一种过表达MGST1基因人肺腺癌细胞的构建方法及其应用与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，具体的，涉及一种能够过表达mgst1基因的人肺腺癌细胞的构建方法及其应用。
背景技术：
：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在我国及全世界均高居首位。肺癌按病理组织类型分为两种，即非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer，sclc)，其中nsclc约占肺癌类型的80％。肺腺癌是最常见的nsclc组织类型之一，其发现时常处于晚期，预后较差，因肺腺癌而造成的死亡数居我国所有癌症相关性死亡数的第一位。针对肺癌的治疗手段主要有手术、化疗、放疗、靶向治疗和生物治疗，虽然近年疗效有较大的进展，但5年生存率仍不足15％，预后较差。因此探索肺腺癌的发病机制，探寻治疗肺腺癌新的治疗靶点具有重大意义。基因工程(geneticengineering)，又称为基因重组技术，是以分子遗传学为理论基础在体外对dna进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因免疫、基因治疗、基因疫苗等。其三要素分别为：载体、目的基因、工具酶。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。mgst1基因编码的蛋白在肝脏中高表达，通过催化亲核性的谷胱甘肽和各种亲电子试剂的结合反应发挥解毒作用，因此，mgst1在肿瘤化疗药物耐药方面研究较多。近几年研究报道mgst1在食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达增高，其机制未阐明，同时其在人肺癌中的研究未见报道。鉴于以上mgst1在其他的恶行肿瘤中高表达的现象，以及基因重组技术的优势，同时为了对肺腺癌细胞进行更多的研究，本发明采用基因重组技术，针对mgst1基因，构建重组真核表达载体pcdna3-mgst1，并将其转染低表达mgst1的人肺腺癌细胞，构建稳定转染mgst1基因的细胞株，为研究mgst1功能提供了良好工具，亦为进一步研究mgst1基因在肺腺癌等恶性肿瘤中的生物学功能打下基础，同时也为研究肺腺癌及其它恶性肿瘤中mgst1基因的功能提供有效实验方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新型的稳定过表达真核重组质粒的肺腺癌细胞及其制备方法，并证明所述稳定过表达重组质粒pcdna3-mgst1的肺腺癌细胞为功能研究提供了良好的实验工具，也为研究人肺腺癌及其它恶性肿瘤中mgst1基因的功能提供有效实验方法。人mgst1基因已在genbank注册，注册号nm_001260511.1，定位于12p12.3，全长937bp，编码155个氨基酸，其核苷酸序列为图10中所述。我们前期研究结果发现人mgst1基因在人肺腺癌组织中高表达。本发明所述的真核重组质粒，由图11所示的核苷酸序列中的mgst1目的片段与真核载体pcdna3构建而成，所述mgst1目的片段是起始密码子下游84bp～551bp的核苷酸序列。一种pcdna3-mgst1真核重组质粒转染spc-a-1细胞的方法，其包括如下步骤：(1)通过pcr(聚合酶链式反应)合成人的mgst1目的基因片段；(2)将上述获得的mgst1目的基因片段与真核质粒pcdna3连接，形成真核重组质粒，其中该插入mgst1目的基因的酶切位点分别为hindⅲ和kpnⅰ。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中进行培养，然后挑选出单克隆进行pcr凝胶电泳进行阳性克隆的筛选；(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行dna序列分析。(4)将上一步中获得序列正确的重组质粒pcdna3-mgst1转染spc-a-1人肺腺癌细胞，并用g418筛选稳定过表达mgst1的spc-a-1细胞，观察稳定过表达mgst1的细胞生物学特性。(5)实验表明，稳定过表达mgst1可促进人肺腺癌细胞spc-a-1的增殖，抑制人肺腺癌细胞spc-a-1的凋亡。由此可见，采用本发明的构建稳定过表达mgst1基因细胞的方法，有助于研究mgst1基因功能，并且为研究mgst1基因在人肺腺癌中发病的作用机制提供了分子生物学工具。附图说明图1为本发明真核重组质粒的载体pcdna3的结构示意图。图2为电泳测试图谱。其中，a为本发明目的mgst1dna片段pcr扩增产物的电泳图谱，b为筛选重组质粒pcdna3-mgst1转入大肠杆菌的阳性克隆的电泳图谱，c为本发明真核重组质粒pcdna3-mgst1的酶切鉴定图谱，d为本发明真核重组质粒pcdna3-mgst1的测序图谱。图3为本发明真核重组质粒pcdna3-mgst1的人肺腺癌细胞spc-a-1显微镜下照片。其中，a图为阴性对照组；b图为转染组pcdna3；c图转染组pcdna3-mgst1。图4为本发明稳定过表达mgst1的人肺腺癌细胞spc-a-1中mgst1mrna的表达柱状图。图5为本发明稳定过表达mgst1的人肺腺癌细胞spc-a-1中mgst1蛋白的表达western-blot电泳条带图。图6为稳定过表达mgst1实验组的人肺腺癌细胞spc-a-1和稳定转染空载体pcdna3的对照组的人肺腺癌细胞spc-a-1的增殖图。图7为稳定过表达mgst1实验组的人肺腺癌细胞spc-a-1和稳定转染空载体pcdna3的对照组的人肺腺癌细胞spc-a-1的平板克隆形成图及柱状图。图8为h2o2诱导稳定过表达mgst1实验组的人肺腺癌细胞spc-a-1和h2o2诱导稳定转染空载体pcdna3的对照组的人肺腺癌细胞spc-a-1的流式凋亡图及凋亡分布表。图9为h2o2诱导稳定过表达mgst1实验组的人肺腺癌细胞spc-a-1和h2o2诱导稳定转染空载体pcdna3的对照组的人肺腺癌细胞spc-a-1的caspase凋亡蛋白western-blot电泳条带图。图10为mgst1全长序列。图11为mgst1编码区。以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。需要说明的是，下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件、实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中的条件、按照制造厂商所建议的条件。具体实施方式1：构建重组真核表达载体pcdna3-mgst11、mgst1目的基因的克隆。(1)设计mgst1过表达的引物。根据genebank的编码序列，用primerpremier5软件设计mgst1过表达引物的上游引物：5'-cccaagcttggcttgctgcttcctcctc-3'(含hindiii限制酶切位点cccaagctt)，和下游引物：5'-cggggtacccctctgctcccctcctacct-3'(含kpni限制酶切位点cggggtacc)(2)通过pcr合成mgst1目的基因。pcr反应的条件和体系设定如下：反应条件：预变性：98℃10s；变性：98℃10s，退火：60℃15s，延伸：72℃45s，共33个循环；4℃保存。反应体系hsdnapolymerase(takara公司)反应体系的物质对应的体积5×psbuffer4μldntpmix1.6μlpcrforwardprimer(10mol)0.4μlpcrreverseprimer(10mol)0.4μlprimestarhsdnapolymerase0.2μlcdna2μlddh2o11.4μl如图2中，a图所示，通过pcr成功扩增出人mgst1基因编码序列(cds)，pcr产物电泳后在616bp处获得扩增产物条带，且该pcr产物与用primerpremier5软件设计的目的基因片段大小基本一致。由此可以证明，通过pcr可以成功合成mgst1目的基因。(3)纯化回收pcr产物。step1、向pcr合成的产物(去除掉电泳的部分)中加入pcr合成的产物(去除掉电泳的部分)的3倍体积的bufferpcr-a，混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液。step2、将制备管置回2ml离心管，加700lbufferw2，12,000×g离心1min，弃滤液。step3、将制备管置回2ml离心管，加400lbufferw2，12,000×g离心1min，弃滤液。step4、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加25-30leluent或去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱dna。step5、用nanodrop2000测总dna的浓度。2、真核表达载体线性化与mgst1基因连接。(1)分别对载体pcdna3和目的基因mgst1进行酶切反应。反应条件：37℃用hindiii和kpni限制性内切酶双酶切1h。酶切反应溶液的配制：pcdna3(50μl)mgst1dna片段(30μl)10×mbuffer5μl3μlhindiii1.5μl1μlkpni1.5μl1μldna<1μg<200ngddh2o42μl-dna的体积25μl-dna的体积混匀后，封口膜封口，37℃水浴1h；(2)回收酶切反应产物。用axygen公司的pcr清洁回收试剂盒回收上一步中的酶切产物。(3)连接反应。将回收后的酶切反应产物载体pcdna3和目的mgst1片段用于下一步的连接反应，所述的连接反应体系如下：备注：mgst1dna片段中计算出的质量，采用如下公式进行计算：目的片段mgst1的质量＝(3～10)*40ng，其中40ng为pcdna3的质量，且pcdna3的长度为5.4kbp。mgst1的长度为616bp。以上体系混匀后16℃连17h；3、用真核重组质粒pcdna3-mgst1转化dh5α感受态细胞。(1)真核重组质粒pcdna3-mgst1转化dh5α感受态细胞的步骤如下：step1:将10μl的目的-载体连接产物加入dh5α细胞中，冰上放置30min。step2:42℃水浴，90s。step3:冰上2min。step4:加无氨苄抗生素的lb液体培养基(tryptone1g，yestextract0.5g，nacl1g，加100ml双蒸水高温高压消毒)900μl，37℃，10min。step5:37℃摇床摇45min。step6:涂在含氨苄抗生素的lb固体培养基(tryptone1g，yestextract0.5g，nacl1g，agar1.5g加100ml双蒸水高温高压消毒)上，涂板后37℃温箱孵育14-16h。step7:挑取单个克隆菌落用于pcr鉴定阳性菌落。(2)鉴定菌落是否为阳性。step1:挑取上述存活在含氨苄抗生素的lb固体培养基上的菌落中的五个克隆，编号为3-7。菌落摇菌过夜，取2ul用于pcr模板进行反应。step2:pcr反应：预变性：98℃10s；变性：98℃10s，退火：60℃15s，延伸：72℃45s，共33个循环；4℃保存。step3：将上述pcr产物取10ul用于3％琼脂糖电泳鉴定阳性克隆，电泳结果(如图2中b所示)显示3-7均为阳性克隆，其中，1为阳参(以cdna为模板)，2为阴性对照(以含氨苄的lb培养液为模板)。step4:将上一步中筛选出来的阳性菌落培养过夜提取质粒，然后进行双酶切鉴定。反应体系20ul，酶切电泳结果(如图2中c所示)1为未双酶切质粒，2为双酶切质粒。step5、将酶切鉴定结果为阳性的质粒进行dna测序，测序结果如图2中d所示，将该测序结果通过blast比对，发现与genebank中公布的序列一致，目的基因片段长度实为616bp，即可证明pcdna3-mgst1重组质粒构建成功。具体实施方式2：稳定过表达mgst1基因的人肺腺癌细胞的构建1、细胞培养。用含10％的胎牛血清的rpmi-1640medium培养基(从gibco公司购买)于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养人肺腺癌细胞株spc-a-1(从美国atcc公司购买)至铺满培养瓶。2、真核表达质粒pcdna3-mgst1转染人肺腺癌spc-a-1细胞株。step1:处于对数生长期的spc-a-1细胞胰酶消化后，制成单细胞悬液，细胞计数。step2：将spc-a-1细胞接种于6孔板中(每孔约5.0×105个细胞)，接种12-24h时用于转染，分为标记为lip2000脂质体阴性对照组、pcdna3质粒转染对照组(pcdna3)和pcdna3-mgst1重组质粒转染组(pcdna3-mgst1)。step3:取纯化的pcdna3及pcdna3-mgst1质粒各4μg，按照真核转染试剂lip2000说明书(a液配置：4μg+200μlrpmi-1640medium无血清、无抗生素培养基混合均匀；b液配置：8μllipofectamine2000invitrogen公司+200μldmem无血清、无抗生素培养基，混合均匀；室温静置5min；c液配置：a液+b液，混合均匀，室温静置20min)，将质粒转染肺腺癌细胞spc-a-1。step4:转染48h后加入含2mg/mlg418的完全培养基，每2天更换一次培养基，同时以未转染质粒的spc-a-1细胞作为阴性对照。筛选14d后，阴性对照组细胞全部死亡，转染pcdna3和pcdna3-mgst1组的细胞均有抗g418的克隆长出。step5：运用有限稀释法将各转染组细胞传于96孔细胞培养板中培养；step6：培养10d左右，挑选单克隆细胞胰酶消化传至48孔细胞培养板中生长，待细胞长到90％左右融合度时传至6孔细胞培养板，扩大培养，并及时保种。3、总rna提取。step1：去除pcdna3及pcdna3-mgst1瓶中旧培养基，预冷的pbs洗3次，将瓶中的pbs完全吸净；step2:向培养瓶中加入适量的trizol裂解液(25cm3的培养瓶加1mltrizol)，放于冰上裂解10min左右，反复吹打，使细胞完全裂解，将细胞裂解液吸至ep管中，进行下一步或放置于-80℃冰箱内备用。step3:向ep管中，加入200μl氯仿，来回震荡数次，室温静置5min。step4:静置后放置预冷的离心机中，4℃，12000rpm，30min。step5:吸取上层上清至无rna酶的ep管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀后4℃离心，12000rpm，15min。step6:吸去上清，向离心管中加75％乙醇1ml，悬浮ep管底部rna沉淀进行洗涤，4℃离心，12000rpm，10min。step7:弃掉乙醇，室温放置约15min，待乙醇挥发干净。step8:根据rna沉淀量加适量depc水(25cm3的培养瓶提取的rna加35μldepc水)，4℃冰箱溶解30min或过夜完全溶解。step9：nanodrop2000测总dna的浓度和纯度，保证每个样本的od250/od280的值在1.8～2.0之间控制rna质量。4、cdna第一链的合成配制逆转录反应溶液(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser10μl)：去基因组dna反应混匀后42℃水浴2min，4℃放置待用反转录反应primescriptrterzymemixⅰ0.5μlrtprimermix0.5μl5×primescriptbuffer22μlrnasefreeh2o2μl将去基因组dna反应溶液和反转录反应溶液混匀后，进行逆转录，反应条件为37℃15min，85℃30s。合成的cdna进行放置-20℃冰箱内备用。5、荧光定量pcr实验step1:荧光定量pcr引物设计。在primerbank搜索得到人(homosapiens)mgst1基因荧光定量pcr所需引物及内参β-actin引物序列，引物序列mgst1上游引物：5'-atgacagagtagaacgtgtacgc-3'下游引物：5'-tacaggaggccaattccaaga-3'β-actin上游引物：5'-catgtacgttgctatccaggc-3'下游引物：5'-ctccttaatgtcacgcacgat-3'step2:荧光定量pcr扩增。将合成的cdna用双蒸水稀释10倍，放于冰上备用。按照premixextaqtmii说明书配制反应溶液：共10μl，震荡混匀放于冰上；以β-actin为内参基因对照，每个样品设3个复孔；pcr程序测定，两步法step195℃30s，step295℃5s40个循环，step3:用2–δδct法分析数据。分别检测实验组6株稳定过表达mgst1的人肺腺癌细胞株及对照组mgst1基因的mrna的表达水平。反应完毕后对实验结果进行分析,实验结果如图4所示，6株稳定过表达mgst1的人肺腺癌细胞株mgst1基因相对表达水平均比对照组的高(p<0.01)。具体实施案例3：westernbolt检测mgst1目的基因表达1、总蛋白提取(冰上操作)。将细胞收集于离心管内离心，2000rpm，4min，预冷的pbs洗两次，根据细胞量加入合适体积的ripa(10μl/ml的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，吹打混匀，ep管封口膜封闭后放于4℃细胞碎裂超声仪中，500watt，裂解20min；14000g，20min离心，沉淀细胞碎片，抽取上清移至ep管中，-80℃保存备用。2、bca蛋白定量法测定蛋白质含量。将2mg/ml的蛋白标准品储存液倍比稀释，稀释后蛋白标准品浓度分别为：2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml；bca试剂盒中a液与b液按50:1配制成bca工作液，充分混匀后放置冰上待用；向含5μl待测蛋白的ep管中加入20μl双蒸水，将目的蛋白浓度稀释5倍，置于冰上；取10μl的蛋白标准品和待测蛋白加入96孔板内，并设一个平行复孔，加样顺序为ddh2o、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、样品1、样品2、样品3……；每个蛋白孔中加80μlbca工作液，轻轻摇动96孔板，液体混匀后放置37℃恒温箱中孵育30min；全波长扫描仪在562nm波长处扫描测定od值，绘制标准曲线、计算蛋白浓度。3、sds-page电泳。样品制备：经过定量后的蛋白样品按体积加入5×sds上样缓冲液，100℃沸水中煮5min蛋白变性；每孔加入50ug蛋白，以起始电压80v电泳，待样品电泳至分离胶，电压调整为100v，继续电泳约1.5h，溴酚兰刚跑出凝胶即终止电泳。4、转膜。根据分子量大小选择不同孔径的pvdf膜，分子量小的选择小孔径的膜，将0.22μm的pvdf膜放于甲醇中浸泡1min，然后置于预冷的1×湿转转膜缓冲液中浸泡3min；将厚滤纸浸入湿转转膜缓冲液中，使用三明治夹子，膜的顺序为正极(夹子白色面)－海绵垫－滤纸－pvdf膜－胶－滤纸－海绵垫－负极(夹子黑色面)，用玻璃棒推赶每一层气泡；将三明治转膜夹放入转膜槽内，黑色面连黑色电极(负极)，白色面连红色电极(正极)，倒入预冷的湿转转膜缓冲液，将转膜槽放置冰盒内；接通电源，恒压100v，转膜100min。5免疫反应。转膜后，将膜放入5％的脱脂奶粉的封闭液(含1×tbs，0.1％tween20)溶液中，室温下摇床上封闭2h。tbst液在摇床上洗膜2次，每次5min。5％脱脂奶粉稀释的一抗4℃孵育过夜。tbst液在摇床上洗膜3次，每次5min。tbst稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育90min，tbst液在摇床上洗膜3次，每次5min。6曝光。将保鲜膜紧密的平铺在暗盒里，确保无皱褶，把pvdf膜蛋白面朝上平铺在保鲜膜上，将ab混合液均匀的涂在pvdf膜上，用保鲜膜将pvdf膜完全盖住；在暗室，将胶片压在pvdf膜上，盖紧暗盒，根据荧光强度确定压片张数和压片时间；将压好的胶片浸于显影液中，胶片出现清晰的条带时，放于双蒸水中终止显色；显色后的胶片浸于定影液中，胶片洗净，晾干后用扫描仪进行扫描，保存图片。实验结果如图5所示，6株稳定过表达mgst1的人肺腺癌细胞株mgst1基因蛋白表达水平均比对照组的高。具体实施案例4：过表达mgst1的基因后对人肺腺癌细胞株spc-a-1增殖情况的影响采用mts实验来检测人肺腺癌细胞株spc-a-1的增殖情况。取处于生长指数期的对照组pcdna3和实验组pcdna3-mgst1细胞，细胞计数后接种于96孔细胞培养板，每孔3000个细胞，全波长扫描仪490nm波长处测取od值，数据分析。如图6所示，为mts实验结果，与对照组pcdna3相比，pcdna3-mgst1实验组细胞增殖速度明显增快，且随时间的推移，活细胞数的差值开始具有统计学意义，p<0.05，说明过表达mgst1基因后能够明显促进人肺腺癌spc-a-1细胞的增殖。具体实施案例5：过表达mgst1的基因后对人肺腺癌细胞株spc-a-1克隆形成能力的影响采用平板克隆形成实验来检测人肺腺癌细胞株spc-a-1的克隆形成能力情况。取处于生长指数期的对照组pcdna3和实验组pcdna3-mgst1细胞，细胞计数后接种于6孔细胞培养板，每孔300个细胞，每组设置3个平行复孔，放37℃5％co2恒温培养箱中培养14天左右，培养至肉眼可见克隆形成；克隆形成后，终止培养，弃培养基，pbs缓冲液小心清洗2次，晾干，加1ml甲醇固定30min，弃甲醇晾干后加入1ml吉姆萨染液染色30min，洗去染液，晾干；计数大于50个细胞的克隆数，做柱状图分析数据。如图7所示，为mts实验结果，pcdna3-mgst1实验组spc-a-1细胞克隆形成数目明显比pcdna3对照组多，p<0.01。说明过表达mgst1后spc-a-1细胞克隆形成能力增强。具体实施方式6：过表达mgst1的基因后对人肺腺癌spc-a-1细胞凋亡情况的影响采用流式细胞术来检测spc-a-1细胞的凋亡情况。将pcdna3对照组和pcdna3-mgst1实验组细胞经h2o2处理诱导细胞凋亡，细胞生长至90％时，用无edta的胰酶消化成单细胞悬液，2000rpm，离心5min；pbs液洗两次，弃上清，500μlbindingbuffer重悬细胞，加5μlannexinv-apc(凯基生物)混匀后，加入5μl7-add(凯基生物)染液，混匀后避光室温孵育15min；1小时内上机检测样品，annexinv-apc：激发波长ex为546nm，发射波长em为647nm，7-add：激发波长ex为488nm，发射波长em为655nm；整理数据，分析结果。检测结果见图8，实验组pcdna3-mgst1早期凋亡率明显比对照组pcdna3低，(3.30±0.40)％vs(6.50±0.95)％，p<0.05，但晚期凋亡率无明显差异。实施例7：过表达mgst1的基因后对人肺腺癌spc-a-1细胞凋亡蛋白的影响采用western-blot来检测spc-a-1细胞凋亡蛋白的情况。将pcdna3对照组和pcdna3-mgst1实验组细胞经h2o2处理诱导细胞凋亡，细胞生长至90％时，胰酶消化收集细胞，提取蛋白电泳，检测caspase家族蛋白中caspase9、caspase3、parp的前体及活性蛋白表达变化。检测结果如图9所示，h2o2诱导稳定过表达mgst1基因的spc-a-1细胞，与对照相比前体蛋白caspase9、caspase3、parp表达升高，活性蛋白cleaved-caspase9、cleaved-caspase3、cleaved-parp表达明显减少，说明稳定过表达mgst1基因可以抑制h2o2诱导spc-a-1活性凋亡蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡。以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。acagtccctgcattgcgcgcgacccggcggcgggacaggcttgctgcttcctcctcctcggcctcaccaccaaaattgaaaaaatggttgacctcacccaggtaatggatgatgaagtattcatggcttttgcatcctatgcaacaattattctttcaaaaatgatgcttatgagtactgcaactgcattctatagattgacaagaaaggtttttgccaatccagaagactgtgtagcatttggcaaaggagaaaatgccaagaagtatcttcgaacagatgacagagtagaacgtgtacgcagagcccacctgaatgaccttgaaaatattattccatttcttggaattggcctcctgtattccttgagtggtcccgacccctctacagccatcctgcacttcagactatttgtcggagcacggatctaccacaccattgcatatttgacaccccttccccagccaaatagagctttgagtttttttgttggatatggagttactctttccatggcttacaggttgctgaaaagtaaattgtacctgtaaagaaaatcatacaactcagcatccagttggctttttaagaattctgtacttccaatttataatgaatactttcttagattttaggtaggaggggagcagaggaattatgaactggggtaaacccattttgaatattagcattgccaatatcctgtattcttgttttacatttggattagaaatttaacatagtaattcttaagtcttttgtctgatttttaaagtactttcttataaatttggatcatgttatgatttgtaacattcacacaacacctcacttttgaatctataaaagaattgcacgtatgagaaacctatatttcaatactgctgaaacagacatgaaataaagaatttaaagaatgaaaaaaaaaaaaaaaaaaatggttgacctcacccaggtaatggatgatgaagtattcatggcttttgcatcctatgcaacaattattctttcaaaaatgatgcttatgagtactgcaactgcattctatagattgacaagaaaggtttttgccaatccagaagactgtgtagcatttggcaaaggagaaaatgccaagaagtatcttcgaacagatgacagagtagaacgtgtacgcagagcccacctgaatgaccttgaaaatattattccatttcttggaattggcctcctgtattccttgagtggtcccgacccctctacagccatcctgcacttcagactatttgtcggagcacggatctaccacaccattgcatatttgacaccccttccccagccaaatagagctttgagtttttttgttggatatggagttactctttccatggcttacaggttgctgaaaagtaaattgtacctgtaa当前第1页12