本发明涉及智利小植绥螨剖腹卵染色体的制备方法，属于智利小植绥螨基础生物学研究领域。
背景技术：
捕食螨是重要的小型有害生物天敌，有些捕食螨生殖具有特殊性，即雌雄后代均从受精卵发育而来，但雄性后代因父系基因异染色质化后消失而发育成类单倍体。这被认为是由一些捕食螨如植绥螨科捕食螨特殊的生殖方式决定，即假产雄孤雌生殖(pseudoarrhenotoky)(hoy,1985;nagalkerke&sabelis1998;sabelisetal.2002)。近年来，捕食螨除了作为生物防治用天敌外，其生物学习性研究也受到关注，尤其是假产雄孤雌生殖这一特殊的生殖现象。
nelson-reesetal.（1980）观察了西方静走螨卵发育过程中的核型变化认为：在卵产出后0-24小时内，部分卵的胚胎细胞一半染色质（3/6）开始固缩为异染色质；产出后24-48小时内，这部分胚胎中大部分细胞出现异染色质化现象，随后异染色质被排出细胞，胚胎发育为单倍体雄性。这一研究结果目前仍是已发表的对植绥螨科性别决定理论最详细的描述，其认为植绥螨性别决定发生在卵产出后的初期。
事实是否如此呢，异染色质化究竟始于何时，为了弄清智利小植绥螨的卵在产出前是否已经存在单倍体核型，即卵产出前发育为雄螨的卵中的一半染色体是否已经发生异质化或丢失，需要对剖腹卵染色体进行研究，观察染色体是单倍体或二倍体及是否发生异质化。
由于智利小植绥螨个体微小，只有几百个微米，且身体比较脆弱操作过程中很容易对其产生损伤导致体液外流，体驱干瘪无法开展任何试验，进行显微操作难度相当大、难以从单一个体获得完整的组织样本，因此无论是从形态结构到细胞水平，研究染色体是单倍体或二倍体及是否发生异质化都十分困难。除此以外，研究智利小植绥螨剖腹卵染色体是单倍体或二倍体及是否发生异质化，需要制作剖腹卵玻片标本并在显微镜下观察玻片标本中的剖腹卵染色体，然而现有资料中并没有如何获得或制作智利小植绥螨剖腹卵染色体的方法报道。
为观察智利小植绥螨剖腹卵染色体是单倍体或二倍体及是否发生异质化，本发明提供一种制备智利小植绥螨剖腹卵染色体的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供智利小植绥螨剖腹卵染色体的制备方法，能够为获得智利小植绥螨剖腹卵及制备剖腹卵染色体、观察智利小植绥螨剖腹卵染色体是单倍体或二倍体及是否发生异质化提供具体操作方法。
本发明是采用剖腹的形式人为从智利小植绥螨雌成螨体内获取尚未产出卵并在载玻片上制备剖腹卵染色体的方法，包含待剖腹智利小植绥螨雌成螨的获得与其在载玻片上的放置、智利小植绥螨剖腹卵的获取与其存放、染色体玻片标本制备5个步骤，除观察染色体外，所有操作均在体式显微镜下进行，具体操作方法为：
（1）待剖腹智利小植绥螨雌成螨的获得：从智利小植绥螨的饲养群体中挑取智利小植绥螨的卵单独饲养至成螨，然后将一雌一雄放在饲养小室内进行配对，初羽化的雌雄智利小植绥螨会很快进行交配，待交配完成后，继续给雌成螨提供充足的猎物，12-15小时雌成螨腹部膨大有卵后即获得待剖腹智利小植绥螨雌成螨；
（2）待剖腹智利小植绥螨雌成螨在载玻片上的放置：滴一滴清水到载玻片上，挑取待解剖的雌成螨放在载玻片上的清水中，并用昆虫针和细毛笔保持雌成螨背面朝上，清水滴入量不要过多，避免雌成螨漂浮在水层上，确保雌成螨仍然能够接触到载玻片；
（3）智利小植绥螨剖腹卵的获取：先用3号粗昆虫针按住智利小植绥螨雌成螨的鄂体部分，再用0号细昆虫针从智利小植绥螨头部开始向腹部轻轻挤压至腹部破裂，即可看见智利小植绥螨剖腹卵，随后用0号细毛笔尖部将卵周围的组织轻轻拨开，此步骤一定要在清水中进行，防止卵失水干瘪；
（4）智利小植绥螨剖腹卵的存放：智利小植绥螨剖腹卵处于水中时间过长容易破裂，需要快速用0号细毛笔将剖腹卵从水中小心挑出后放置于100％的酒精中存放备用，即获得智利小植绥螨剖腹卵；
（5）染色体玻片标本制备：用胶头滴管滴入一滴0.075mol/l的氯化钾溶液于载玻片的中央位置，然后用0号细毛笔将取出的智利小植绥螨剖腹卵放置于载玻片上的氯化钾溶液中，常温下放置30分钟，再用移液枪或胶头滴管将氯化钾溶液吸走或将剖腹卵用细毛笔转移到新的载玻片上，用0号昆虫针或更细的针状工具将剖腹卵轻轻弄破，并快速往载玻片上滴入一滴新配置的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），固定30分钟，在此过程中至少补充滴加3次固定液（因为固定液挥发速度快），待固定液干燥后，往载玻片上滴入吉姆萨染液（原液1份，ph7.2磷酸缓冲液9份稀释），常温下染色60分钟，最后用清水将染液冲洗掉，经自然干燥或用吹风机吹干后，往载玻片上被染上色的位置上面滴入一滴优巴拉尔，然后盖上盖玻片，并用记号笔对染上色的部位进行圈注以方便观察，待样品固定好后在光学显微镜下即可观察智利小植绥螨剖腹卵染色体。
本发明可以十分巧妙的获得不同时间段的智利小植绥螨剖腹卵并制备染色体，剖腹卵染色体的制备能够为观察智利小植绥螨剖腹卵染色体是单倍体或二倍体及是否发生异质化提供原材料，不同时间段剖腹卵染色体的获得有利于找到最早发生染色体异质化的时间结点，这能够对揭示智利小植绥螨的生殖机理提供有力证据。
具体实施方式
实施例智利小植绥螨剖腹卵染色体标本制备方法
具体操作方法包括以下5部分，除观察染色体外，所有操作均在体式显微镜下进行：
（1）待剖腹智利小植绥螨雌成螨的获得：从智利小植绥螨的饲养群体中挑取智利小植绥螨的卵单独饲养至成螨，然后将一雌一雄放在饲养小室内进行配对，初羽化的雌雄智利小植绥螨会很快进行交配，待交配完成后，继续给雌成螨提供充足的猎物，12-15小时雌成螨腹部膨大有卵后即获得待剖腹智利小植绥螨雌成螨；
（2）待剖腹智利小植绥螨雌成螨在载玻片上的放置：滴一滴清水到载玻片上，挑取待解剖的雌成螨放在载玻片上的清水中，并用昆虫针和细毛笔保持雌成螨背面朝上，清水滴入量不要过多，避免雌成螨漂浮在水层上，确保雌成螨仍然能够接触到载玻片；
（3）智利小植绥螨剖腹卵的获取：先用3号粗昆虫针按住智利小植绥螨雌成螨的鄂体部分，再用0号细昆虫针从智利小植绥螨头部开始向腹部轻轻挤压至腹部破裂，即可看见智利小植绥螨剖腹卵，随后用0号细毛笔尖部将卵周围的组织轻轻拨开，此步骤一定要在清水中进行，防止卵失水干瘪；
（4）智利小植绥螨剖腹卵的存放：智利小植绥螨剖腹卵处于水中时间过长容易破裂，需要快速用0号细毛笔将剖腹卵从水中小心挑出后放置于100％的酒精中存放备用，即获得智利小植绥螨剖腹卵；
（5）染色体玻片标本制备：用胶头滴管滴入一滴0.075mol/l的氯化钾溶液于载玻片的中央位置，然后用0号细毛笔将取出的智利小植绥螨剖腹卵放置于载玻片上的氯化钾溶液中，常温下放置30分钟，再用移液枪或胶头滴管将氯化钾溶液吸走或将剖腹卵用细毛笔转移到新的载玻片上，用0号昆虫针或更细的针状工具将剖腹卵轻轻弄破，并快速往载玻片上滴入一滴新配置的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），固定30分钟，在此过程中至少补充滴加3次固定液（因为固定液挥发速度快），待固定液干燥后，往载玻片上滴入吉姆萨染液（原液1份，ph7.2磷酸缓冲液9份稀释），常温下染色60分钟，最后用清水将染液冲洗掉，经自然干燥或用吹风机吹干后，往载玻片上被染上色的位置上面滴入一滴优巴拉尔，然后盖上盖玻片，并用记号笔对染上色的部位进行圈注以方便观察，待样品固定好后在光学显微镜下即可观察智利小植绥螨剖腹卵染色体。