一株促进凤眼莲基质酶解产糖的芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于固体废弃物资源化利用领域，具体涉及一株芽孢杆菌(bacillusaxarquiensis)cts-bq1及其促进凤眼莲基质酶解产糖的预处理作用，可应用于凤眼莲高值化利用的前处理。

背景技术：

凤眼莲作为一种侵害性水生植物，一方面其生长快速、且适应性强，腐败变质后易污染水体；另一方面其生长在水中，产量大，不占用土地面积，其纤维素、半纤维素含量高，是较有潜力的生物能源物质的生产原料。但因其含水率高，木质素包裹纤维素使其较难释放，不易被利用，其预处理成本高，产糖产乙醇效率低。生物预处理法具有作用条件温和、能耗低、环境污染小，处理成本低等优点，是极具潜力的预处理方法。但目前的生物预处理研究中仍然存在木质素降解微生物种类少，降解条件苛刻，木质素分解酶类的酶活力低，作用周期长，在处理过程中部分纤维素和半纤维素会被细菌消耗掉等问题；生物酶经济成本高，酶预处理大大提高了生产成本，使得生物预处理难以实现工业化应用。如何克服上述问题，找到适合的预处理发酵菌株成为生物预处理研究的热点。

脱胶菌多用于对苎麻的研究，通过去除麻类物质中的胶质成分同时保留其纤维成分，增强麻类纤维性能，这种脱胶方法针对其他类型植物鲜有涉及。借鉴前人对苎麻脱胶菌的筛选方法，从凤眼莲不同生长环境中筛选降解凤眼莲非纤维素的优良菌株，并对其产酶特性进行了探究。目前报道的脱胶菌株有放线菌属、纤维单胞菌、志贺菌属和枯草芽孢杆菌等，这些都是对麻类的脱胶菌株，而对bacillusaxarquiensis报道较少。

技术实现要素：

为改进现有技术的不足，本发明提供了一种芽孢杆菌及其应用，该芽孢杆菌预处理凤眼莲酶解产糖具有显著促进作用。

本发明第一方面提供了一种芽孢杆菌(bacillusaxarquiensis)cts-bq1，已于2017年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2017273,地址：中国，武汉，武汉大学。

本发明第二方面提供了上述芽孢杆菌cts-bq1在促进凤眼莲基质酶解产糖中的应用。

本发明第三方面提供了一种促进凤眼莲基质酶解产糖的方法，步骤包括：采芽孢杆菌cts-bq1，扩增培养后得到菌母液，然后将菌母液接种至盛有凤眼莲鲜样的发酵瓶中。

本发明第四方面提供了一种促进凤眼莲基质酶解产糖的微生物菌剂，所述微生物菌剂的活性成分包括上述芽孢杆菌cts-bq1。

本发明的有益效果是：本发明所提供的菌株丰富了野生脱胶菌遗传资源，扩大了脱胶菌全基因组育种的后备库。该菌比报道效果较好的白腐菌更能提高凤眼莲酶解产糖量，效率高，比商业果胶酶经济且效果显著，具有广阔的应用前景。采用检测基质酶解产糖效率的方式检测芽孢杆菌cts-bq1预处理凤眼莲后基质酶解产糖效果的试验中，酶解液中最大糖产量为142mg/g原料干基，产糖效果提高显著。

附图说明

图1：分离菌株预处理凤眼莲后72h酶解产糖量比较。

图2：分离菌株的预处理液糖含量图。

图3：分离菌株的产耗糖比例图。

图4：不同预处理条件对菌株cts-bq1预处理凤眼莲鲜样基质的酶解糖产量的影响。

图5：不同生物预处凤眼莲基质的酶解产糖量比较。

具体实施方式

本发明第一方面提供了一种芽孢杆菌(bacillusaxarquiensis)cts-bq1，已于2017年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2017273,地址：中国，武汉，武汉大学。

上述芽孢杆菌cts-bq1是利用以果胶为唯一碳源的分离培养基从养猪场附近的生长凤眼莲的池塘水中筛选得到的一株细菌。所述芽孢杆菌cts-bq1的菌落形态特征：菌落为污白色、表面光滑湿润，边缘不整齐，革兰氏阳性菌。

芽孢杆菌cts-bq1的16srdna序列如序列表seqidno.1所示，与genbank数据库中的序列进行比对，最终确定菌株cts-bq1为芽孢杆菌。

本发明第二方面提供了上述芽孢杆菌cts-bq1在促进凤眼莲基质酶解产糖中的应用。

在本发明的一个实施例中，通过检测基质酶解产糖效率的方式检测芽孢杆菌cts-bq1预处理凤眼莲后基质酶解产糖的效果，具体方法是：采用上述芽孢杆菌cts-bq1，扩增培养后得到菌母液，将菌母液按2％的接种量接种到含脱胶培养基中，于35℃、145rpm振荡培养3天，固液分离，将固体于65℃下烘干，以30fpu/g底物的纤维素酶负荷酶解烘干固体72h，dns法检测酶解液中还原糖产量。酶解液中最大糖产量为142mg/g原料干基，产糖效果提高显著。可见芽孢杆菌cts-bq1在促进凤眼莲基质酶解产糖具有良好的应用前景。

本发明第三方面提供了一种促进凤眼莲基质酶解产糖的方法，步骤包括：采芽孢杆菌cts-bq1，扩增培养后得到菌母液，然后将菌母液接种至盛有凤眼莲鲜样的发酵瓶中。

优选的，所述菌母液按2％的接种量接种至盛有凤眼莲鲜样的发酵瓶中，在35℃、初始ph＝9的条件下培养3天。

本发明第四方面提供了一种促进凤眼莲基质酶解产糖的微生物菌剂，所述微生物菌剂的活性成分包括上述芽孢杆菌cts-bq1。

下面将结合具体实施例对本发明提供的一株促进凤眼莲基质酶解产糖的芽孢杆菌及其应用予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例中所涉及的培养基配方如下：

分离培养基：(ⅰ)k2so40.01％0.1g，cacl20.2g，nacl0.2g，mgso4·7h2o0.3g，kno30.5g，(nh4)2so40.5g，k2hpo41g，琼脂20g，蒸馏水1l；(ⅱ)果胶1g，琼脂5g，ph7.0，蒸馏水1l。在培养皿中倒双层平板，表层为5ml培养基ⅱ，基层为10ml培养基ⅰ。

水解圈测定培养基：(ⅰ)feso40.01g，cacl20.2g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，kh2po41g，nh4no33g，果胶5g，琼脂20g，ph7.0，蒸馏水1l；(ⅱ)20g琼脂，蒸馏水1l。在培养皿中倒双层平板，表层为10ml培养基ⅰ，基层为10ml培养基ⅱ。

脱胶培养基：凤眼莲鲜样5g，盐溶液150ml，ph约为7.0；盐溶液：mgso4·7h2o0.5g，k2hpo40.5g，(nh4)2so45g，无菌水1l。

斜面培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基。

白腐菌预处理基础培养液：mgso4.7h2o0.05g/l，kh2po40.2g/l，cacl20.01g/l，维生素b1100mg/l，吐温-800.05％，1ml无机盐溶液。无机盐溶液：0.5g/lmnso4·h2o，0.1g/lfeso4·7h2o，0.1g/lcocl2·6h2o，0.1g/lznso4·7h2o，0.01g/lcuso4·5h2o，0.01g/lalk(so4)2·12h2o，0.01g/lh3bo3，0.01g/lna2moo4·2h2o，3.0g/lmgso4·7h2o。

实施例1

本实施例进行了脱胶微生物的初步筛选，具体筛选过程如下:

采集华中农业大学养猪场附近生长凤眼莲的池塘中的池塘水、池塘底泥、南湖水、南湖底泥、野芷湖水、野芷湖底泥、鲜猪粪及生长旺盛凤眼莲菌株。将凤眼莲菌株洗净，剪切成1～2cm的小段，风干表面水分。称取10g底泥(含水)于装有90ml灭菌水的无菌三角瓶中，于常温下125r/min的振荡速度振荡1h后用两层纱布过滤，得到底泥悬浮液；

称取风干后的凤眼莲鲜样5g于无菌三角瓶中，分别加入30ml水样、底泥悬浮液，再加入270ml无菌水，于恒温培养箱中35℃培养至凤眼莲纤维分散，约5d，得到一次增殖培养液。另称取5g凤眼莲鲜样于无菌三角瓶中，分别加入30ml池塘水的一次增殖培养液、池塘底泥的一次增殖培养液，再加入270ml无菌水，于恒温培养箱中35℃培养至凤眼莲纤维分散，约4d，得到二次增殖培养液。吸取1ml二次增殖培养液于含有9ml无菌水的灭菌离心管中，枪头反复润洗3次，摇匀，即得10^-1浓度的稀释液。吸取1ml10-1浓度的稀释液于含有9ml无菌水的灭菌离心管中，枪头反复润洗3次，摇匀，即得10^-2浓度的稀释液。以此重复制备出10^-1～10^-7浓度的稀释菌悬液。每个样品分别吸取0.1ml10^-5、10^-6、10^-7浓度的稀释菌液，于以果胶为唯一碳源的分离培养基中涂布，待表面水分吸干后置于恒温培养箱中35℃倒置培养3d。3d后取培养基中长势较好的4株菌株，将获得的4株菌株于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上划线、纯化4～10次。菌落初筛将上述分离得到的菌株点接于水解圈测定培养基，35℃培养2d。将富集培养分离得到的菌株点接到水解圈测定培养基上，35℃下培养3d，在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/ml的刚果红溶液，10～15min后，倒去刚果红溶液，加入物质的量浓度为lmol/l的nacl溶液，15min后倒掉nacl溶液，此时，产生果胶酶的菌落周围将会出现透明圈。测量筛选菌株的菌落直径及水解圈直径，产生明显水解圈的菌株依次命名为xzf-hq、ctdn-rqb、cts-bq1、nhs-s1、cts-s1、ctdn-hq、yzhs-bq1、yzhs-bq2。

实施例2

本实施例对实施例1得到的脱胶微生物进行了复筛，具体过程如下：

将初筛得到的菌株分别接种到脱胶培养基中，35℃，145rpm，培养3天，同时以不加任何菌的液体解磷培养基作为对照组。培养完成后固液分离，液体用dns法测总还原糖量，固体于65℃下烘干，以30fpu/g底物的纤维素酶负荷酶解72h，dns法检测酶解液中还原糖产量。结果如图1所示，本发明筛选到的上述8株菌预处理凤眼莲后对基质的酶解产糖均有促进效果，同时对预处理液中还原糖均有一定程度的消耗，结果如图2所示；以预处理中还原糖的消耗为菌株处理中的耗糖量，以酶解液中的糖增量为预处理后的产糖量，作得产糖与耗糖的比值见图3，其中以cts-bq1比值最大，消耗最少的糖有最大的产出。

实施例3

本实施例对菌株cts-bq1做出鉴定

(1)菌株cts-bq1的菌落形态及性质

菌落为污白色、表面光滑湿润，边缘不整齐，革兰氏阳性菌。

(2)菌株cts-bq1的分子生物学鉴定

采用分子生物学方法对上述筛选得到的cts-bq1菌株进行鉴定，将该菌株的dna使用通用引物27f，1492r通过pcr扩增，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与genbank数据库中的序列进行blast比对，结果表明，该菌株与芽孢杆菌(bacillusaxarquiensis)的相似度为99％以上。结合形态特征、培养特征及16srrna序列分析，该菌株确定为芽孢杆菌(bacillusaxarquiensis)。

实施例4

本实施例提供了不同培养条件对菌株cts-bq1促进凤眼莲基质酶解产糖的影响，具体过程如下：

设计4因素4水平正交试验探究温度(25℃、30℃、35℃、40℃)、初始ph值(3、5、7、9)、接种量(2％、4％、6％、8％)及处理时间(1d、3d、5d、7d)对芽孢杆菌cts-bq1预处理凤眼莲对基质酶解产糖的影响进行实验。对预处理单因素的不同水平间凤眼莲基质还原糖产量的差异分析结果如图4所示，酶解还原糖产量随温度升高有增加的趋势，不同温度水平之间无显著性差异。初始ph为3、5、7时对酶解产糖无显著影响，而当ph为9时，酶解产糖量较其它水平显著增加。分析后获得芽孢杆菌cts-bq1预处理的最佳条件为温度35、初始ph9、接种量2％、处理时间3d，在该处理条件下酶解产糖量达到142mg/g。

实施例5

本实施例提供了不同生物预处理方法对凤眼莲酶解产糖的影响，具体过程如下：

称取磨碎后的凤眼莲鲜样15g(含水率为92.6％)于250ml锥形瓶中，按固液比1:2.5加入基础培养液，自然ph，封口后于121℃下灭菌。冷却至室温后接种直径为1cm的黄孢原毛平革菌菌种块5片，于28℃下培养10天。培养完成后取出接种块，将样品洗净、65℃烘干称重，测定72h酶解还原糖产量。以不接种黄孢原毛平革菌样品为对照，每个处理设3个重复。

称取磨碎后的凤眼莲鲜样15g(含水率为92.6％)于250ml三角瓶中，按固液比1:30加入ph3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液30ml，封口后于121℃下灭菌。冷却至室温后于50℃水浴锅中预热，按照20u/g底物的酶负荷加入果胶酶酶液，于125r/min振荡速度下反应，预处理72h。处理完成后，固液分离，固体物质用超纯水洗涤至中性，65℃下烘干称重。以不加酶液为对照处理，每个处理设置3个重复。

称取磨碎后的凤眼莲鲜样15g(含水率为92.6％)于250ml锥形瓶中，加入盐溶液150ml，在121℃下灭菌30min，冷却至室温。调整ph为9，按2％的接种量接入cts-bq1菌母液(对照加入2％lb培养液)，在水浴摇床上35℃，145r/min振荡速度下处理3d。处理完成后，用0.45μm的滤膜进行固液分离，固体洗涤至中性，于65℃下烘干称重，每个处理3个重复。

三种生物预处理后的凤眼莲基质酶解产糖效果如图5所示。3种生物预处理中，果胶酶预处理产糖量最高，cts-bq1次之，黄孢原毛平革菌最低。不同处理及其对照比原料产糖量显著提高，黄孢原毛平革菌与其对照之间没有显著差异，cts-bq1与其对照产糖差异显著，果胶酶与其对照产糖差异不显著。cts-bq1预处理后提高效果最为显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>华中农业大学

<120>一株促进凤眼莲酶解产糖的芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1447

<212>rna

<213>芽孢杆菌（bacillusaxarquiensis）cts-bq1

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