本发明涉及发酵培养基和培养基的优化技术领域，尤其涉及一种固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基及其优化方法。
背景技术：
随着生态农业在世界范围内的迅速兴起，由于食品安全、环境保护的需要，国家对肥料、农药提出了一系列的要求和限制，因此，微生物肥料在农业中的应用越来越受到重视。而芽孢杆菌具有耐储存，抗逆性强和耐盐碱等诸多优点，因此，固氮类芽孢杆菌又在微生物肥料制备和应用上起着至关重要的作用。固氮类芽孢杆菌(paenibacillussp.)1-49是一种具有高效固氮酶活性，可以固定空气中的n2，并把它转化成供农作物直接利用的nh4+，从而达到减少化肥用量的目的，同时又能有效促进作物生长的类芽孢杆菌。然而，固氮类芽孢杆菌在普通培养基中生长缓慢甚至不生长，或者产芽孢数很低，不利于工业化生产。为了在固氮类芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高固氮类芽孢杆菌的产量，特此对固氮类芽孢杆菌的发酵培养基进行研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基及其优化方法，该发酵培养基既能降低生产成本而又能提高固氮类芽孢杆菌的产量。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基，它由以下质量的原料制成：豆饼粉15-20g，玉米淀粉5-8g，蔗糖6-10g，酵母粉5-8g，mgso4·7h2o0.2-0.5g，caco31-3g，mnso4·h2o0.01-0.03g，kh2po40.25-0.75g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.5。
优选的，一种固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基，它由以下质量的原料制成：豆饼粉16-18g，玉米淀粉6-7g，蔗糖8-9g，酵母粉6-7g，mgso4·7h2o0.3-0.4g，caco32.0-3.0g，mnso4·h2o0.02-0.03g，kh2po40.4-0.6g，蒸馏水1000ml，ph7.2-7.4。
更为优选的，一种固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基，它由以下质量的原料制成：豆饼粉17g，玉米淀粉6g，蔗糖8g，酵母粉6g，mgso4·7h2o0.4g，caco32.0g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.5g，蒸馏水1000ml，ph7.3。
上述固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基的优化方法，它包括以下步骤：
1)、氮源的确定
在相等的氮含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母粉，豆饼粉，(nh4)2so4及不同组合作为氮源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养，检测活菌数和芽孢率，以确定最佳氮源；
2)、碳源的确定
确定氮源后，在保持碳含量不变的条件下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作为碳源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养，检测活菌数和芽孢率，以确定最佳碳源；
3)、碳氮比的确定
确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料质量比)配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养，检测活菌数和芽孢率，以确定最佳的c/n比；
4)、ph的确定
分别配制ph值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养，检测活菌数和芽孢率，以确定最佳ph。
其中，步骤1)-步骤4)中发酵培养具体为：接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为180-220r/min，28-36℃培养22-24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，28-36℃培养46-48h，制得固体种。
其中，步骤1)-步骤4)中发酵培养具体为：接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为200r/min，32℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，32℃培养48h，制得固体种。
其中，步骤1)-步骤4)中液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
其中，步骤1)-步骤4)中固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
其中，步骤1)-步骤4)中活菌的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，取0.1ml10-2浓度稀释液到无菌营养琼脂培养基中并涂匀，37℃培养48h，然后数培养皿上的菌落数，即可检测得活菌。
其中，步骤1)-步骤4)中芽孢率的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，转速为200r/min，20min摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，依次这样稀释到10-3浓度稀释液，取0.01ml10-3浓度稀释液滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本发明的有益效果为：(1)本发明以固氮类芽孢杆菌1-49为出发菌株，通过单因素和正交试验进行固体发酵的培养基和培养条件的优化，以提高固氮类芽孢杆菌1-49产孢量；优化后的培养基配料，能直接应用于固氮类芽孢杆菌1-49发酵，大大提高生产的优质化；固氮类芽孢杆菌1-49作为一种新的微生物菌剂，在未来的农业生产中，将有良好的应用前景。
(2)本发明针对固氮类芽孢杆菌1-49的发酵配方进行优化，克服了固氮芽孢杆菌芽孢产量低的困难，大大提高了产孢量，增强了固氮类芽孢杆菌1-49的应用效果；
(3)本发明针对固氮类芽孢杆菌1-49的发酵配方进行优化能够有效地降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
固氮类芽孢杆菌(paenibacillussp.)1-49编号为strainnumbercgmccno.4966，是类芽孢杆菌属的一种。呈杆状，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到梭状。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，好氧菌。
实施例1
本实施例的固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基的优化方法，它包括以下步骤：
1)、氮源的确定
在相等的氮含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母粉，豆饼粉，(nh4)2so4及不同组合作为氮源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为180r/min，28℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，28℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳氮源。实验结果如表1所示。
表1氮源对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现(nh4)2so4不利于培养基产芽孢，发酵48h后的培养基的芽孢率都比较低；而蛋白胨和酵母粉同时作为氮源对培养基的活菌数和芽孢率都有提高。
2)、碳源的确定
确定氮源后，在保持碳含量不变的条件下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作为碳源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为180r/min，28℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，28℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳碳源。实验结果如表2所示。
表2碳源对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，葡萄糖有利于固氮类芽孢杆菌的生长，但产生芽孢少，发酵后培养基的芽孢率低。综合考虑发酵后培养基中的活菌数和芽孢率，可以明显地得出玉米淀粉和蔗糖同时作为碳源时对固氮类孢芽杆菌的生长和产芽孢都有利，适合于大规模化的工业化生产。
3)、碳氮比的确定
确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料质量比)配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为180r/min，28℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，28℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳c/n比。实验结果如表3所示。
表3碳氮比对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现当发酵培养基中只有碳源和氮源中的一种时，发酵后检测出的活菌数和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生产；而如果培养基中碳源和氮源都有时，可以看出发酵后培养基的芽孢率相差不大。而对于大规模化的工业生产，需要的是活菌数和芽孢率都高的生产配方，当碳氮比为2:1可以满足生产需求。
4)、ph的确定
分别配制ph值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为180r/min，28℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，28℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳ph。实验结果如表4所示。
表4ph对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现ph值对培养基的芽孢率影响不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影响培养基的活菌数。综合表中的活菌数和芽孢率两项指标，得出ph值为7.5时培养基的活菌数和芽孢率都很高，符合规模化的工业生产。
步骤1)-步骤4)中活菌的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，取0.1ml10-2浓度稀释液到无菌营养琼脂培养基中并涂匀，37℃培养48h，然后数培养皿上的菌落数，即可检测得活菌。
步骤1)-步骤4)中芽孢率的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，转速为200r/min，20min摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，依次这样稀释到10-3浓度稀释液，取0.01ml10-3浓度稀释液滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本发明采用单因素实验和正交实验相结合的方法，对固氮类芽孢杆菌的固体发酵培养基进行研究，确定固氮类芽孢杆菌的最佳发酵培养基为：豆饼粉15g，玉米淀粉5g，蔗糖6g，酵母粉5g，mgso4·7h2o0.2g，caco31g，mnso4·h2o0.01g，kh2po40.25g，ph7.5，蒸馏水1000ml。
实施例2
本实施例的固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基的优化方法，它包括以下步骤：
1)、氮源的确定
在相等的氮含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母粉，豆饼粉，(nh4)2so4及不同组合作为氮源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为200r/min，32℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，32℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳氮源。实验结果如表1所示。
表1氮源对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现(nh4)2so4不利于培养基产芽孢，发酵48h后的培养基的芽孢率都比较低；而蛋白胨和酵母粉同时作为氮源对培养基的活菌数和芽孢率都有提高。
2)、碳源的确定
确定氮源后，在保持碳含量不变的条件下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作为碳源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为200r/min，32℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，32℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳碳源。实验结果如表2所示。
表2碳源对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，葡萄糖有利于固氮类芽孢杆菌的生长，但产生芽孢少，发酵后培养基的芽孢率低。综合考虑发酵后培养基中的活菌数和芽孢率，可以明显地得出玉米淀粉和蔗糖同时作为碳源时对固氮类孢芽杆菌的生长和产芽孢都有利，适合于大规模化的工业化生产。
3)、碳氮比的确定
确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料质量比)配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为200r/min，32℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，32℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳c/n比。实验结果如表3所示。
表3碳氮比对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现当发酵培养基中只有碳源和氮源中的一种时，发酵后检测出的活菌数和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生产；而如果培养基中碳源和氮源都有时，可以看出发酵后培养基的芽孢率相差不大。而对于大规模化的工业生产，需要的是活菌数和芽孢率都高的生产配方，当碳氮比为2:1可以满足生产需求。
4)、ph的确定
分别配制ph值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为200r/min，32℃培养24h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，32℃培养48h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳ph。实验结果如表4所示。
表4ph对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现ph值对培养基的芽孢率影响不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影响培养基的活菌数。综合表中的活菌数和芽孢率两项指标，得出ph值为7.5时培养基的活菌数和芽孢率都很高，符合规模化的工业生产。
步骤1)-步骤4)中活菌的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，取0.1ml10-2浓度稀释液到无菌营养琼脂培养基中并涂匀，37℃培养48h，然后数培养皿上的菌落数，即可检测得活菌。
步骤1)-步骤4)中芽孢率的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，转速为200r/min，20min摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，依次这样稀释到10-3浓度稀释液，取0.01ml10-3浓度稀释液滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本发明采用单因素实验和正交实验相结合的方法，对固氮类芽孢杆菌的固体发酵培养基进行研究，确定固氮类芽孢杆菌的最佳发酵培养基为：豆饼粉17g，玉米淀粉6g，蔗糖8g，酵母粉6g，mgso4·7h2o0.4g，caco32.0g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.5g，蒸馏水1000ml，ph7.5。
实施例3
本实施例的固氮类芽孢杆菌1-49的发酵培养基的优化方法，它包括以下步骤：
1)、氮源的确定
在相等的氮含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母粉，豆饼粉，(nh4)2so4及不同组合作为氮源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为220r/min，36℃培养22h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，36℃培养46h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳氮源。实验结果如表1所示。
表1氮源对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现(nh4)2so4不利于培养基产芽孢，发酵48h后的培养基的芽孢率都比较低；而蛋白胨和酵母粉同时作为氮源对培养基的活菌数和芽孢率都有提高。
2)、碳源的确定
确定氮源后，在保持碳含量不变的条件下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作为碳源配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为220r/min，36℃培养22h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，36℃培养46h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳碳源。实验结果如表2所示。
表2碳源对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，葡萄糖有利于固氮类芽孢杆菌的生长，但产生芽孢少，发酵后培养基的芽孢率低。综合考虑发酵后培养基中的活菌数和芽孢率，可以明显地得出玉米淀粉和蔗糖同时作为碳源时对固氮类孢芽杆菌的生长和产芽孢都有利，适合于大规模化的工业化生产。
3)、碳氮比的确定
确定好碳源和氮源之后，改变碳源和氮源的比例，分别采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料质量比)配制液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为220r/min，36℃培养22h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，36℃培养46h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳c/n比。实验结果如表3所示。
表3碳氮比对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现当发酵培养基中只有碳源和氮源中的一种时，发酵后检测出的活菌数和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生产；而如果培养基中碳源和氮源都有时，可以看出发酵后培养基的芽孢率相差不大。而对于大规模化的工业生产，需要的是活菌数和芽孢率都高的生产配方，当碳氮比为2:1可以满足生产需求。
4)、ph的确定
分别配制ph值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液体培养基和固体培养基，其它组分不变，相同条件下发酵培养；液体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5；固体培养基的其他组分包括以下质量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g琼脂，1000ml蒸馏水，ph7.2-7.5。
发酵培养具体为：用接种环接种1环固氮类芽孢杆菌1-49试管菌种到液体培养基中，转速为220r/min，36℃培养22h，进行扩大培养和活化，制得液体种，然后再取1ml液体种接种到固体培养基中，36℃培养46h，制得固体种。
检测固体种的活菌数和芽孢率，以确定最佳ph。实验结果如表4所示。
表4ph对固氮类芽孢杆菌生长的影响
通过对比观察，可以发现ph值对培养基的芽孢率影响不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影响培养基的活菌数。综合表中的活菌数和芽孢率两项指标，得出ph值为7.5时培养基的活菌数和芽孢率都很高，符合规模化的工业生产。
步骤1)-步骤4)中活菌的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，取0.1ml10-2浓度稀释液到无菌营养琼脂培养基中并涂匀，37℃培养48h，然后数培养皿上的菌落数，即可检测得活菌。
步骤1)-步骤4)中芽孢率的检测方法为：取3-5ml固体种溶解在45ml无菌水中，转速为200r/min，20min摇散得10-1浓度稀释液，再用5ml无菌吸管吸取5ml10-1浓度稀释液到45ml无菌水中，摇匀得10-2浓度稀释液，依次这样稀释到10-3浓度稀释液，取0.01ml10-3浓度稀释液滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本发明采用单因素实验和正交实验相结合的方法，对固氮类芽孢杆菌的固体发酵培养基进行研究，确定固氮类芽孢杆菌的最佳发酵培养基为：豆饼粉20g，玉米淀粉8g，蔗糖10g，酵母粉8g，mgso4·7h2o00.5g，caco33g，mnso4·h2o0.03g，kh2po40.75g，ph7.5，蒸馏水1000ml。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。