本发明涉及植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661其代谢产物组成的乳酸菌复合制剂，尤其是一种能显著提高盐碱地花生微量元素吸收率的乳酸菌复合制剂，属于微生物技术领域。
背景技术：
微量元素为植物体必需但需求量很少的一些元素，这些元素在土壤中缺少或不能被植物利用时，植物生长不良。中国科学院南京土壤研究所对全国土壤微量元素锌、硼、锰、钼、铜、铁的含量进行了调查，结果表明：我国大部分地区都存在不同程度的微量元素缺乏，土壤中微量元素处于“中度缺乏”的状态。我国中、低产田占总耕地面积的70％以上，其中大部分存在微量元素缺乏的问题，缺少微量元素铁、铜、钼、硼、锰、锌的耕地分别占5.0％，6.9％，21.0％，46.8％，34.5％和51.5％。
花生又名落花生、双子叶植物，仔仁含油量高达50％，品质优良，气味清香，是我国主要的油料作物和经济作物，在油料作物中种植面积仅次于油菜，而总产量居第一位，且其副产品花生粕富含蛋白，可用于禽、畜和水产养殖饲料，在我国有着举足轻重的地位。同时，花生属中等耐盐作物，具有抗旱、耐瘠等特性，可以作为盐碱土区棉花的替代作物之一。因此，发展盐碱地花生种植生产对改善盐碱土区农业种植结构、提高农民收入、保障粮油安全供给具有重要意义。
然而，土壤中微量元素的可给性一般是在酸性条件下升高，在碱性条件下下降，盐碱土由于土壤条件的影响，微量元素更易缺乏。同时，已有研究表明微量元素缺乏导致的矿质营养元素胁迫可以加重花生的连作障碍，影响花生产量。因此，若能采取有效方式提高盐碱地上花生对微量元素的利用率，对于提高盐碱地花生的品质有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于通过探究不同乳酸菌对花生的生长性状及品质的影响，确定适宜在花生中应用的复合乳酸菌制剂，从而提供一种能显著提高盐碱地花生微量元素吸收率的乳酸菌复合制剂及其应用。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种提高盐碱地花生微量养分利用率的复合乳酸菌制剂，该复合乳酸菌制剂中的活性菌由植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661组成。
需要说明的是，本发明所采用的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8，分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够存活于动物肠道内；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2012年06月28日，保藏号为cgmccno.6312。
本发明所采用的干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang，是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株；该菌株于2006年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号cgmccno.1697。
本发明所采用的植物乳杆菌ccfm8661，具有减除铅毒性效应的益生菌，酸碱适应性良好，在ph3.0-9.0环境条件下生长良好，在ph2.5环境下存活良好。利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm18661，该菌苗株已于2011年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为cgmccno.5494。
进一步优选地，如上所述提高盐碱地花生微量养分利用率的复合乳酸菌制剂，该复合乳酸菌制剂中的活性菌由植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661按(1.5-2.5)：(1.5-2.5)：1的活菌数量比组成。
本发明人在筛选抑制盐碱地花生病原菌的拮抗菌时意外发现，含有植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的复合菌液对病原菌没有明显抑制作用，但对花生的生长代谢有明显的影响，可以提高花生对盐碱土壤中微量元素的利用率。基于此发现，本发明人通过接种于mrs培养液中培养发酵，将这三种菌制备成了复合乳酸菌制剂。因此，本发明提供了上述复合乳酸菌制剂的应用，即：上述的复合乳酸菌制剂在提高盐碱地花生微量元素利用率中的应用；以及，上述的复合乳酸菌制剂在盐碱地花生种植管理中的应用。
本发明涉及的复合乳酸菌制剂可以采用如下方法制备：
(1)将所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661分别按4％-10％的接种量接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养12-24小时，经离心洗涤后，在各菌体沉淀上加入含8％-12％灭菌脱脂牛乳液、0.5％～0.6％葡萄糖和0.5％～0.8％酵母浸膏的混合液，并调整其菌数大于2.0×109cfu/ml，混匀后分别倾注培养；
(2)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18-24小时，再分别接种于含8％-12％灭菌脱脂牛乳液、0.5％-0.6％葡萄糖和0.5～0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养18-24小时；
(3)将步骤(2)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8：干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661为(1.5-2.5)：(1.5-2.5)：1的比例混匀，并将保护剂添加到混合菌液中，所述的保护剂的组成为：90-120g/l脱脂奶粉、25-35ml/l甘油、90-120g/l麦芽糊精、120-180g/l海漆糖和8-13g/ll-谷氨酸钠，调整活菌数大于2×109cfu/ml，ph值为5-6。
本发明涉及的复合乳酸菌制剂配制成菌液后可施用于花生种植过程中，使用量及方法：第一次施用，于花生播种期，用量为2升/亩(活菌总数含量大于2×109cfu/ml)，若采用人工种植方式，可在开沟后，清水稀释，采用农用喷雾器喷施于沟内；若使用花生播种覆膜一体机，可直接将菌液清水稀释后置于一体机药桶中使用，无论何种施用方式应注意菌液与农药不能一起使用，两者使用时间应间隔2天以上；第二次施用，于花生荚果期，用量为2升/亩(活菌总数含量大于2×109cfu/ml)，兑水稀释后，喷施或浇灌于花生根部，有条件地区可采用膜下滴灌方式进行滴灌，灌水深度润湿土壤8-10cm即可。
与现有技术相比，本发明涉及的复合乳酸菌制剂中的活性菌由植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661组成，该复合乳酸菌制剂对盐碱地花生的生长代谢有明显的影响，尤其可以提高盐碱地花生对土壤微量元素的利用率，施用于花生种植过程中可提高盐碱地花生的品质。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。另外，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：复合乳酸菌剂的制备
(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661分别按6％的接种量接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏，并调整其菌数大于2.0×109cfu/ml，混匀后分别倾注培养。
(2)使用无菌水制备保护剂，组成为：l00g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、l00g/l麦芽糊精、150g/l海漆糖和l0g/ll-谷氨酸钠。
(3)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，再接种10％的灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养20小时。
(4)将步骤(3)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8：干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661为2:2:1的比例混匀，并将步骤(2)制备的保护剂添加到混合菌液中，调整其活菌数大于2×109cfu/ml，ph值为5-6。
实施例2：复合乳酸菌剂的制备
(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8和干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang分别按6％的接种量接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏，并调整其菌数大于2.0×109cfu/ml，混匀后分别倾注培养。
(2)使用无菌水制备保护剂，组成为：l00g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、l00g/l麦芽糊精、150g/l海漆糖和l0g/ll-谷氨酸钠。
(3)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，再接种10％的灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养20小时。
(4)将步骤(3)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)p-8：干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang为1：1的比例混匀，并将步骤(2)制备的保护剂添加到混合菌液中，调整其活菌数大于2×109cfu/ml，ph值为5-6。
实施例3：复合乳酸菌剂的制备
(1)将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661和干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang分别按6％的接种量接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏，并调整其菌数大于2.0×109cfu/ml，混匀后分别倾注培养。
(2)使用无菌水制备保护剂，组成为：l00g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、l00g/l麦芽糊精、150g/l海漆糖和l0g/ll-谷氨酸钠。
(3)将步骤(1)得到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661和干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35-37℃条件下恒温培养18小时，再接种10％的灭菌脱脂牛乳液、0.6％葡萄糖和0.8％酵母浸膏的混合液中，在35-37℃条件下培养20小时。
(4)将步骤(3)得到的各菌液按照植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ccfm8661和干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)zhang为1：2的比例混匀，并将步骤(2)制备的保护剂添加到混合菌液中，调整其活菌数大于2×109cfu/ml，ph值为5-6。
实施例4：复合乳酸菌剂在盐碱地花生种植中的试验
实验地点：山东省东营市利津县汀罗镇毛坨村
实验时间：2016.05-2016.10
实验作物：花生(品种为小青花9号)
实验土壤：中度盐碱土(土壤含盐量2.83g/kg，ph为8.65)
实验组别：复合乳酸菌a组施用实施例2制备复合乳酸菌剂，复合乳酸菌b组施用实施例3制备复合乳酸菌剂，复合乳酸菌c组施用实施例1制备复合乳酸菌剂。
使用量及方法：第一次施用，于花生播种期，用量为2升/亩(各实施例制备的菌剂分别配制成菌液，各菌液中活菌总数含量3×109cfu/ml左右)，若采用人工种植方式，可在开沟后，清水稀释，采用农用喷雾器喷施于沟内；若使用花生播种覆膜一体机，可直接将菌液清水稀释后置于一体机药桶中使用，无论何种施用方式应注意菌液与农药不能一起使用，两者使用时间应间隔2天以上；第二次施用，于花生荚果期，用量为2升/亩(各实施例制备的菌剂分别配制成菌液，各菌液中活菌总数含量3×109cfu/ml左右)，兑水稀释后，喷施或浇灌于花生根部，有条件地区可采用膜下滴灌方式进行滴灌，灌水深度润湿土壤8-10cm即可。
种植管理：各组1亩试验田，花生采用覆膜起垄方式种植，垄距90cm，每垄2行，垄上小行距35cm，穴距11cm(每穴2粒)，每亩13474穴(株)。每亩施花生专用肥，氮磷钾含量45％(10：18：17)，每亩25公斤。后期不再追肥。
表1各处理下花生叶片微量元素含量比较
注：a组为植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang，b组为植物乳杆菌ccfm8661+干酪乳杆菌zhang，c组为植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang+植物乳杆菌ccfm8661。与空白对照组比较，▲p＜0.01；c组与a组比较，★p＜0.01；c组与b组比较，■p＜0.01。
表2各处理下花生茎部微量元素含量比较
注：a组为植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang，b组为植物乳杆菌ccfm8661+干酪乳杆菌zhang，c组为植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang+植物乳杆菌ccfm8661。与空白对照组比较，▲p＜0.01；c组与a组比较，★p＜0.01；c组与b组比较，■p＜0.01。
表3各处理下花生果针微量元素含量比较
注：a组为植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang，b组为植物乳杆菌ccfm8661+干酪乳杆菌zhang，c组为植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang+植物乳杆菌ccfm8661。与空白对照组比较，▲p＜0.01；c组与a组比较，★p＜0.01；c组与b组比较，■p＜0.01。
通过表1的试验结果比较发现，植物乳杆菌p-8、干酪乳杆菌zhang和植物乳杆菌ccfm8661组成的复合菌相对于空白对照组、a组植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang和b组植物乳杆菌ccfm8661+干酪乳杆菌zhang均可以极显著提高花生叶片中钙、铁、锌、钼和镁等微量元素的含量，相对于空白对照组分别提高了19.0％、6.4％、18.9％、106.6％和7.2％(表1)，但降低了叶片中锰和铜的含量，相对于空白对照组分别降低了9.4％和7.7％。
通过表2的试验结果比较发现，植物乳杆菌p-8、干酪乳杆菌zhang和植物乳杆菌ccfm8661组成的复合菌相对于空白对照组、a组植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang和b组植物乳杆菌ccfm8661+干酪乳杆菌zhang均可以极显著提高花生茎部钙、铁、锰、铜、锌、钼和镁等微量元素的含量，相对于空白对照组分别提高了55.1％、14.7％、18.3％、33.7％、10％、74.4％和30.5％％。
通过表3的试验结果比较发现，植物乳杆菌p-8、干酪乳杆菌zhang和植物乳杆菌ccfm8661组成的复合菌相对于空白对照组、a组植物乳杆菌p-8+干酪乳杆菌zhang和b组植物乳杆菌ccfm8661+干酪乳杆菌zhang均可以显著提高花生果针中钙、铁、锰、铜、锌、钼和镁等微量元素的含量，相对于空白对照组分别提高了9.1％、19.4％、29.8％、5.9％、32.3％、24.2％和5.2％。
总之，通过统计学比较，在多个微量元素的含量方面，c组相比a组和b组均有极显著性差异，这说明植物乳杆菌p-8、干酪乳杆菌zhang和植物乳杆菌ccfm8661可协同提高盐碱地花生对土壤微量元素的利用率。