一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法与流程

本发明属于生物技术领域的细胞及组织工程技术领域，特别是一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法。

背景技术：

骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecell)是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定的条件下可以被激活，发生增殖和成肌分化，形成骨骼肌细胞，肌卫星细胞在动物出生后肌肉的生长发育和再生过程中发挥着十分重要的作用。肌卫星细胞的体外成肌分化过程很好地模拟了体内的肌肉发育过程，是研究细胞分化和肌肉发育的良好细胞模型。肌卫星细胞的激活、增殖与成肌分化过程受多种因素的调控，了解骨骼肌卫星细胞的成肌分化调控模式，可以增加人为控制肌细胞形成的可能性。

肌肉的分化和生长发育过程是内在遗传、表观遗传和外在的各种信号互作的结果，骨骼肌发育分化过程涉及多基因的表达、信号途径及网络式调控，过程极其复杂，其中，非编码rna的调控作用受到越来越多的重视。已有研究表明长非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)在肌肉发育的过程中发挥了重要的调控作用。lncrna是一类转录本长度超过200nt的rna分子，它不编码蛋白，以rna的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达。1ncrna起初被认为是基因组转录的“噪音”，是rna聚合酶ii转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明lncrna具有重要的生物学功能。越来越多的研究表明lncrna参与调控了细胞、组织分化和发育以及疾病发生等多种生物学过程。有研究利用芯片技术分析了小鼠成肌细胞和分化后肌管中的lncrna，在肌管中发现9个上调10倍的lncrna，其中肌肉特异性表达的munc位于myod上游5kb处，下调munc可以抑制成肌分化，体内敲除munc引起小鼠肌肉再生障碍，表明munc与肌细胞发育分化具有密切的相关性；有研究通过分析小鼠成肌细胞增殖和分化时期转录本，发现lnc-31在增殖期c2c12细胞中高表达，成肌分化后明显下调，lnc-31的表达参与维持成肌细胞的增殖，并可以抑制细胞分化。已有的研究结果说明在成肌分化过程lncrna确实发挥了重要的调控作用。但到目前为止，绝大部分的lncrna的功能还是未知的，只有小部分的lncrna的功能被研究。目前，在牛肌卫星细胞成肌分化中lncrna的相关研究鲜见报道。鉴于这种情况，本发明人在前期研究中通过rna-seq技术，对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中差异表达的lncrna进行了筛选，鉴定出了301个在分化前后差异表达的lncrna，生物信息学预测分析发现这些差异表达lncrna的靶基因主要富集在细胞增殖分化及肌肉发育分化相关的通路中，提示这些差异表达lncrna可能在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中发挥了重要的调控作用，本发明从这些差异表达lncrna选取表达丰度较高，分化前后差异倍数较大的lncrna-hz5进行成肌分化调控研究，以期建立通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncrna的表达，从而影响牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法，为肌肉发育分化的lncrna调控研究供新的思路和方法。

技术实现要素：

鉴于目前lncrna对牛骨骼肌卫星细胞是否具有一定的调节作用，以及具体的作用效果还不清楚，本发明设计并合成lncrna-hz5的sirna，然后采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，干扰牛骨骼肌卫星细胞中lncrna-hz5的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncrna-hz5的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本发明的目的在于提供一种通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncrna的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法，借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中lncrna的利用提供借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，该方法是通过干扰lncrna-hz5表达来实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化，具体方法为：根据lncrna-hz5碱基序列，设计合成出lncrna-hz5的sirna，以sirna转染牛骨骼肌卫星细胞，调低lncrna-hz5的表达水平，实现促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化，其中，所述lncrna-hz5的基因组碱基序列为：sq1。

而且，所述干扰lncrna-hz5表达水平的方法进一步包括：采用干扰lncrna-hz5表达的质粒、病毒载体及基因敲除等其它能够改变lncrna-hz5表达水平的手段。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明利用改变lncrna表达对牛肌卫星细胞的成肌分化过程进行调控，可以为肌肉发育分化的长非编码rna研究提供启示。

2、本发明利用改变lncrna表达对牛肌卫星细胞的成肌分化进行调控，lncrna作为非编码rna，其表达改变对细胞的其它生物学特性影响较小，有利于研究其它调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响。

3、利用本发明建立的通过改变lncrna表达来促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法，可以有效地调控肌肉发育分化过程，借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中lncrna的利用提供一定的借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和参考。

附图说明

图1是lncrna-hz5在牛基因组中的位置信息图；

图2是lncrna-hz5在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后的表达水平变化的定量pcr检测结果图；

图3是lncrna-hz5的sirna在牛骨骼肌卫星细胞中对lncrna-hz5表达水平影响的定量pcr检测结果图；

图4是采用sirna干扰lncrna-hz5表达对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的影响结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明的设计思路是：

设计并合成lncrna-hz5的sirna，然后采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，干扰牛骨骼肌卫星细胞中lncrna-hz5的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncrna-hz5的表达，从而促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法，包括以下步骤：

第一步、牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立及肌卫星细胞成肌分化前后lncrna-hz5表达的检测：

本发明采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。对lncrna-hz5的碱基序列和染色体定位进行分析，然后采用定量pcr方法检测牛骨骼肌卫星细胞及成肌分化后肌管中lncrna-hz5的表达量；

具体步骤是：

(1)牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立。

本发明采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞。无菌条件下采集牛胎儿后肢肌肉，剪成合适大小，置于pbs缓冲液中清洗数次，在培养皿中用眼科剪充分剪碎，用预热的pbs缓冲液冲洗一次后在离心机中以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，加入5ml的0.2％胶原酶ii在37℃水浴中消化1h，期间每隔10min涡旋振荡10s，然后加入含有edta的0.25％胰酶消化30min，期间每隔10min涡旋振荡10s，最后加入适量含血清的培养基终止消化，将上述混合液依次过100目、200目和400目细胞筛，将滤液收集到50ml离心管中，在离心机中以1000r/min的转速离心10min，用培养基重悬，接种到合适的培养皿中，37℃、5％co2培养箱中培养。在含有20％胎牛血清的dmem生长培养基中进行培养，待细胞生长至80％融合时，加入含有2％马血清的dmem分化培养基进行体外成肌诱导分化，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。

(2)lncrna-hz5序列及染色体定位分析。

本发明人在前期研究中通过rna-seq技术，对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中差异表达的lncrna进行了筛选，鉴定出了301个在分化前后差异表达的lncrna，生物信息学预测分析发现这些差异表达lncrna的靶基因主要富集在细胞增殖分化及肌肉发育分化相关的通路中，提示这些差异表达lncrna可能在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中发挥了重要的调控作用，本研究从这些差异表达lncrna选取表达丰度较高，分化前后差异倍数较大的lncrna-hz5进行成肌分化调控研究，以期建立通过改变牛骨骼肌卫星细胞中lncrna的表达，从而影响牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程的方法。结合前期测序结果对lncrna-hz5的基因序列及染色体定位进行分析，lncrna-hz5的碱基序列长度为4853bp，将lncrna-hz5的序列在ensembl数据库进行检索，发现lncrna-hz5位于牛基因组的8号染色体(54766532-54771384)，检索结果见图1。

lncrna-hz5的基因组碱基序列(4853bp)：sq1

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(3)牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后lncrna-hz5表达变化检测。

提取未分化牛骨骼肌卫星细胞及分化后肌管的rna，采用trizol法提取细胞及分化后肌管的总rna。提取步骤：向细胞培养皿中加入1mltrizol细胞裂解液，反复吹打至细胞充分裂解。显微镜下观察细胞完全裂解后，将上述trizol裂解液收集至1.5ml的无rna酶管中。氯仿抽提：按trizol和氯仿为5:1的比例加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min。重复氯仿抽提步骤一次。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min后吸取上部的透明水相，并加入2倍体积的异丙醇，涡旋震荡混匀。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min。小心吸弃上清液，将70％乙醇(使用无酶水配制)1ml加入管中。在4℃离心机中，以12000r/min的转速离心15min。小心吸弃乙醇，将无酶管横放至大部分乙醇挥发。将50μl无rna酶水加入无酶管中充分溶解rna，涡旋混匀后离心数秒使液体置于管底。使用nano-dropnd2000c仪器检测rna的质量和浓度。

通过定量pcr检测分化前后lncrna-hz5的表达变化，rna的反转录及定量pcr操作按照试剂盒说明书进行。所用引物序列见表1，gapdh作为内参。rna的反转录及定量pcr操作条件如下：

①rna反转录体系及条件：

在pcr仪上70℃保温10min后，迅速在冰上急冷2min以上，急冷后将混合液甩至pcr管底。

随后，向混合液中加入：

将配好的混合液放置于pcr仪上，并设定程序：先于30℃条件下保温10min，然后在42℃条件下保温1h，最后在70℃条件下保温15min。上述程序结束后，将反转录后的cdna混合液取出在冰上冷却。

②定量pcr检测体系：

反应液的配置：在冰上配置反应液，每个样品中的检测指标都要进行复孔实验，并进行单孔ntc实验，采用白色8连管进行定量pcr检测。

8连管中每个单管中反应液配置如下：

qpcr的反应条件：

充分混匀反应液后，离心，使反应液到反应管底部，置于定量pcr仪上。具体反映程序如下：

重复变性至退火步骤40次

反应结束后，绘制溶解曲线，本实验中检测荧光温度范围为：65℃-95℃，升温速率为0.5℃/次循环，恒温时间为10s/次循环。

所有反应结束后，于30℃条件下保温30s，防止反应结束后取出反应管时被烫。

表1lncrna-hz5实时定量pcr引物序列

定量pcr检测结果见图2，实验结果表明，与未分化肌卫星细胞相比，成肌分化后肌管中lncrna-hz5的表达量上调了17倍，提示它可能在牛肌卫星细胞成肌分化过程中发挥调控作用。

第二步、lncrna-hz5干扰rna(sirna)设计合成及干扰效果检测：

根据lncrna-hz5碱基序列，设计合成5条sirna，分别转染牛骨骼肌卫星细胞，采用定量pcr方法检测lncrna-hz5的表达水平，检测sirna对lncrna-hz5的干扰效果；

具体步骤是：

(1)lncrna-hz5干扰rna(sirna)设计合成。

根据lncrna-hz5碱基序列，采用sirna设计软件设计出5条sirna(sirna-1、sirna-2、sirna-3、sirna-4、sirna-5)，由生物公司合成。

(2)sirna干扰lncrna-hz5表达的效果检测。

将lncrna-hz5的上述5条sirna分别采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，将牛骨骼肌卫星细胞分别接种于35mm细胞培养皿中，用生长培养基进行培养，当细胞生长密度为70％～80％时准备转染，并在转染前一天将培养基更换成无抗生素的生长培养基。根据试剂说明书推荐浓度，采用sirna及阴性对照终浓度50nm进行转染。在进行转染时，先将培养基更换成无血清的opti-mem培养基，将sirna或对应阴性对照混合于50μlopti-mem培养基中，同时将1μl罗氏转染试剂混合于50μlopti-mem培养基，分别静置5min，将含sirna或对应阴性对照的50μlopti-mem培养基加入到含罗氏转染试剂的opti-mem培养基中，轻柔混匀后混合液静置20min，将混合液均匀滴加到35mm细胞培养皿中，滴加混合液体积以达到sirna或对应阴性对照的终浓度为准。转染24h后，采用trizol法提取转染细胞的总rna，采用定量pcr方法检测lncrna-hz5的表达，总rna提取、rna的反转录及定量pcr操作与第一步中方法相同，所用引物序列见表1，检测结果见图3，实验结果表明5条sirna中sirna-1和sirna-3对lncrna-hz5的表达具有明显的干扰作用，显著调低了lncrna-hz5的表达水平(*，与对照nc相比p<0.05)，可以用于lncrna-hz5的表达调控研究。

第三步、干扰lncrna-hz5表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响：

采用sirna-3转染牛骨骼肌卫星细胞干扰lncrna-hz5的表达，然后将肌卫星细胞进行成肌诱导分化，通过肌管的形成状态判断干扰lncrna-hz5表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响；

具体步骤是：

将lncrna-hz5的sirna-3采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，具体操作与第二步中sirna的转染方法相同。转染24h后，将培养基更换为成肌诱导分化培养基继续培养，对肌卫星细胞进行诱导分化48h。通过肌管的形成状态判断干扰lncrna-hz5表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响，结果见图4，与对照组(sirna-nc)相比，转染了sirna-3的肌卫星细胞经诱导分化48h后形成的肌管多而粗壮，表明下调lncrna-hz5能够促进肌卫星细胞的成肌分化，实验结果说明lncrna-hz5可能负调控牛骨骼肌卫星细胞的分化过程。上述研究结果提示，改变牛骨骼肌卫星细胞中肌肉发育分化相关lncrna的表达，可以影响牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

当然，lncrna-hz5表达水平改变的方法包括设计合成的干扰rna(sirna)，还包括干扰lncrna-hz5表达的质粒、病毒载体及基因敲除等其它能够改变lncrna-hz5表达水平的手段。