本发明涉及保健品及药品领域，具体是一种延长脑细胞寿命的深海鱼提取物的制备方法。
背景技术：
多肽从二十世纪初才开始受到关注，研究发现它区别于蛋白质区别于氨基酸，具有药物的作用。到了上个世纪九十年代才有了长足发展，在不断更新的技术指导下，多肽的应用范围越来越广，作用也越来越大，这才迈进了我们的生活，在我们生活中占据的份额越来越大，多肽类药物高效低毒特异性强具有区别于其他药物的特有优势，正不断影响着我们的生活。而且多肽潜力巨大，是生物科学发展的又一大突破和发展方向。
天然存在的海洋活性多肽由于在生物体中含量低，而且提取困难，难以实现大量生产供给所需，化学人工合成多肽成本昂贵。所以，人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物获得活性多肽这条途径上来。由于海洋生物生存的环境与陆地生物完全不同，如高压、低温、高温和高盐等极端环境，为了适应这些极端的海洋生物环境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，同时，海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。海洋生物蛋白资源是21世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，但我国目前的蛋白类水产品中，除一部分直接食用外，大部分通过简单的加工技术制成食品进入市场，加工技术落后，产品结构单一，产品的附加值低，使得产品在国际市场上的竞争力较差。因此，我国急需对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。
脑细胞是构成脑的多种细胞的通称。脑细胞主要包括神经元和神经胶质细胞。神经元细胞高度分化，不可再生，科学研究显示，人到40岁以后脑细胞数目会逐渐减少，一般人到死亡时脑细胞会消耗掉10%左右。大脑掌管语言、思维记忆及计算等活动，小脑掌握着人体的动作与协调能力，脑细胞的减少会导致人出现记忆力下降，智力减退等症状。
现有技术如授权公告号为cn101503728b的中国发明专利，公开了一种从青占鱼鱼骨中提取复合多肽液的方法。包括以下步骤：将青占鱼鱼骨洗净、绞碎，用去离子水浸泡；过滤除去去离子水，将鱼骨按1∶5-1∶10的质量比例的加入水，按鱼骨质量的1％-5％量按动物蛋白水解酶和中性蛋白酶的质量比为3∶1-1∶3的比例加入酶，调节ph在5.5-8.5，然后在45-70℃温度下酶解；将上述酶解液90-100℃加热，以使酶失活；用亚麻布过滤，滤液在2000-4000rpm离心10-15min，得到的上清液通过gpc凝胶净化，再过滤除菌得到复合多肽液。上述制备方法制备的到的复合多肽纯度不高，且在制备过程中损失量大，提取率不高。蛋白酶均采用陆地蛋白酶，不能对海洋蛋白进行很好的开发。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种制备方法简单，重现性高的延长脑细胞寿命的深海鱼提取物的制备方法，制备得到的深海鱼提取物纯度高，可有效延长人体脑细胞的寿命。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：延长脑细胞寿命的深海鱼提取物的制备方法，包括分步酶解、微滤、二次超滤并纳滤、大孔树脂吸附洗脱和冷冻干燥。得到的深海鱼提取物可抑制内源性核酸内切酶的产生，延缓细胞染色体的dna降解，从而延缓神经元细胞中凋亡程序的表达，有效延长其寿命。分步酶解步骤为在深海鱼鱼糜中加入条斑紫菜蛋白酶和活性短肽酶解，调节ph后加入风味蛋白酶酶解，得到酶解液。深海鱼蛋白上有大量条斑紫菜蛋白酶的酶切位点，酶解后可得到长短不一的肽链，再用风味蛋白酶酶解可得到能有效延长脑细胞寿命的复合多肽。采用其他蛋白酶分步酶解不能得到上述复合多肽。
深海鱼鱼糜中加入20~30倍体积水，条斑紫菜蛋白酶的加入量为5~8wt‰，酶解温度25~35℃，ph为7.0~9.0，酶解时间为30~40min，酶解结束后灭酶。上述酶解条件下，条斑紫菜蛋白酶的酶解效率高又不会造成资源浪费。
风味蛋白酶加入量为1~3wt﹪，酶解ph为6.0~7.0，酶解温度为52~60℃，酶解时间为15~25min，酶解结束后灭酶，过滤取滤液。酶解结束后灭酶。上述酶解条件下，风味蛋白酶的酶解效率高又不会造成资源浪费。
活性短肽的加入量为条斑紫菜蛋白酶质量的10~20﹪，氨基酸序列为scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。上述活性短肽可通过范德华力和静电作用来改变条斑紫菜蛋白酶的三级结构，使条斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明显提高。
微滤步骤为将滤液于20~30℃，0.14~0.27mpa条件下经0.2~0.4μm微滤膜微滤。为了防止大分子蛋白及其他大分子杂质污染超滤膜，需将滤液进行微滤处理。
二次超滤并纳滤步骤为先采用截留相对分子质量20~30kd的膜超滤，再采用截留相对分子质量1~3kd的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于1~3kd的杂质。纳滤可较彻底的去除溶液中的无机盐及分子量小于200da的杂质，对复合多肽进一步进行纯化。
二次超滤的条件分别为，超滤温度为20~30℃，操作压力为0.14~0.25mpa，超滤时间为40~70min；超滤温度为20~30℃，操作压力为0.6~1mpa，超滤时间为1~2h。上述条件下，超滤过程中不会出现过厚的凝胶层，超滤速度也较为理想。
大孔树脂吸附洗脱步骤为将纳滤后的液体浓缩，上样浓度为0.1~0.3g/ml，上样流速为0.4~0.6ml/min，洗脱剂体积为7.7~7.9bv，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为0.8~1.4ml/min。收集最后2/3的洗脱液并低温浓缩。大孔树脂对复合多肽进行吸附和解吸附，平衡吸附量可达14.23mg/g左右，静态吸附率达到90.15%左右和静态解吸率达到86.54%左右，可有效将复合多肽与其他杂质分开。
冷冻干燥步骤为：预冻：-35~-45℃预冻3~5h；冷冻干燥：-45~-35℃，3~5pa冷冻干燥5~7h，-10~-5℃，10~20pa冷冻干燥2~3h；升华干燥：10~15℃，50~60pa升华干燥3~4h；解析干燥:7~14℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到延长脑细胞寿命的深海鱼提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留复合多肽的活性；低压下干燥，复合多肽不易氧化，疗效更好；冻结时复合多肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干复合多肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，复合多肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
作为优选，深海鱼为秋刀鱼或马面鱼或海鲈或金枪鱼或鲮鱼或鳕鱼。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明制备方法简单，每一步均有详细数据，重现性强，适合大规模生产；2）深海鱼蛋白上有大量条斑紫菜蛋白酶的酶切位点，酶解后可得到长短不一的肽链，再用风味蛋白酶酶解可得到能有效延长脑细胞寿命的深海鱼提取物。得到的深海鱼提取物可抑制内源性核酸内切酶的产生，延缓细胞染色体的dna降解，从而延缓神经元细胞中凋亡程序的表达，有效延长其寿命；3）斑紫菜蛋白酶酶解时添加了氨基酸序列为scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc的活性短肽。上述活性短肽可通过范德华力和静电作用来改变条斑紫菜蛋白酶的三级结构，使条斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明显提高。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
延长脑细胞寿命的深海鱼提取物的制备方法，包括分步酶解、微滤、二次超滤并纳滤、大孔树脂吸附洗脱和冷冻干燥。得到的深海鱼提取物可抑制内源性核酸内切酶的产生，延缓细胞染色体的dna降解，从而延缓神经元细胞中凋亡程序的表达，有效延长其寿命。分步酶解步骤为在秋刀鱼鱼糜中加入条斑紫菜蛋白酶和活性短肽酶解，调节ph后加入风味蛋白酶酶解，得到酶解液。秋刀鱼蛋白上有大量条斑紫菜蛋白酶的酶切位点，酶解后可得到长短不一的肽链，再用风味蛋白酶酶解可得到能有效延长脑细胞寿命的复合多肽。采用其他蛋白酶分步酶解不能得到上述复合多肽。
秋刀鱼鱼糜中加入26倍体积水，条斑紫菜蛋白酶的加入量为7wt‰，酶解温度30℃，ph为8.0，酶解时间为32min，酶解结束后灭酶。上述酶解条件下，条斑紫菜蛋白酶的酶解效率高又不会造成资源浪费。
风味蛋白酶加入量为2wt﹪，酶解ph为6.5，酶解温度为55℃，酶解时间为18min，酶解结束后灭酶，过滤取滤液。酶解结束后灭酶。上述酶解条件下，风味蛋白酶的酶解效率高又不会造成资源浪费。
活性短肽的加入量为条斑紫菜蛋白酶质量的13﹪，氨基酸序列为scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。上述活性短肽可通过范德华力和静电作用来改变条斑紫菜蛋白酶的三级结构，使条斑紫菜蛋白酶的酶解活力得到明显提高。
微滤步骤为将滤液于25℃，0.2mpa条件下经0.3μm微滤膜微滤。为了防止大分子蛋白及其他大分子杂质污染超滤膜，需将滤液进行微滤处理。
二次超滤并纳滤步骤为先采用截留相对分子质量20kd的膜超滤，再采用截留相对分子质量2kd的膜超滤，最后将滤过液进行纳滤除盐。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于2kd的杂质。纳滤可较彻底的去除溶液中的无机盐及分子量小于200da的杂质，对复合多肽进一步进行纯化。
二次超滤的条件分别为，超滤温度为25℃，操作压力为0.21mpa，超滤时间为60min；超滤温度为25℃，操作压力为0.8mpa，超滤时间为1h。上述条件下，超滤过程中不会出现过厚的凝胶层，超滤速度也较为理想。
大孔树脂吸附洗脱步骤为将纳滤后的液体浓缩，上样浓度为0.2g/ml，上样流速为0.5ml/min，洗脱剂体积为7.8bv，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为1ml/min。收集最后2/3的洗脱液并低温浓缩。大孔树脂对复合多肽进行吸附和解吸附，平衡吸附量可达14.54mg/g，静态吸附率达到90.21%和静态解吸率达到86.55%，可有效将复合多肽与其他杂质分开。
冷冻干燥步骤为：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到延长脑细胞寿命的秋刀鱼提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留复合多肽的活性；低压下干燥，复合多肽不易氧化，疗效更好；冻结时复合多肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干复合多肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，复合多肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
实施例2：
延长脑细胞寿命的深海鱼提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）分步酶解：在鳕鱼鱼糜中加入25倍体积水，搅拌均匀后加入6wt‰条斑紫菜蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶质量10%的活性短肽酶解。活性短肽的氨基酸序列为scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。酶解温度30℃，ph为8.0，酶解时间为32min，酶解结束后沸水浴3min灭酶。调节ph后加入3wt﹪风味蛋白酶酶解。酶解ph为6.5，酶解温度为55℃，酶解时间为18min，酶解结束后沸水浴3min灭酶，得到酶解液；
2）微滤：将滤液于25℃，0.2mpa条件下经0.3μm微滤膜微滤。待滤液微滤至加入量80%时，向截留液中加入适量水，搅拌，继续微滤，待微滤液收集至体积等于滤液加入量时停止微滤；
3）二次超滤并纳滤：先采用截留相对分子质量20kd的膜超滤，超滤温度为25℃，操作压力为0.21mpa，超滤时间为60min。再采用截留相对分子质量2kd的膜超滤，超滤温度为25℃，操作压力为0.8mpa，超滤时间为1h，最后将滤过液进行纳滤除盐；
4）大孔树脂吸附洗脱：将hpd100型非极性大孔树脂置于烧杯中，用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨胀，抽滤后加入95%乙醇洗涤大孔树脂至洗涤液加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗净乙醇，真空抽滤备用。将纳滤后的液体浓缩，上样浓度为0.2g/ml，上样流速为0.5ml/min，洗脱剂体积为7.8bv，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为1ml/min。收集最后2/3的洗脱液并低温浓缩；
5）冷冻干燥：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到延长脑细胞寿命的鳕鱼提取物。得到的鳕鱼提取物可抑制内源性核酸内切酶的产生，延缓细胞染色体的dna降解，从而延缓神经元细胞中凋亡程序的表达，有效延长其寿命。
实施例3：
延长脑细胞寿命的深海鱼提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）分步酶解：在鳕鱼鱼糜中加入27倍体积水，搅拌均匀后加入7wt‰条斑紫菜蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶质量15%的活性短肽酶解。活性短肽的氨基酸序列为scasvckarcracrrgcgsvfcrclrc。酶解温度30℃，ph为8.0，酶解时间为32min，酶解结束后沸水浴3min灭酶。调节ph后加入3wt﹪风味蛋白酶酶解。酶解ph为6.5，酶解温度为55℃，酶解时间为18min，酶解结束后沸水浴3min灭酶，得到酶解液；
2）微滤：将滤液于25℃，0.218mpa条件下经0.3μm微滤膜微滤。待滤液微滤至加入量80%时，向截留液中加入适量水，搅拌，继续微滤，待微滤液收集至体积等于滤液加入量时停止微滤；
3）二次超滤并纳滤：先采用截留相对分子质量20kd的膜超滤，超滤温度为25℃，操作压力为0.18mpa，超滤时间为50min。再采用截留相对分子质量1kd的膜超滤，超滤温度为25℃，操作压力为0.8mpa，超滤时间为1.8h，最后将滤过液进行纳滤除盐；
4）大孔树脂吸附洗脱：将hpd100型非极性大孔树脂置于烧杯中，用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨胀，抽滤后加入95%乙醇洗涤大孔树脂至洗涤液加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗净乙醇，真空抽滤备用。将纳滤后的液体浓缩，上样浓度为0.2g/ml，上样流速为0.5ml/min，洗脱剂体积为7.9bv，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为1ml/min。收集最后2/3的洗脱液并低温浓缩；
5）冷冻干燥：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到延长脑细胞寿命的鳕鱼提取物。得到的鳕鱼提取物可抑制内源性核酸内切酶的产生，延缓细胞染色体的dna降解，从而延缓神经元细胞中凋亡程序的表达，有效延长其寿命。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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2025