促进3β‑HSD基因表达的表达载体及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种促进3β-hsd基因表达的表达载体及其构建方法和应用。
背景技术：
：固醇激素在大多数脊椎动物细胞的分化、发育、生长和生理功能的发挥中起重要的作用。类固醇激素的生成有赖于原料胆固醇的提供及一系列的类固醇生成酶的催化。其中，3β-超类固醇脱氨酶(3β-hsd)在糖皮质激素、盐皮质激素和性激素的生物合成中起重要的作用。传统的3β-hsd基因表达技术中，例如柳海燕等利用促性腺激素释放激素激动剂通过erkmapk途径实现了大鼠睾丸间质细胞3β-hsd基因表达的调控；祝辉等则研究了hcg对成年小鼠睾丸leydig细胞中3β-hsd表达的调节。上述研究均为应用间接手段调控3β-hsd基因表达，目前缺乏能够转染到人源细胞，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-hsd基因的表达载体。技术实现要素：基于此，有必要提供一种能够在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-hsd基因的表达载体及其构建方法和应用。一种促进3β-hsd基因表达的表达载体，包括慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段，所述多克隆位点包括ecori酶切位点和noti酶切位点，所述目的基因表达片段中含有用于表达3β-hsd的3β-hsd基因编码序列，所述目的基因表达片段的5’端具有ecori酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有noti酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述ecori酶切位点和所述noti酶切位点之间。在一个实施方式中，所述3β-hsd基因编码序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。在一个实施方式中，所述ecori酶切位点黏性末端的3’端直接与所述3β-hsd基因编码序列的5’端连接，所述noti酶切位点黏性末端的5’端直接与所述3β-hsd基因编码序列的3’端连接，所述ecori酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-aattc-3’，所述noti酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-ggccgc-3’。一实施方式的促进3β-hsd基因表达的表达载体的构建方法，包括以下步骤：以3β-hsd基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，所述上游引物包括针对所述3β-hsd基因编码序列的5’端设计的序列和针对ecori酶切位点设计的序列，所述下游引物包括针对所述3β-hsd基因编码序列的3’端设计的序列和针对noti酶切位点设计的序列；对所述pcr扩增产物进行加a尾反应，使得所述pcr扩增产物的两端连接a碱基，并将加a尾反应后的所述pcr扩增产物连接到t载体中，得到重组t载体；用限制性内切酶ecori和限制性内切酶noti对所述重组t载体进行双酶切，得到目的基因表达片段；以及将所述目的基因表达片段连接到经过限制性内切酶ecori和限制性内切酶noti双酶切处理后的慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，得到所述促进3β-hsd基因表达的表达载体。在一个实施方式中，所述3β-hsd基因编码序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述上游引物的碱基序列如seqidno.2所示，所述下游引物的碱基序列如seqidno.3所示。一种含有3β-hsd基因的慢病毒，通过如下方法制备得到：将上述的促进3β-hsd基因表达的表达载体转染进入293ft细胞中；以及对转染后的所述293ft细胞扩增表达，获得所述含有3β-hsd基因的慢病毒。一种组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述组合物包括上述促进3β-hsd基因表达的表达载体。在一个实施方式的应用中，所述组合物还包括塑化剂。在一个实施方式的应用中，所述塑化剂为邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯。在一个实施方式的应用中，所述组合物用于制备抗乳腺癌的药物。上述促进3β-hsd基因表达的表达载体包括慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段。多克隆位点序列包括ecori酶切位点和noti酶切位点，目的基因表达片段中含有用于表达3β-hsd的3β-hsd基因编码序列，目的基因表达片段的5’端具有ecori酶切位点黏性末端，3’端连具有noti酶切位点黏性末端。目的基因表达片段正向插入在多克隆位点序列的ecori酶切位点和noti酶切位点之间。发明人在载体的选择、目的基因插入位点、构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将含有3β-hsd基因编码序列的目的基因表达片段正向插入在慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位点和noti酶切位点之间，成功地构建出能够特异性促进3β-hsd基因表达的表达载体。实验结果表明该表达载体能够转染到人源细胞中，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-hsd基因。转染了该促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞系mcf-7细胞表达的3β-hsd是对照组的104.5倍，表达量具有显著的差异。该表达载体还能增加塑化剂对肿瘤细胞的毒性，实验结果表明，转染了该表达载体的人乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受体基因以及dna氧化损伤基因表达水平均高于未转染的人乳腺癌细胞mcf-7，该表达载体能够加速肿瘤细胞的凋亡，增加塑化剂对肿瘤细胞的损害作用，有望应用在抗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供一种思路。附图说明图1为一实施方式的促进3β-hsd基因表达的表达载体的构建方法的流程图；图2为实施例1中3β-hsd基因编码序列pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3为实施例1中所用的plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro骨架载体的谱图；图4为实施例4中荧光定量pcr检测mcf-7细胞和转染促进3β-hsd基因表达的表达载体的mcf-7细胞的3β-hsd的mrna表达水平结果图；图5为实施例5中westernblot检测两组细胞3β-hsd蛋白表达水平的结果图；图6为对图5中的图像用imagej软件进行条带灰度定量分析3β-hsd蛋白表达水平结果图；图7为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因bax的mrna表达水平结果图；图8为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因caspase-3的mrna表达水平结果图；图9为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因caspase-8的mrna表达水平结果图；图10为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的雌激素受体基因erα的mrna表达水平结果图；图11为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的雌激素受体基因erβ的mrna表达水平结果图；图12为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的dna损伤基因hogg1的mrna表达水平结果图；图13为实施例6中荧光定量pcr检测不同浓度的dehp条件下，两组乳腺癌细胞mcf-7的dna损伤基因mth1的mrna表达水平结果图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。一实施方式的促进3β-hsd基因表达的表达载体，包括慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列以及目的基因表达片段。多克隆位点包括ecori酶切位点和noti酶切位点。目的基因表达片段中含有用于表达3β-hsd的3β-hsd基因编码序列，目的基因表达片段的5’端具有ecori酶切位点黏性末端，目的基因表达片段的3’端具有noti酶切位点黏性末端。目的基因表达片段正向插入在多克隆位点序列的ecori酶切位点和noti酶切位点之间。具体地，抗性基因序列用于筛选转化后的表达载体。在一个实施方式中，抗性基因序列选自氨苄青霉素抗性基因序列和卡那霉素抗性基因序列中的至少一种。具体地，多克隆位点序列中包括多个酶切位点，除ecori酶切位点和noti酶切位点之外，多克隆位点序列中还可以包括hpai酶切位点、sfii酶切位点和sbfi酶切位点等。具体地，启动子(promoters)序列用于控制表达载体中的基因表达的起始时间和表达的程度。在一个实施方式中，ecori酶切位点黏性末端的3’端直接与3β-hsd基因编码序列的5’端连接，noti酶切位点黏性末端的5’端直接与3β-hsd基因编码序列的3’端连接。进一步地，ecori酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-aattc-3’，noti酶切位点黏性末端的碱基序列为5’-ggccgc-3’。具体地，目的基因表达片段中含有用于表达3β-hsd的3β-hsd基因编码序列，3β-hsd基因编码序列从ncbi数据库中筛选获得。在一个实施方式中，3β-hsd基因编码序列依据3β-hsd的mrna序列设计。具体为筛选出ncbi数据库的genbanknm_001328615，设计得到3β-hsd基因编码序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。在慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，3β-hsd基因编码序列以双链的形式存在，3β-hsd基因编码序列的5’端连接有ecori酶切位点黏性末端，ecori酶切位点黏性末端包括经ecori酶酶切后的一段碱基序列，例如aattc。3β-hsd基因编码序列的3’端连接有noti酶切位点黏性末端，noti酶切位点黏性末端包括经noti酶酶切后的一段碱基序列，例如tcgag，设置ecori酶切位点黏性末端以及ecori酶切位点黏性末端使得3β-hsd基因编码序列能够顺利的插入到慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中。进一步地，ecori酶切位点黏性末端以及noti酶切位点黏性末端中还含有保护序列，提高酶切效率。发明人在载体的选择、目的基因插入位点、构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将含有3β-hsd基因编码序列的目的基因表达片段正向插入在慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位点和noti酶切位点之间，成功地构建出能够特异性促进3β-hsd基因表达的表达载体。实验结果表明该表达载体能够转染到人源细胞中，上述表达载体具有转染效率高，用量少，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-hsd基因的优点，转染了该促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞系mcf-7细胞表达的3β-hsd是对照组的104.5倍，表达量具有显著的差异，可作为有力工具应用于制备治疗3β-hsd基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。进一步地，该表达载体还能增加塑化剂对肿瘤细胞的毒性。实验结果表明，转染了该表达载体的人乳腺癌细胞mcf-7的细胞凋亡基因、雌激素受体基因以及dna氧化损伤基因的表达水平均高于未转染的人乳腺癌细胞mcf-7，该表达载体能够加速肿瘤细胞的凋亡，增加塑化剂对肿瘤细胞的损害作用，该表达载体有望应用在抗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供一种思路。请参阅图1，一实施方式的上述促进3β-hsd基因表达的表达载体的构建方法，包括以下步骤s110～s140。s110、以3β-hsd基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，上游引物包括针对3β-hsd基因编码序列的5’端设计的序列和针对ecori酶切位点设计的序列，下游引物包括针对3β-hsd基因编码序列的3’端设计的序列和针对noti酶切位点设计的序列。具体地，目的基因表达片段中含有用于表达3β-hsd的3β-hsd基因编码序列，3β-hsd基因编码序列从ncbi数据库中筛选获得。在一个实施方式中，3β-hsd基因编码序列依据3β-hsd的mrna序列设计。具体为筛选出ncbi数据库的genbanknm_001328615，设计得到3β-hsd基因编码序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。设计的3β-hsd基因编码序列可通过基因合成的方式获得。上游引物包括针对3β-hsd基因编码序列的5’端设计的序列和针对ecori酶切位点设计的序列，下游引物包括针对3β-hsd基因编码序列的3’端设计的序列和针对noti酶切位点设计的序列，通过上游引物和下游引物的扩增，使得3β-hsd基因编码序列具有ecori酶切位点和noti酶切位点。具体地，上游引物中包括扩增ecori酶切位点的序列以及保护序列，下游引物中包括扩增noti酶切位点的序列以及保护序列，使得pcr扩增得到的pcr扩增产物具有ecori酶切位点和noti酶切位点。上下游引物无引物二聚体且退火温度差距较小。在一个实施方式中，上游引物的碱基序列如seqidno.2所示，下游引物的碱基序列如seqidno.3所示。具体地，按照premixprime3β-hsdhs的使用说明配置反应体系进行pcr，退火温度为62℃。pcr扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后用dna胶回收试剂盒回收约1000bp左右的pcr产物，得到pcr扩增产物。s120、对s110中得到的pcr扩增产物进行加a尾反应，使得pcr扩增产物的两端连接a碱基，并将加a尾反应后的pcr扩增产物连接到t载体中，得到重组t载体。具体地，用extaq酶对pcr扩增产物进行加a尾反应，参见extaq酶的使用说明书，在extaq酶的条件下，将pcr扩增产物的两端分别加上a碱基，形成加a尾的pcr扩增产物，使得pcr扩增产物能够顺利连接到t载体中。具体地，参见t4dna连接酶的使用说明书，将两端加a碱基后的pcr扩增产物连接到t载体中，形成重组t载体。具体地，获得重组t载体后，还包括对重组t载体的扩增和鉴定。具体包括将重组t载体转化进入大肠杆菌感受态细菌中，筛选获得阳性单克隆，培养阳性单克隆并提取获得大量的重组t载体。大肠杆菌感受态细菌例如为jm107感受态细菌或dh5α感受态细菌等。本实施方式中，将重组t载体转化进入jm107感受态细菌中，涂布在具有抗性的培养基上，挑取阳性单克隆小量培养并测序鉴定。然后将测序正确的菌液扩大培养，提取细菌中的重组t载体。s130、用限制性内切酶ecori和限制性内切酶noti对s120中得到的重组t载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。具体地，挑取测序正确的重组t载体，先进行noti酶切，用核酸共沉剂回收酶切产物后，再用ecori酶切，电泳鉴定后，用dna胶回收试剂盒回收的酶切产物，得到目的基因表达片段。该目的基因片段的5’端有ecori酶切位点黏性末端，该目的基因片段的3’端有noti酶切位点黏性末端。s140、将s130中得到的目的基因表达片段连接到经过限制性内切酶ecori和限制性内切酶noti双酶切处理后的慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，得到促进3β-hsd基因表达的表达载体。慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro先经过限制性内切酶ecori和限制性内切酶noti双酶切处理，打开缺口，使得目的基因表达片段顺利插入到慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位点和noti酶切位点之间，获得促进3β-hsd基因表达的表达载体。一实施方式的含有3β-hsd基因的慢病毒，通过如下方法制备得到：该上述促进3β-hsd基因表达的表达载体转染进入293ft细胞中，通过对转染后的293ft细胞扩增表达，从而获得含有3β-hsd基因的慢病毒。具体地，将转染后的293ft细胞培养36h～60h后，收集细胞上清培养基用滤膜过滤，得到含有3β-hsd基因的慢病毒的上清液。获得含有3β-hsd基因的慢病毒后，还包括使用lenti-xgostix金标试剂盒测定病毒滴度，然后保存于-80℃条件下。上述促进3β-hsd基因表达的表达载体的构建方法操作简单，在载体的选择、目的基因插入位点、构建方法等方面进行了大量的探索研究，将含有3β-hsd基因编码序列的目的基因表达片段正向插入在慢病毒载体plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位点和noti酶切位点之间，成功地构建出能够特异性促进3β-hsd基因表达的表达载体。实验结果表明该方法构建的表达载体能够转染到人源细胞中，具有转染效率高，用量少，并在人源细胞中持续、稳定且高效表达3β-hsd基因的优点。转染了该促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞系mcf-7细胞表达的3β-hsd是对照组的104.5倍，表达量具有显著的差异。本文还提供一实施方式的组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，该组合物包括上述的促进3β-hsd基因表达的表达载体。具体地，该组合物可以是应用于预防肿瘤的疫苗，也可以是应用于治疗已经确诊为肿瘤甚至癌症的药物。进一步地，该组合物为用于制备抗乳腺癌的药物。在一个实施方式中，该组合物还包括塑化剂。具体地，塑化剂为邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(dehp)。进一步地，塑化剂在组合物中的浓度为0.05mmol/l以上，优选0.80mmol/l以上。可以理解，该组合物中还可以包括淀粉、硬质酸钠等药物辅助剂。在一个实施方式的应用中，该组合物应用在促进凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8表达的抗肿瘤药物中。优选地，该组合物应用在促进凋亡基因bax的抗肿瘤药物中。在一个实施方式的应用中，该组合物应用在促进雌激素受体基因erα或erβ表达的抗肿瘤药物中。优选地，该组合物应用在促进雌激素受体基因erα表达的抗肿瘤药物中。在一个实施方式应用中，该组合物应用在促进dna氧化损伤基因hogg1或mth1表达的抗肿瘤药物中。进一步地，该组合物应用在同时促进凋亡基因、雌激素受体基因以及dna氧化损伤基因表达的抗肿瘤药物中。进一步地，塑化剂与促进3β-hsd基因表达的表达载体形成的组合物应用在同时促进凋亡基因、雌激素受体基因以及dna氧化损伤基因表达的抗肿瘤药物中。实验结果表明，将上述促进3β-hsd基因表达的表达载体转染到乳腺癌细胞系mcf-7细胞中后，mcf-7表达的3β-hsd是对照组的104.5倍，表达量具有显著的差异。转染了该表达载体的人乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受体基因以及dna氧化损伤基因表达水平均高于未转染的人乳腺癌细胞mcf-7，该表达载体能够加速肿瘤细胞的凋亡，增加塑化剂对肿瘤细胞的损害作用。有望应用在抗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供一种思路。此外，即使在塑化剂的浓度为0mmol/l，即塑化剂不存在的条件下。转染了该表达载体的人乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8，雌激素受体基因erα、erβ和dna氧化损伤基因hogg1的表达量也高于未转染的人乳腺癌细胞mcf-7，说明该促进3β-hsd基因表达的表达载体本身对肿瘤细胞具有毒性，对肿瘤细胞的损害作用，有望应用在抗肿瘤的药物中。下面为具体实施例部分。以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[m](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。实施例中所用的材料：限制性内切酶ecori、noti(美国fermentas公司)，t4dna连接酶(美国fermentas公司)，dna胶回收试剂盒rneasyminikit试剂盒(德国qiagen公司)，primescriprtreagentkit和sybrprimescriptrt-pcrkit(中国takara公司)，质粒小量提取和无内毒素质粒小量提取试剂盒(美国omegabio-tek公司)，j107大肠杆菌感受态(天根生物公司)，真核表达载体plvx-mcuv-zsgreen-pglc-puro(以下简称plvx载体，biovector公司)，包装辅助质粒plvx-gfp和该质粒对应的慢病毒包装试剂盒(美国clontech公司)，用于慢病毒包装的293ft细胞(美国invitrogen公司)，rpmi-1640培养基和10％胎牛血清(美国gibco公司)，人乳腺癌mcf-7细胞(中国上海细胞库)，dmso(美国sigma公司)，dehp(纯度>99％，tci公司)，bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1基因pcr引物由上海生工合成，鼠抗gapdh一抗、兔抗3β-hsd(ab133657)一抗、羊抗鼠igg-hrp和羊抗兔igg-hrp均为美国thermoscientific公司产品。实施例1构建促进3β-hsd基因表达的表达载体(1)3β-hsd目的基因表达片段引物的设计。根据ncbi数据库genbanknm_001328615设计3β-hsd基因编码序列，获得核苷酸序列如seqidno.1所示的3β-hsd基因编码序列(3β-hsd的cdna序列)。使用oligo7对其进行分析，搜索上下游引物(要求尽可能无引物二聚体且退火温度差距较小)，然后在上游引物的5’端加入保护碱基与ecori酶切位点序列，下游引物的5’端分加入保护碱基与noti酶切位点序列，设计得到的引物序列如表1所示。设计的pcr引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1：3β-hsd基因编码序列的pcr扩增引物上游引物5’-ggaattccatgacgggctggagctg-3’(seqidno.2)下游引物5’-cgcggccgcctgagtcttggacttcag-3’(seqidno.3)(2)3β-hsd基因编码序列(cdna)的扩增及其重组t载体的构建按照premixprime3β-hsdhs的使用说明配置反应体系进行pcr，退火温度为62℃。pcr完成后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示。然后用dna胶回收试剂盒回收约1000bp的pcr产物，得到pcr扩增产物。并再用extaq酶进行加a尾反应。按照t4dna连接酶的说明书，将加a尾产物与t载体连接，转化jm107感受态细菌。常规筛选鉴定，挑取小量培养的pcr鉴定阳性克隆的细菌菌液进行测序鉴定。将测序正确的菌液扩大培养，提取细菌中的重组t载体。(3)促进3β-hsd基因表达的表达载体与鉴定挑取测序正确的重组t载体，先进行noti酶切，用核酸共沉剂回收酶切产物后，再用ecori酶切。电泳鉴定后，用dna胶回收试剂盒回收的酶切产物，，得到目的基因表达片段。然后将目的基因表达片段与经过相同处理的plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro慢病毒载体连接。plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro骨架载体的谱图请参阅图3。进一步将连接后的载体转化jm107感受态细菌，小量培养筛选出来的细菌取重组质粒进行pcr鉴定，并将菌液进行测序鉴定。将测序结果证实3β-hsd基因cdna序列正确插入的菌液扩增培养，用去内毒素质粒提取试剂盒对重组质粒进行抽提，得到特异性促进3β-hsd基因表达的表达载体(plvx-3β-hsd)。实施例2制备含有3β-hsd基因的慢病毒培养293ft细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔中，每孔106个细胞，用慢病毒包装辅助试剂盒，取实施例1中抽提的plvx-3β-hsd重组载体2μg转染到293ft细胞，置于37℃培养48h后将上清培养基用0.45μm滤膜过滤，收集病毒上清，使用lenti-xgostix金标试剂盒测定病毒滴度，然后保存于-80℃。实施例3慢病毒转导人乳腺癌mcf-7细胞取实施例2获得的病毒上清，用rpmi-1640完全培养基按1:1稀释后，再加入polybrene至终浓度为6μg/ml～10μg/ml待用。将3×105个mcf-7细胞接种于t25细胞培养瓶中，培养18h后细胞汇合度达到50％，去除培养瓶中原有的完全培养基，用pbs洗两遍后加入上述含慢病毒的rpmi-1640完全培养基。转染24h，去除含慢病毒的rpmi-1640完全培养基，加入正常的rpmi-1640完全培养基再培养24h，然后换用1μg/ml嘌呤霉素对细胞进行筛选，每隔2天换液1次，筛选时间为7天，筛选获得3β-hsd基因高表达的mcf-7细胞株(plvx-3β-hsd细胞株)。实施例4荧光定量pcr检测3β-hsd基因表达量根据gapdh(genbanknm_002046.5)和3β-hsd(genbanknm_001328615)基因mrna序列，利用引物设计软件oligo7.0设计pcr引物，引物序列如表2所示。表2：gapdh和3β-hsd基因的pcr引物分别接种mcf-7细胞、实施例3制备的3β-hsd基因高表达的mcf-7细胞株(plvx-3β-hsd细胞株)至6孔板。细胞密度达到80％-90％时，用rneasyminikit提取各组细胞的总rna，利用primescriprtreagentkit将mrna逆转录为cdna，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反转录结束后，加入90μl的rnasefreedh2o稀释cdna，-20℃保存，以便后面检测使用。取各组细胞的cdna1μl为模板，分别加入表2中的引物，以gapdh为内参，实时荧光定量pcr检测3β-hsd相对表达量，设置反应条件：95℃30s，1循环；54℃30s，40循环；95℃5s；60℃1min，95℃15s，利用sybrprimescriptrt-pcrkit检测各组细胞3β-hsd基因相对表达量，结果如图4所示。可以看到，plvx-3β-hsd细胞株的3β-hsd基因表达水平较正常的mcf-7细胞提高了104.5倍，具有非常显著的差异(p<0.01)，说明本发明提供的3β-hsd基因cdna序列成功插入至plvx-mcuv-zsgreen-pglc-puro慢病毒载体中，能特异、持续、高效、稳定地促进3β-hsd基因高表达。实施例5westernblot检测3β-hsd蛋白表达水平将正常mcf-7细胞、实施例3制备的plvx-3β-hsd细胞株分别接种到t25细胞培养瓶(1×106个)。培养约24h后待细胞汇合度达90％后去除培养基，吸弃细胞培养液，用冷pbs洗3次，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，100℃变性8min；用二辛可宁酸法(bicinchoninicacidassay，bca法)进行蛋白定量。总蛋自进行10％sds-pace电泳分离，接着将蛋白电转至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h。根据marker和分子量将膜上含gapdh(37kd),3β-hsd蛋白(42kd)的部分分别切下，加入相应的一抗，冰上孵育过夜；tbst缓冲液洗膜3次，每次10min。加入对应的二抗，室温孵育1h；tbst缓冲液洗膜3次，每次10min。加入westernblot化学发光试剂光后用冷ccd成像系统对其进行曝光拍照，结果如图5所示。所得图像用imagej软件进行条带灰度定量分析结果如图6所示。可以看到，plvx-3β-hsd细胞株的3β-hsd蛋白质表达水平比对照组升高1.83倍，差异具有非常显著统计学意义(p<0.01)。这说明plvx-3β-hsd细胞株构建成功，能持续、高效、稳定地高表达3β-hsd蛋白。实施例6促进3β-hsd基因表达的表达载体对凋亡基因、雌激素受体基因、dna氧化损伤基因的mrna的表达量的影响将mcf-7细胞、实施例3制备的plvx-3β-hsd细胞株(3β-hsd基因高表达的mcf-7细胞)分别分接种到6孔板中，待细胞融合度达80％时进行dehp染毒。dehp终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/l，以5‰dmso作为对照，对细胞染毒24h。染毒结束后，参见实施例4荧光定量pcr检测3β-hsd基因表达量的方法分别测定的各组细胞中bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1基因表达水平的改变。具体为用rneasyminikit提取各组细胞的总rna，利用primescriprtreagentkit将mrna逆转录为cdna，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃下保存。反转录结束后，加入90μl的rnasefreedh2o稀释cdna，-20℃保存，以便后面检测使用。取各组细胞的cdna1μl为模板，分别加入表3中的引物，以gapdh为内参，实时荧光定量pcr检测3β-hsd相对表达量，设置反应条件：95℃30s，1循环；54℃30s，40循环；95℃5s；60℃1min，95℃15s，利用sybrprimescriptrt-pcrkit检测各组细胞bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1r基因相对表达量。bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1的pcr引物的序列如表3所示。表3：bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1的pcr引物实验结果：(1)促进3β-hsd基因表达的表达载体对凋亡基因表达水平的影响在不同浓度的dehp条件下，两组人乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3、caspase-8的表达水平分别请参见图7、图8和图9所示。图中mcf-7-cells表示正常的mcf-7细胞对照组。3β-hsdoverexpressionmcf-7-cells表示转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的实验组。不同条件下各基因的表达水平以dehp终浓度为0mmol/l的正常的mcf-7细胞的表达量为作为基准1计算。从图7中可以看出，塑化剂dehp染毒24h后，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因bax表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高到塑化剂dehp染毒24h，3β-hsd高表达细胞的凋亡基因bax表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高75％～126％，差异有统计学意义(p<0.01)。特别是当dehp终浓度为0.8mmol/l时，bax表达水平是正常的mcf-7细胞的2.2倍，表达量差异显著。从图8中可以看出，塑化剂dehp染毒24h，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因caspase-3表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高23％～83％，差异有统计学意义(p<0.01)。从图9中可以看出，塑化剂dehp染毒24h，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因caspase-8表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高39％～125％，差异有统计学意义(p<0.01)。特别是当dehp终浓度为0.8mmol/l时，caspase-8表达水平是正常的mcf-7细胞的2.3倍，表达量差异显著。(2)促进3β-hsd基因表达的表达载体对雌激素受体基因表达水平的影响在不同浓度的dehp条件下，两组人乳腺癌细胞mcf-7的雌激素受体基因erα、erβ的表达水平分别请参见图10和图11所示。从图10中可以看出，塑化剂dehp染毒24h，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的雌激素erα基因表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高25％～167％，差异有统计学意义(p<0.01)。从图11中可以看出，塑化剂dehp染毒24h，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的雌激素erβ基因表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高49％～245％，差异有统计学意义(p<0.01)。(3)促进3β-hsd基因表达的表达载体对dna损伤基因表达水平的影响在不同浓度的dehp条件下，两组人乳腺癌细胞mcf-7的dna损伤基因hogg1、mth1的表达水平分别请参见图12和图13所示。从图12中可以看出，塑化剂dehp染毒24h，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的hogg1基因表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高52％～223％，差异有统计学意义(p<0.01)。从图13中可以看出，塑化剂dehp染毒24h，转染了促进3β-hsd基因表达的表达载体的乳腺癌细胞mcf-7的mth1基因表达水平明显高于对照组，从低剂量组至高剂量组分别升高20％～150％，差异有统计学意义(p<0.01)。以上结果表明，转染了该表达载体的人乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受体基因以及dna氧化损伤基因表达水平均高于未转染的人乳腺癌细胞mcf-7，该表达载体能够加速肿瘤细胞的凋亡，增加塑化剂对肿瘤细胞的损害作用。此外，即使在塑化剂的浓度为0mmol/l，即塑化剂不存在的条件下。转染了该表达载体的人乳腺癌细胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8，雌激素受体基因erα、erβ和dna氧化损伤基因hogg1的表达量也高于未转染的人乳腺癌细胞mcf-7。说明该促进3β-hsd基因表达的表达载体本身对肿瘤细胞具有毒性，对肿瘤细胞的损害作用，有望应用在抗肿瘤的药物中。以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>深圳市疾病预防控制中心<120>促进3β-hsd基因表达的表达载体及其构建方法和应用<160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>1119<212>dna<213>3β-hsd基因编码序列<400>1atgacgggctggagctgccttgtgacaggagcaggagggtttctgggacagaggatcatc60cgcctcttggtgaaggagaaggagctgaaggagatcagggtcttggacaaggccttcgga120ccagaattgagagaggaattttctaaactccagaacaagaccaagctgacagtgctggaa180ggagacattctggatgagccattcctgaagagagcctgccaggacgtctcggtcatcatc240cacaccgcctgtatcattgatgtcttcggtgtcactcacagagagtctatcatgaatgtc300aatgtgaaaggtacccagctcctgttagaggcctgtgtccaagctagtgtgccagtcttc360atctacaccagtagcatagaggtagccgggcccaactcctacaaggaaatcatccagaat420ggccatgaagaagagcctctggaaaacacatggcccgctccatacccacacagcaaaaag480cttgctgagaaggctgtactggcggctaacgggtggaatctgaaaaacggcggcaccctg540tacacttgtgccttacgacccatgtatatctatggggaaggaagccgattcctttctgct600agtataaacgaggccctgaacaacaatgggatcctgtcaagtgttggaaagttctccact660gttaacccagtctatgttggcaatgtggcctgggcccacattctggccttgagggccctg720caggaccccaagaaggccccaa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