rna修饰、dna标记、基因转录调节等[hsuetal.,2014；komoretal.,2017]。并已经成功应用于多个物种的基因编辑[barrangour&doudnaja,2016；komoretal.,2017]。

crispr/cas9介导特异性基因编辑是利用sgrna(singleguidedrna)通过靶序列互补引导cas9蛋白定位剪切双链dna，造成双链dna断裂(double-strandbreaks,dsb)，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接(non-homologousendjoining,nhej)修复，造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因敲除(knockout)；在有模板的条件下，通过同源重组进行修复(homology-directedrepair,hdr)，实现基因敲入(knockin)[hsuetal.,2014；kimandkim,2014；komoretal.,2017]。由于hdr效率低(整合很少发生)，而且非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑。此外，crispr/cas9介导的基因编辑总有一些脱靶效应[gorskietal.,2017]。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种高效精准的基因敲除策略。

最新研究表明，基于crispr/cas9技术所构建的cas9融合蛋白可作为“碱基编辑器(baseeditor，be)”。这些融合蛋白包含dcas9或cas9切口酶以及大鼠胞苷脱氨酶apobec1，它通过脱氨基作用将胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶，而无需切割dna。之后，通过dna复制或修复，尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶(t)。类似地，其也能将单碱基g转化成a。特别是cas9切口酶与apobec1组成的be3，其能够将碱基编辑效率显著提高到15～75％。由于不需切割dna造成dsb，形成的indel低于1％，实现的基因编辑更精确[komoretal.,2016]；而且，这种方式将脱靶效率降低到低于自然背景的10倍，实现的基因编辑更安全[nishidaetal.,2017]。be3已经被成功地用于在体内碱基编辑，实现了小鼠的ct突变，效率达到44～57％[kimetal.,2017]。

发明人基于上述be介导单碱基突变，尤其是be3介导的单碱基编辑的精确性和特异性，巧妙设计了一种基因敲除策略：通过ct突变引入终止密码子，例如将caa、cag、cga突变成终止密码子taa、tag、tga，或通过ga突变将tgg突变成终止密码子taa、tga、tag，终止编码基因的翻译，从而实现基因敲除。

根据本发明的第一方面，提供了一种基因敲除方法，其包括：

选定待敲除基因的编码区(cds区)的20bp–ngg目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子caa、cag或cga；

利用sgrna序列来将be3定位到目标序列以使目标密码子中的目标单碱基c变成t从而相应引入终止密码子taa或tag、tga以实现基因敲除，

其中目标单碱基c位于目标序列的(左端)第1-8位，优选为第4-8位，目标密码子与ngg间隔12-14bp,优选为14bp，并且目标密码子的上游紧邻碱基(h)不能为g；

所述sgrna序列为与目标序列互补对应的20bp序列。

可替代地，在上述方法中，也可选定待敲除基因的编码区的ccn-20bp目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子tgg，目标密码子的下游紧邻碱基(d)不能为c；相应地，目标单碱基g位于目标序列的(右端)第1-8位，优选为第4-8位，目标密码子与ccn间隔12-14bp，优选为14bp。

根据本发明，be3可以选自：rapobec1-sacas9-nls-ugi-nls；3xugi-rapobec1-sacas9-nls-ugi-nls；rapobec1-spcas9-nls-ugi-nls；3xugi-rapobec1-spcas9-nls-ugi-nls，优选采用后两种。

根据本发明的方法可以用于敲除如下八个靶基因：人pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160以及小鼠tim3和lag3，与其相应的sgrna序列分别与序列一至八所示目标基因序列互补。

根据本发明的第二方面，提供了上述方法在细胞系hek293t进行人pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160基因敲除的应用。

根据本发明的第三方面，提供了上述方法在人t细胞进行人pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160基因敲除的应用。

根据本发明的第四方面，提供了根据上述应用而获得的分离的t细胞或细胞系或它们的次代培养物。

根据本发明的第五方面，提供了一种用于基因敲除的试剂盒，包括(与待敲除基因相应的)上述sgrna、be3以及相应的扩增试剂。

本发明利用crispr/cas9基础上发展的碱基编辑技术，通过精准的ct或ga单碱基突变创造终止密码子，从而建立了比crispr/cas9更高效、更精确以及更少脱靶效应的基因敲除策略。

附图说明

图1为根据本发明的利用ct突变实现目标基因被敲除的示意图；

图2-5为不同be3的结构示意图。

具体实施方式

首先，构建不同的be3，如图2-5所示，将不同的cas9nickase与胞苷脱氨酶(apobec1)融合后形成如下四种be3：

(1)rapobec1-sacas9-nls-ugi-nls，图2，序列1；

(2)3xugi-rapobec1-sacas9-nls-ugi-nls，图3，序列2；

(3)rapobec1-spcas9-nls-ugi-nls，图4，序列3；

(4)3xugi-rapobec1-spcas9-nls-ugi-nls，图5，序列4。

在下面进行基因敲除时，可以采用上述任一种be3，优选为(3)或(4)。

接下来进行sgrna的设计。碱基定点编辑是利用sgrna将be3定位到或靶向特异靶位点，靶基因特异性sgrna的选择和设计是本发明的关键之处。本发明如下选择设计sgrna：

选定待敲除基因的编码区的20bp–ngg目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子caa、cag或cga；

目标单碱基c优选位于目标序列的(左端)第4-8位，目标密码子与ngg优选间隔14bp,并且目标密码子的上游紧邻碱基(h)不能为g；

制备与目标序列互补对应的20bpsgrna序列。

在替代方案中，则选定待敲除基因的编码区的ccn-20bp目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子tgg，目标密码子的下游紧邻碱基(d)不能为c；相应地，目标单碱基g优选位于目标序列的(右端)第4-8位，目标密码子优选与ccn间隔14bp。

针对八个靶基因——人pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160以及小鼠tim3和lag3，本发明选定下述目标基因序列来设计相应的sgrna(粗体下划表示pam；斜体下划表示候选突变编码子)：

一.hpd-1

sg-1:

sg-2:

sg-3:

二.hlag3

sg-1:

sg-2:

sg-3:

三.htigit

sg-1:

四.hvista

sg-1:

五.2b4

sg-1:

六.hcd160

sg-1:

七.mtim3

sg-1:

八.mlag3

sg-1:

针对上述选定的目标基因序列，人pd1(3条)、lag3(3条)、tigit、vista、2b4、cd160以及鼠tim3、lag3，构建相应的sgrna表达载体，将不同的sgrna分别导入pgl3-u6-sgrna。

实施例1

在细胞株上进行be3介导的碱基编辑，引入终止密码子，实现基因敲除。按常规操作，进行细胞株的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。

(1)以hek293t细胞为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：hek293t细胞接种培养于添加10％fbs的dmem高糖培养液中(hyclone,sh30022.01b),其中含penicillin(100u/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)转染以脂质体转染为例。按照lipofectamine^tm2000transfectionreagent(invitrogen,11668-019)的操作手册，以spcas9nickase为例，将2μgbe3质粒与2μgpgl3-u6-sgrna质粒混匀,共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，72小时后收取细胞。

(4)基因型分析

a、收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。

b、使用一对引物n-for和n-rev进行pcr扩增，用axypreppcrcleanup纯化获得pcr回收产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；holdat4℃。

c、获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：

700-800ngpcr回收产物

5μl10xbuffer(mg2+plus)

4μldntp

0.5μlrtaq(takara,r001am)

补水至50μl体系。

37℃温育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。

d、挑取单克隆，用通用引物m13-f测序各靶基因突变，测序结果如下(粗体下划表示pam；斜体表示突变编码子；斜体下划表示突变碱基)：

1.hpd-1

sg-1:

mut:

sg-2:

mut:

sg-3:

mut:

2.hlag3

sg-1:

mut:

sg-2:

mut:

sg-3:

mut:

3.htigit

sg-1：

mut:

4.hvista

sg-1:

mut:

5.2b4

sg-1:

mut:

6.hcd160

sg-1:

mut:

结果表明：靶基因发生了sgrna靶向的碱基突变，引入了终止密码子，pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160等基因敲除成功。

实施例2

在原代细胞上进行be3介导的碱基编辑，引入终止密码子，实现基因敲除。

按常规操作，以人的t细胞进原代细胞的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以电转为例。

(1)pbmc细胞的分离纯化：

a、用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；

b、外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；

c、将得到的白膜层细胞与pbs或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀即为所述pbmc细胞。

重复三遍。

(2)cd3阳性细胞的富集

a、调整pbmc细胞浓度至50x10⁶cell/ml。

b、按每1ml加入cd3+enrichedantibodiescocktail50μl，混匀后室温静置5分钟。

c、按每1ml加入magnet150μl，混匀后室温静置10分钟，

d、将离心管置于磁力架上静置5分钟，吸取上层细胞悬液至新的15ml离心管中。

e、重复该操作一次。

f、室温离心300*g，10分钟，收集细胞。

g、细胞计数。

(3)cd3阳性细胞的电转

a、配置电转体系

向1.5ml离心管中分别加入8μgbe3质粒与8μgpgl3-u6-sgrna质粒，并按照lonzaamaxa电转试剂盒说明书要求，加入82μl电转缓冲液和18μlsupplement1,混匀。

b、收取20x10⁶个细胞到15ml离心管中，300g离心10分钟，弃掉上清。

c、以a中配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中。

d、使用仪器lonza2b,u-014程序进行电转。

e、电转后的细胞迅速转移至提前预热的添加有10％fbs的aim-v培养基中，37度5％二氧化碳培养箱中培养2小时。

f、电转后的细胞全换液，以1x10⁶个/ml的密度重悬细胞，培养过夜。

(4)t细胞的激活培养

a、电转培养24小时后，向培养基中加入100u/mlil-2，并按照1:1的比例加入cd3/cd28dynabeads，激活t细胞。

b、每两天对细胞半换液，或者是补加il-2，细胞密度始终维持在1x10⁶个/ml。

c、激活5天后，将t细胞收集到15ml离心管中，并将离心管置于磁力架中，慢慢将上清转移到另外一个干净的15ml离心管中，重复此步骤一次。

d、室温离心300*g，10分钟，弃上清，使用10％fbs,300u/mlil-2aim-v培养基重悬细胞，密度控制在1x10⁶个/ml。

e、每两天对细胞半换液，或者是补加il-2，并计数，细胞密度始终维持在1x10⁶个/ml。

(5)基因型分析

a、收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。

c、获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：

700-800ngpcr回收产物

5μl10xbuffer(mg2+plus)

4μldntp

0.5μlrtaq(takara,r001am)

补水至50μl体系。

37℃温育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。

d、挑取单克隆，用通用引物m13-f测序t细胞各靶基因突变，测序结果如下(粗体下划表示pam；斜体表示候选突变编码子；斜体下划表示突变碱基)：

1.hpd-1

sg-1:

mut:

sg-2:

mut:

sg-3:

mut:

2.hlag3

sg-1:

mut:

sg-2:

mut:

sg-3:

mut:

3.htigit

sg-1:

mut:

4.hvista

sg-1:

mut:

5.2b4

sg-1:

mut:

6.hcd160

sg-1:

mut:

结果表明：靶基因发生了sgrna靶向的碱基突变，引入了终止密码子，pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160等基因敲除成功。

实施例3

构建be3介导的基因敲除小鼠

按常规操作进行小鼠的胚胎收集、显微注射、胚胎培养和胚胎移植等。以tim3和lag3基因为例构建敲除小鼠。

(1)显微注射：受精卵分别注射be3mrna和tim3特异性sgrna(对应于上述序列七)，或be3mrna和lag3特异性sgrna(对应于上述序列八)。常规进行胚胎移植；

(2)基因型分析：常规小鼠剪尾提取基因组dna，分别pcr扩增编码区域，sanger测序，测序结果如下(粗体下划表示pam；斜体表示突变编码子；斜体下划表示突变碱基)：

7.mtim3

sg-1:

mut:

8.mlag3

sg-1:

mut:

上述结果确证tim3和lag3的ct突变和终止密码子的引入。构建tim3和lag3敲除小鼠成功。

　　序列表

<110>黄行许

<120>基于碱基编辑的基因敲除方法及其应用

<160>4

<210>1

<211>7686

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatg60

cccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcg120

ctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgact180

cacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaa240

atcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggta300

ggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgct360

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aaggacgacgacgacaagtctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggag4440

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gtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcacc4560

gacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtc4620

atacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctcccaagaag4680

aagaggaaagtctaaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcag4740

cctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttcct4800

tgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgc4860

attgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaaggggg4920

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ggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgag5100

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tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccc5580

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