一种抑制膀胱癌转移的新靶标及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑制膀胱癌转移的新靶标及其应用。

背景技术：

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。近年来，据统计显示膀胱癌发病率呈逐渐上升趋势。膀胱癌中70-80%被诊断患有非肌肉浸润性肿瘤，患有非肌肉浸润性膀胱癌病人的5年存活率接近90%，因缺乏较为完善的分子靶标及相应措施而较难治愈，使得在该群体中复发率高达50-70%。除此之外，复发的膀胱癌的15%会发展成肌肉浸润性疾病，肌肉浸润性膀胱癌病人5年存活率只接近60%，且近80%淋巴结转移病人在诊断后死于第一个5年期。因此，研发新型药物及新防治措施是防治膀胱癌转移工作中迫在眉睫的任务，而新分子靶标鉴定则是其中的基础环节，该领域基础研究的突破有望为膀胱癌转移防治提供新的理论依据，提高人民群众的生活质量，是膀胱癌研究中的重要领域。

microrna（mirna）是一类长度约18-25nt的小分子非编码rna，通过其“种子区”（2–8个核苷酸）与靶mrna的3'utr互补配对，调控该基因转录后的mrna的稳定性及蛋白翻译。mirna与靶mrna互补的程度决定了mirna发挥功能的作用模式。当mirna与靶mrna的3'utr不完全互补配对时，该基因的翻译过程受到抑制;完全互补配对时，靶mrna在核酸内切酶作用下降解。mirna仅占人类基因组的1–3%，但是它们却调控将近33%的人类基因组，几乎参与了与肿瘤相关的所有过程，包括增殖、分化、凋亡、转移、血管生成、免疫应答等。目前，已鉴定出近3000种mirna，并且已有mirna与转移相关报道。其中mir-200家族成员是参与emt的典型调节因子，mir-200家族成员(mir-200a–c,mir-141和mir-429)表达的缺失与zeb1及zeb2表达增加有关，促进emt的进程，从而促进肿瘤转移。然而他们中的绝大部分在膀胱癌转移中的作用及其分子机制仍不清楚。因此新mirna分子靶标的鉴定及机制阐明，有助于全面了解mirna的生物学功能，同时也有助于促进新高效防治膀胱癌转移药物的研发及公共卫生防治的新举措的实施。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供mir-3648作为抑制膀胱癌转移的新靶标及其应用。

本发明所采取的技术方案如下：mir-3648表达抑制剂在制备抑制膀胱癌转移的药物中的应用。

所述mir-3648表达抑制剂为mir-3648inhibitorsponge表达质粒。

一种预防或/和治疗膀胱癌的组合物，组合物包含：

（1）mir-3648表达抑制剂；

（2）药剂学上能够接受的载体。

包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙酸吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并非局限与此。

本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

所述mir-3648(geneid:100500862)表达抑制剂为mir-3648inhibitorsponge表达质粒。

一种检测mir-3648表达的试剂，所述mir-3648表达的试剂包含基于荧光定量pcr定量检测方法的试剂,荧光定量pcr定量检测方法的试剂包含一对特异性引物，引物序列为5’-agccgcggggatcgccgag-3’与通用引物(qiagen公司提供)。

本发明的有益效果如下：本发明以膀胱癌t24t，umuc3细胞为模型，抑制mir-3648可在体内外抑制膀胱癌细胞迁移和浸润。可见，可以通过抑制mir-3648进而降低膀胱癌细胞的转移能力，最终起到预防或/和治疗膀胱癌转移的作用。利用实时荧光定量pcr技术，生物信息学分析tcga数据库等方法检测临床大部分高级别浸润性膀胱癌组织中mir-3648表达均呈显著上调趋势。可见，通过检测mir-3648的表达，可以辅助诊断或/和预后检测膀胱癌。

附图说明

图1为生物信息学分析tcga数据库中mir-3648在膀胱癌的表达。

图2a、2b为mir-3648在人膀胱癌组织样本和人膀胱癌细胞中表达显著上调的qpcr图，normal是正常组织，tumor是肿瘤组织。

图3a、3b为实时荧光定量pcr检测t24t-mir-3648-inhibitor，umuc3-mir-3648-inhibitor及其空载稳定转染细胞中mir-3648表达的柱状图，p<0.001。

图3c、3d为抑制mir-3648表达而抑制膀胱癌细胞t24t、umuc3浸润能力及定量分析结果。通过transwell实验证实抑制mir-3648表达后膀胱癌细胞浸润能力显著降低，p<0.05。

图4a、4b为mir-3648促进膀胱癌细胞t24t、umuc3浸润及定量分析结果。通过transwell实验证实mir-3648后膀胱癌细胞

图5为抑制mir-3648表达而抑制膀胱癌细胞t24t体内肺转移。将t24t-mir-3648-inhibitor及其对照细胞经尾静脉注入小鼠体内，待3个月后将小鼠处死，取小鼠肺组织，采用bouin’s液染色24h后拍照(图a)，对其转移点计数（图b），最后通过苏木精-伊红染色法（he）进一步证实肺组织的病理组织学变化(图a)，p<0.01。

图6为抑制mir-3648表达而抑制膀胱癌细胞umuc3体内肺转移图，p<0.01。

具体实施方式

下面结合附图以及本发明的具体实施方式，可以更好地说明本发明。

实验实施例1

生物信息学分析tcga数据库中mir-3648在膀胱癌病人中表达上调。

1）生物信息学下载并分析tcga数据库中的rna-seqv2和mirna-seq的level3数据。

2）集合样本的barcode信息，选取primarysolidtumor（sampeid以-01结尾）和solidtissuenormal（samplesid以11结尾）的样本作分析，共19对，38个样本。用r包edger分析癌症（tumor）和癌旁（normal）配对的样本中mirna差异表达量，该包采取的是对数表达比率的加权截断均值（trimmedmeanofmvalues，tmm）归一化方法。为降低假阳性（falsediscoverrate,fdr）,p-value用benjamini–hochberg(bh)方法校正。差异显著性的筛选阈值为log2fold-change(logfc)不小于3，fdr<0.01，其中mir-3648在膀胱癌中显著上调。于是进一步分析mir-3648在每一对癌症和癌旁样本中的变化，结果如图1所示，19例病人中，有18例表达量显著升高，其余1例表达量降低。

实验实施例2

临床膀胱癌样本和人膀胱癌细胞中mir-3648的表达

1)组织样本

收集2014年3月至2016年12月期间在温州医科大学第一附属医院泌尿外科行膀胱癌手术的33例患者的组织标本。收集患者姓名、性别、年龄、病理号码、病理等资料。入选患者大部分为男性且均经膀胱全切术,术前活检和术后病理检查证实为膀胱尿路上皮癌。每例标本均采集肿瘤组织,同时距肿瘤周围约3cm处切取正常组织作为对照。每份样本在组织离体后冻存于液氮灌中。实验操作经伦理审查批准。

2)组织/细胞总rna提取

a.从-80℃冰箱中取出膀胱癌临床样本，每个样本约30-50mg于ep管中，放置冰上；细胞约1x107个以内。

b.加入700μl的qiazol混匀，组织需要剪碎。

c..彻底混匀后，室温放置5-10min。组织需要使用匀浆器以最大转速将组织匀碎，通常2min，整个过程在冰上进行。

d.加入140μl氯仿（chloroform），剧烈震荡1min，室温静置2-3min。

e.将样品在12000g4℃离心15min，离心后吸取上清至新的去酶ep管。

f.加入1.5倍体积100%乙醇（通常是525μl），上下颠倒混匀数次，作为样本备用于下一步；

g.将rneasyminispincolumn置于2ml离心管中，吸取上述700μl样本至离心柱中，室温离心30s，速度10000rpm，弃去滤液。

h.将步骤7重复，直至样本全被过滤。

i.向离心柱中加入700μlbufferrwt，转速10000rpm，室温离心30s，弃去滤液；

j.向离心柱中500μlbufferrpe，转速8000g，室温离心30s，弃去滤液；

k.再次向离心柱中加入500μlbufferrpe入柱，8000g转速离心1min,再以10000rpm离心1min，以此更能有效富集rna，弃去滤液。

l.将rneasyminispincolumn置于新的2ml离心管，1000g室温离心2min。

m.将离心柱置于新的1.5ml去酶ep管中，加入rnase-freewater30-50μl（直接加在膜上），10000rpm，室温离心1min，收集滤液。

n.吸取滤液至离心柱膜上，重复13步，收集滤液。

o.使用biodrop测定浓度，封口膜密封后保存于-80℃。

3)mirna逆转录

配制rt反应体系如下，冰上操作。

组成成分体积

5xmiscripthispecbuffer4μl

10xmiscriptnucleicsmix2μl

miscriptreversetranscriptasemix2μl

rna2μg

rnasefreeh2oaddto20μl

total20μl

将上述体系振荡混匀后点离，放入pcr仪中，

反应程序:37℃,70min→95℃,5min→4℃∞，反应程序结束后，收取样品放置冰上2min，然后用封口膜密封后至-80℃保存或用于下一步实验。

4)荧光定量pcr检测mirna的表达

将所需组织、细胞获得cdna后，使用美国qiagen公司所购miscript®sybr®greenpcrkit进行pcr，步骤如下：

a.配制pcr反应体系如下，冰上操作。

组成成分体积

2xquantitectsybrgreenpcrmastermix10μl

10xmiscriptnucleicsmix2μl

10xmiscriptprimerassay2μl

cdna1μl

rnase-freewateraddto20μl

total20μl

b.充分混匀以上反应体系，然后加入至pcr管中，每个样本3个复孔，短暂离心以便试剂混匀且不能有气泡，置于pcr仪中运行程序。

c.q-pcr反应，使用引物为：5’-agccgcggggatcgccgag-3’与通用引物(qiagen公司提供)，预变性95℃，15min,循环条件如下，扩增40个循环。

变性95℃，15秒，退火55℃，30秒，延伸70℃，30秒

实验实施例3

抑制mir-3648表达显著降低膀胱癌细胞浸润能力

1)选用t24t，umuc3细胞作为研究对象采用lv3-pglv-h1-gfp-puro-mir-3648-inhibitor-sponge质粒在t24t，umuc3细胞中抑制mir-3648，并建立稳定转染细胞t24t（mir-3648-inhibitor），umuc3（mir-3648-inhibitor）及其对照t24t-vector，umuc3-vector，以u6作为内参，采用2-△△ct相对定量计算mir-3648在稳定转染细胞中基因表达的倍数变化。结果如图3a，3b显示，成功构建mir-3648抑制的稳定转染细胞系，且差异具有统计学意义。

2)采用transwell实验，将t24t（mir-3648-inhibitor），umuc3（mir-3648-inhibitor）以及对照细胞用0.1%对应的培养基重悬细胞之后种于上室中，下室采用全培培养，24h后采用3.7%甲醛固定5min，100%甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色15mi并拍照，并对迁移和浸润的细胞数定量分析，如图3c,3d所示，其差异具有统计学意义。

实验实施例4

mir-3648显著升高膀胱癌细胞浸润能力

1)选用t24t，umuc3细胞作为研究对象采用lv3-pglv-h1-gfp-puro-mir-3648质粒在t24t，umuc3细胞中过表达mir-3648，并建立稳定转染细胞t24t（mir-3648），umuc3（mir-3648）及其对照t24t-vector，umuc3-vector，以u6作为内参，采用2-△△ct相对定量计算mir-3648在稳定转染细胞中基因表达的倍数变化。结果如图4a，4b显示，成功构建mir-3648过表达的稳定转染细胞系，且差异具有统计学意义。

2)采用transwell实验，将t24t（mir-3648），umuc3（mir-3648）以及对照细胞用0.1%对应的培养基重悬细胞之后种于上室中，下室采用全培孵育，24h后采用3.7%甲醛固定5min，100%甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色15min并拍照，并对迁移和浸润的细胞数定量分析，如图4c,4d所示，其差异具有统计学意义。

实验实施例5

抑制mir-3648表达显著抑制裸鼠肺转移灶的形成

裸鼠肺转移实验

1）动物饲养

购买balb/c-nu裸鼠，4周龄，适应性饲养1周。所有动物实验均依据温州医科大学伦理委员会相关规定。

2）尾静脉注射

t24t-vector,t24t-mir-3648-inhibitor,umuc3-vector,umuc3-mir-3648-inhibitor细胞处于对数生长期，弃去培养基，pbs洗一遍；0.05%胰酶消化2min后，培养基终止，离心后用pbs重悬，检测细胞活力并计数细胞总数，将细胞浓度调整至2×106/ml。

3）裸鼠注射部位尾部用75%酒精消毒。接种前充分混匀细胞，1ml无菌注射器吸取100ul细胞悬液，将细胞悬液注射于裸鼠尾静脉，每种细胞注射9只裸鼠。

4）3个月后，将裸鼠麻醉，取肺组织，采用bouin’s液染色24h后拍照并对其转移点计数，最后通过苏木精-伊红染色法（he）进一步证实肺组织的病理组织学变化，如图5，图6所示，抑制mir-3648抑制膀胱癌细胞t24t、umuc3体内肺转移。

以上所述仅为本发明的实验实施例，并非用来限制本发明的保护范围；本发明的保护范围由权利要求书中的权利要求限定，并且凡是依发明所作的等效变化与修改，都在本发明专利的保护范围之内。