一种斯鲁菲亚红酵母固定化胶球及其制备方法与流程

本发明涉及一种海洋红酵母，尤其涉及一种斯鲁菲亚红酵母固定化胶球及其制备方法，属于固定化微生物技术。

背景技术：

20世纪末，污水处理行业兴起了一项新技术-固定化微生物技术。此项技术通过采用吸附法、包埋法、交联法、共价结合法等方法固定有益菌或藻类，使其定位在某一个空间范围内，并保留其原有的活性，以达到有效处理废水中n、p等物质的效果。且此技术还具有强可控性、强重复性、长作用时间、利用率高等优点，被广泛应用生产生活，尤其是造纸业、化工业以及生活污水处理等方面。目前，在水产养殖方面的应用效果也不同反响。

当前，固定化微生物技术的固定化材质一般采用海藻酸钠(sa)、琼脂、明胶、聚乙烯醇(pva)和聚丙烯酰胺凝胶等。但是，琼脂强度较差，聚丙烯酰胺凝胶对生物有毒性，明胶内部结构密实，传质性能差。sa和pva相对于其他载体，凝胶机械强度和传质性能均较好，对生物无毒，且耐生物分解性良好，较为合适应用为固定化细胞的载体。但单一的sa作为固定化细胞的载体，胶球机械强度较弱，不易成型，胶球容易破裂，稳定性较差；单一的pva作为固定化细胞载体时，操作困难，成球性不高，且胶球太致密，传质性低于海藻酸钠。因而，应用pva和sa的优势互补，使得pva和sa混合利用成为了固定化细胞载体的主要研究方向。而有研究表明在胶液中加入sio2可提高固定化细胞机械强度及生物活性，可见应用sio2优化胶球制作工艺存在可行性。

斯鲁菲亚红酵母属于海洋红酵母，菌落在平板上显粉红色圆形，表面光滑、隆起、湿润、不透明、边缘整齐，易挑起，直径3～5mm。酵母细胞呈椭圆形，直径5μm左右，出芽生殖。富含氨基酸、不饱和脂肪酸以及类胡萝卜素，且生物培养周期短，发酵条件简单，应用于轮虫投喂中，可显著提高轮虫的必需氨基酸含量。另有研究表明，海洋红酵母具有净化中国对虾育苗水环境作用。可见，斯鲁菲亚红酵母极有潜力作为微生物蛋白原或微生物制剂，但其通过固定化胶球发挥作用仍未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种制备方法简单、材料简单易得、胶球成型效率高的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法，所述制备方法主要包括以下步骤：

斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作：将斯鲁菲亚红酵母菌体与生理盐水混合制成斯鲁菲亚红酵母菌悬液；和

固定化胶球胶液的制作：将聚乙烯醇、海藻酸钠、二氧化硅、海水混合形成固定化胶球胶液；和

交联剂的制作：将硼酸、氯化钙混合形成交联剂；

然后将上述斯鲁菲亚红酵母菌悬液与固定化胶球胶液混合得到混合液，混合液加入交联剂中交联得到斯鲁菲亚红酵母固定化胶球。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述混合液中斯鲁菲亚红酵母菌悬液与固定化胶球胶液的体积比为(10-40)：100。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述混合液与交联剂的体积比为1：(5-10)。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述交联的温度为0-4℃，时间为12-24h。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述斯鲁菲亚红酵母菌悬液中斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度为(4-9)×10⁸cfu/ml。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作的过程中，生理盐水经灭菌处理。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述固定化胶球胶液中聚乙烯醇的浓度为7-10wt％，海藻酸钠的浓度为1-2.5wt％，sio2的浓度为0.5-2wt％。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述交联剂中硼酸的浓度为4-5wt％、氯化钙的浓度为0.5-2wt％。

在上述的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法中，所述交联剂的ph为6-7。

本发明另一个目的在于提供上述斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制备方法制成的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球，所述斯鲁菲亚红酵母固定化胶球以聚乙烯醇-海藻酸钠-二氧化硅为包埋固定化材料，包埋有斯鲁菲亚红酵母菌体。

本发明斯鲁菲亚红酵母固定化胶球以斯鲁菲亚红酵母为菌体，以聚乙烯醇-海藻酸钠-二氧化硅为包埋固定化材料，通过添加二氧化硅提高胶球的机械强度和传质性，并且首次进行了斯鲁菲亚红酵母胶球的制作，具有工艺简单、原料新颖的特点。

与现有技术相比，本发明具有以下几个优点：

1.本发明首次将斯鲁菲亚红酵母进行固定化胶球制作，拓展了现有固定化藻菌选用的菌种，也为探究此种酵母固定化胶球应用打下基础。

2.本发明将sio2应用于固定化胶球的制作，有利的增强了胶球的传质性和使用寿命，并且比当前改性原料-活性炭价格低廉，使用方便。

3.本发明制作方法简单，材料简单易得，胶球制作成型效率高，制得的胶球稳定性好，使用寿命长，且生物活性较好，对氨氮和亚硝酸盐氮的降解率可达90％以上。

附图说明

图1为本发明实施例3制成的固定化胶球的数码照片；

图2为本发明实施例3制成的固定化胶球横截面电镜图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

表1：斯鲁菲亚红酵母固定化胶球制作配方

实施例1：

斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作：从菌种斜面保存培养基上取2环斯鲁菲亚红酵母菌种接种到装液量为80ml/500ml的三角锥形瓶中，30℃，160r/min培养24h形成种子培养基。再将种子培养基以6％的接种量接种到装液80ml/500ml锥形瓶中，其它培养条件不变，培养48h，40000r/min离心获得菌体，并用生理盐水清洗、离心3遍，获得菌体，并添加灭菌后的生理盐水200ml，混匀制成斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度为9×10⁸cfu/ml的菌悬液，备用。

固定化胶球胶液的制作：选取聚乙烯醇、海藻酸钠作为基础配方，另添加二氧化硅作为包埋材料，与过滤、灭菌后的自然海水混合成100ml胶液，置于100℃烘箱溶解过夜，混匀冷却后制成浓度如表1中实施例1所示的固定化胶球胶液，待用。

交联剂的制作：将硼酸溶液进行高温灭菌，待冷却到室温后，无菌添加入氯化钙混合得到交联剂，交联剂中硼酸的浓度为4.5wt％、氯化钙的浓度为1wt％。交联剂使用前用碳酸钠调节ph至6.7。

斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制作：按表1中实施例1所示，取斯鲁菲亚海洋红酵母菌悬液10ml与冷却后的固定化胶球胶液100ml混合均匀得到混合液。采用24v小型蠕动泵(蠕动泵上装有直径3mm的硅胶管，硅胶管一段接有3mm的y型3通接头匀速形成液滴)将混合液滴入600ml的交联剂中，4℃交联15h，得到斯鲁菲亚红酵母固定化胶球，用生理盐水冲洗3遍，得到成品。

实施例2：

斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作：从菌种斜面保存培养基上取2环斯鲁菲亚红酵母菌种接种到装液量为80ml/500ml的三角锥形瓶中，30℃，160r/min培养24h形成种子培养基。再将种子培养基以6％的接种量接种到装液80ml/500ml锥形瓶中，其它培养条件不变，培养48h，40000r/min离心获得菌体，并用生理盐水清洗、离心3遍，获得菌体，并添加灭菌后的生理盐水200ml，混匀制成斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度为9×10⁸cfu/ml的菌悬液，备用。

固定化胶球胶液的制作：选取聚乙烯醇、海藻酸钠作为基础配方，另添加二氧化硅作为包埋材料，与过滤、灭菌后的自然海水混合成100ml胶液，置于100℃烘箱溶解过夜，混匀冷却后制成浓度如表1中实施例2所示的固定化胶球胶液，待用。

交联剂的制作：将硼酸溶液进行高温灭菌，待冷却到室温后，无菌添加入氯化钙混合得到交联剂，交联剂中硼酸的浓度为4.5wt％、氯化钙的浓度为1wt％。交联剂使用前用碳酸钠调节ph至6.7。

斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制作：按表1中实施例2所示，取斯鲁菲亚海洋红酵母菌悬液10ml与冷却后的固定化胶球胶液100ml混合均匀得到混合液。采用24v小型蠕动泵(蠕动泵上装有直径3mm的硅胶管，硅胶管一段接有3mm的y型3通接头匀速形成液滴)将混合液滴入600ml的交联剂中，4℃交联15h，得到斯鲁菲亚红酵母固定化胶球，用生理盐水冲洗3遍，得到成品。

实施例3：

斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作：从菌种斜面保存培养基上取2环斯鲁菲亚红酵母菌种接种到装液量为80ml/500ml的三角锥形瓶中，30℃，160r/min培养24h形成种子培养基。再将种子培养基以6％的接种量接种到装液80ml/500ml锥形瓶中，其它培养条件不变，培养48h，40000r/min离心获得菌体，并用生理盐水清洗、离心3遍，获得菌体，并添加灭菌后的生理盐水200ml，混匀制成斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度为9×10⁸cfu/ml的菌悬液，备用。

固定化胶球胶液的制作：选取聚乙烯醇、海藻酸钠作为基础配方，另添加二氧化硅作为包埋材料，与过滤、灭菌后的自然海水混合成100ml胶液，置于100℃烘箱溶解过夜，混匀冷却后制成浓度如表1中实施例3所示的固定化胶球胶液，待用。

交联剂的制作：将硼酸溶液进行高温灭菌，待冷却到室温后，无菌添加入氯化钙混合得到交联剂，交联剂中硼酸的浓度为4.5wt％、氯化钙的浓度为1wt％。交联剂使用前用碳酸钠调节ph至6.7。

斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制作：按表1中实施例3所示，取斯鲁菲亚海洋红酵母菌悬液10ml与冷却后的固定化胶球胶液100ml混合均匀得到混合液。采用24v小型蠕动泵(蠕动泵上装有直径3mm的硅胶管，硅胶管一段接有3mm的y型3通接头匀速形成液滴)将混合液滴入600ml的交联剂中，4℃交联15h，得到斯鲁菲亚红酵母固定化胶球，用生理盐水冲洗3遍，得到成品。

图1为本实施例制成的固定化胶球的数码照片，从图1可知，本实施例制备得到的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球呈球形、无拖尾、形态良好、个体均匀。

图2为本实施例制成的固定化胶球横截面电镜图，从图2可知，在2000倍电镜下，本实施例制备得到的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球球体内部有斯鲁菲亚红酵母存在，且存在孔道，可为斯鲁菲亚红酵母生长提供空间。

实施例4：

斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作：从菌种斜面保存培养基上取2环斯鲁菲亚红酵母菌种接种到装液量为80ml/500ml的三角锥形瓶中，30℃，160r/min培养24h形成种子培养基。再将种子培养基以6％的接种量接种到装液80ml/500ml锥形瓶中，其它培养条件不变，培养48h，40000r/min离心获得菌体，并用生理盐水清洗、离心3遍，获得菌体，并添加灭菌后的生理盐水200ml，混匀制成斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度为9×10⁸cfu/ml的菌悬液，备用。

固定化胶球胶液的制作：选取聚乙烯醇、海藻酸钠作为基础配方，另添加二氧化硅作为包埋材料，与过滤、灭菌后的自然海水混合成100ml胶液，置于100℃烘箱溶解过夜，混匀冷却后制成浓度如表1中实施例4所示的固定化胶球胶液，待用。

交联剂的制作：将硼酸溶液进行高温灭菌，待冷却到室温后，无菌添加入氯化钙混合得到交联剂，交联剂中硼酸的浓度为4.5wt％、氯化钙的浓度为1wt％。交联剂使用前用碳酸钠调节ph至6.7。

斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制作：按表1中实施例4所示，取斯鲁菲亚海洋红酵母菌悬液10ml与冷却后的固定化胶球胶液100ml混合均匀得到混合液。采用24v小型蠕动泵(蠕动泵上装有直径3mm的硅胶管，硅胶管一段接有3mm的y型3通接头匀速形成液滴)将混合液滴入600ml的交联剂中，4℃交联15h，得到斯鲁菲亚红酵母固定化胶球，用生理盐水冲洗3遍，得到成品。

实施例5：

斯鲁菲亚红酵母菌悬液的制作：从菌种斜面保存培养基上取2环斯鲁菲亚红酵母菌种接种到装液量为80ml/500ml的三角锥形瓶中，30℃，160r/min培养24h形成种子培养基。再将种子培养基以6％的接种量接种到装液80ml/500ml锥形瓶中，其它培养条件不变，培养48h，40000r/min离心获得菌体，并用生理盐水清洗、离心3遍，获得菌体，并添加灭菌后的生理盐水200ml，混匀制成斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度为9×10⁸cfu/ml的菌悬液，备用。

固定化胶球胶液的制作：选取聚乙烯醇、海藻酸钠作为基础配方，另添加二氧化硅作为包埋材料，与过滤、灭菌后的自然海水混合成100ml胶液，置于100℃烘箱溶解过夜，混匀冷却后制成浓度如表1中实施例5所示的固定化胶球胶液，待用。

交联剂的制作：将硼酸溶液进行高温灭菌，待冷却到室温后，无菌添加入氯化钙混合得到交联剂，交联剂中硼酸的浓度为4.5wt％、氯化钙的浓度为1wt％。交联剂使用前用碳酸钠调节ph至6.7。

斯鲁菲亚红酵母固定化胶球的制作：按表1中实施例5所示，取斯鲁菲亚海洋红酵母菌悬液10ml与冷却后的固定化胶球胶液100ml混合均匀得到混合液。采用24v小型蠕动泵(蠕动泵上装有直径3mm的硅胶管，硅胶管一段接有3mm的y型3通接头匀速形成液滴)将混合液滴入600ml的交联剂中，4℃交联15h，得到斯鲁菲亚红酵母固定化胶球，用生理盐水冲洗4遍，得到成品。

将本发明实施例1-5制成的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球进行基本性状测试，测试结果如表2所示。

表2：基本性状测试结果

对比例1：

对比例1与实施例3的区别仅在于，对比例1中固定化胶球胶液中的pva由等量sa代替。

对比例2：

对比例2与实施例3的区别仅在于，对比例2中固定化胶球胶液中的sa由等量pva代替。

对比例3：

对比例3与实施例3的区别仅在于，对比例3中固定化胶球胶液中的sio2由等量活性炭代替。

对比例4：

对比例4与实施例3的区别仅在于，对比例4中固定化胶球胶液中的sio2的浓度为0。

将本发明实施例1-5与对比例1-4制成的斯鲁菲亚红酵母固定化胶球进行性能测试，测试结果如表3所示。

表3：性能测试结果

在上述实施例及其替换方案中，交联剂的体积还可以为550ml、650ml、700ml、750ml、800ml、850ml、900ml、950ml、1000ml、1100ml以及550-1100ml中的任意体积；交联的温度还可以为0℃、1℃、2℃、3℃以及0-4℃中的任意温度；交联的时间还可以为12h、13h、14h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h以及12-24h中的任意时间；交联剂的ph还可以为6、6.3、6.5、6.8、7以及6-7中的任意ph值；交联剂中硼酸的浓度还可以为4wt％、4.2wt％、4.8wt％、5wt％以及4-5wt％中的任意浓度值；交联剂中的氯化钙的浓度还可以为0.5wt％、0.8wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％、2wt％以及0.5-2wt％中的任意浓度值；斯鲁菲亚红酵母菌悬液中斯鲁菲亚红酵母菌体的浓度还可以为4×10⁸cfu/ml、5×10⁸cfu/ml、6×10⁸cfu/ml、7×10⁸cfu/ml、8×10⁸cfu/ml以及(4-9)×10⁸cfu/ml中的任意浓度。

鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-5作为代表说明本发明申请优异之处。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。