一种可磁性分离固定化NAD激酶及其制备的制作方法

本发明为一种可磁性分离固定化nad激酶及制备方法，属于磁性分离固定化nad激酶、固定化nad激酶制备的技术领域。将溶剂热法合成的四氧化三铁亚微米粒子进行环氧化、亚氨基二乙酸(ida)修饰、负载过渡金属离子(me)作为载体，通过金属螯合作用固定nad激酶。

背景技术：

nadp⁺及其还原态nadph是许多氧化还原反应的底物或辅因子，是许多生物学过程的重要调节物质。nadph为光合作用二氧化碳的固定、蛋白及脂肪酸合成提供还原力，并参与dna合成^[1]，还可以提高木糖发酵乙醇产量^[2]，因此nadp(h)在生物合成方面起非常关键的作用。nadph是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，在细胞防御活性氧损伤方面起着重要的作用，线粒体的β-氧化中，nadp(h)具有辅因子和分子伴侣双重身份，它的缺乏会导致二烯酸coa还原酶失活、赖氨酸降解相关酶不稳定，从而引起高赖氨酸血症^[3]；研究发现nadp⁺/nadph可治疗和缓解阿尔兹海默病和帕金森病治疗^[4]。以nad为底物催化生成nadp的唯一酶是nad激酶。

固定化酶催化法具有方便操作、易于从产物中分离回收和重复利用，可实现连续化反应降低生产成本等优点。

超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子负载过渡金属离子固定带his标签的基因工程蛋白酶用于生物转化，是将基因工程蛋白酶固定超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子用于催化反应产生生物产物的方法。此方法能将基因工程目标蛋白快速、高选择性地从混合液中进行富集与固定化，并可在外加磁场的作用下将固定化酶从反应体系中分离出来，便于连续化操作和重复利用。超顺磁性四氧化三铁粒子环氧化偶联ida，一般是在多种有机试剂参与下经复杂的聚合反应在四氧化三铁粒子表面包覆带环氧基的高分子聚合物，然后偶联ida。如yutingzhang等先用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷包裹四氧化三铁磁性亚微米粒子，然后用乙腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、亚甲基双丙烯酰胺、偶氮二异丁腈等进行聚合反应，得到表面有环氧基官能团的聚合物,然后连接ida和负载二价镍离子用于固定带his标签的纤维素酶^[5]。

1.lineagledal,marcniere,mathiasziegler.thephosphatemakesadifference:cellularfunctionsofnadp[j].redoxreport2010,15(1):2-10

2.biaozhang,jiazhang,dongmeiwang,etal.dataforrapidethanolproductionatelevatedemperaturesbyengineeredthermotolerantkluyveromycesmarxianusviathenadp(h)-preferringxylosereductase–xylitoldehydrogenasepathway[j].datainbrief,2015,5:179-186

3.sanderm.houten,simonedenis,heleentebrinke1,etal.mitochondrialnadp(h)deficiencyduetoamutationinnadk2causesdienoyl-coareductasedeficiencywithhyperlysinemia[j].humanmoleculargenetics,2014,23(18):5009-5016

4.张姗姗，王彦，李德东，等.nadh和nadph代谢和功能的研究进展[j].第二军医大学报，2011，32(11):1239-1243

5.yutingzhang,yongkunyang,wanfuma,jiaguo,yaolin,andchangchunwang.uniformmagneticcore/shellmicrospheresfunctionalizedwithni²⁺−iminodiaceticacidforonesteppurificationandimmobilizationofhis-taggedenzymes[j].acsappliedmaterials&interfaces，2013,5,2626−2633

本发明基于四氧化三铁亚微米粒子无聚合反应环氧修饰、ida连接、负载二价过渡金属离子，通过金属螯合作用固定带his标签的nad激酶，并用于催化nad生产nadp。

技术实现要素：

本发明提供一种可磁性分离的固定化nad激酶，其特征是：将nad激酶固定在超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子上，超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子直径180~450nm；固定化nad激酶的制备过程是经溶剂热法合成超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子、经环氧氯丙烷环氧化、连接ida、负载过渡金属离子，获得固定化载体，以此为载体通过金属螯合作用固定带his标签的nad激酶，选择性好，固定化过程快速（少于20min），酶负载量为50~200mg/g载体；30℃条件下，固定化酶比活力每克固定化酶可达到6μmol/min。将获得的固定化nad激酶以nad为底物，催化生产nadp，副产物少，分离方便，是生产nadp(h)快速、有效的方法。

工艺步骤如下：

a.称取fecl3·6h2o加入乙二醇，使乙二醇中fecl3·6h2o的含量为20~60g/l，经磁力搅拌至完全溶解形成澄清透明溶液。称取无水乙酸钠，聚乙二醇-4000加入上述溶液中，使其质量浓度分别为50~100g/l、10~80g/l，磁力搅拌，使其全部溶解。然后将混合液体倒入聚四氟乙烯衬底的不锈钢反应釜中密封，170~250℃反应8~16h。反应结束后自然冷却至室温，将得到的产物磁性分离，并分别用去离子水和无水乙醇洗涤3~5次，放入真空干燥箱中60℃干燥过夜，得到超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子。

b.在0.5~1.2mol/l的naoh溶液中加入1,4-二氧六环和环氧氯丙烷混合液，二者体积比1:10~10:1，将超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子加入溶液中，使其含量为20g/l，在超声波清洗器中超声使均匀分散，置于恒温振荡器中，摇床反应4h。反应结束后，去离子水洗涤3~5次，得环氧化的四氧化三铁亚微米粒子。

c.将环氧化的超顺磁四氧化三铁亚微米粒子加入ida溶液（0.4mol/l，ph7.0）：碳酸盐缓冲液（0.1mol/l，ph9.5）=1:1的混合液中，反应5~50h，用去离子水洗涤，得fe3o4-ida亚微米粒子。

d.加入0.01~1mol/l的二价过渡金属离子溶液，置于摇床反应5～50h。将反应产物用去离子水和无水乙醇洗涤，得fe3o4-ida-me亚微米粒子，并低温保存20%乙醇溶液中。

e.在含抗生素的lb培养基中培养含6×his标签的nad激酶基因的工程菌（e.coli），37℃摇床反应。待其od值为0.5~0.8时，加入iptg诱导产生nad激酶，30℃过夜培养。离心收集e.coli，重悬于10mmol/l咪唑溶液中，破胞后高速冷冻离心，将上清液（含nad激酶）低温保存。将fe3o4-ida-me亚微米粒子用pbs缓冲液(12mmol/l，ph7.4)清洗5次，加入含nad激酶上清液，fe3o4-ida-me亚微米粒子加入量为5~30g/lnad激酶上清液，作用5~20min，磁性分离，pbs缓冲液(12mmol/l，ph7.4)清洗5次，得到超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子固定化nad激酶。

采用德国zeiss公司supra-55型扫描电镜（sem）表征a所得产物的微观形貌（见图1所示）；采用日本rigaku公司的d/max-uitima型x射线衍射仪（xrd）表征a产物的成分及结构（见图2所示）；采用日本岛津公司3100-ft-ir型红外光谱仪表征a、c和d产物的红外吸收光谱（见图3所示）；采用tanonve-108b微型垂直电泳槽表征e产物的sds-page（见图4所示）。

附图说明

图1.a产物的sem图。超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子粒径为380nm左右。

图2.a产物的xrd图。可知产物为四氧化三铁亚微米粒子，且为多相反尖晶石结构。

图3.a、c和d产物的ft-ir图。横坐标为波数，单位为：厘米^-1(cm^-1)；纵坐标为透光率，单位为：%。图中i为四氧化三铁亚微米粒子红外光谱图，590cm^-1处为四氧化三铁中fe-o键特征吸收峰，1653cm^-1处为o-h键弯曲振动吸收峰，3443cm^-1处为o-h键伸缩振动吸收峰。图中ii为ida-fe3o4亚微米粒子红外光谱图，1051cm^-1处为c-o键特征吸收峰，1402cm^-1处为c-n键特征吸收峰，1631cm^-1处为c=o的伸缩振动峰，说明ida连接在四氧化三铁亚微米粒子上。图中iii为me-ida-fe3o4亚微米粒子红外光谱图,金属离子螯合作用是c=o的伸缩振动峰从1631cm^-1红移至1634cm^-1。

图4.sds-page图（以nad激酶和fe3o4-ida-ni²⁺磁性微粒子为例）。其中，纵向为蛋白相对分子质量。单位为：千摩尔质量（kda）。m为蛋白marker，1为nad激酶蛋白原液，2为固定化nad激酶，3为tris-nacl洗涤后的固定化nad激酶，4为500mm咪唑溶液洗脱后的固定化nad激酶，5为1000mm咪唑溶液洗脱后的固定化nad激酶，6为0.1%bsa蛋白原液，7为固定化bsa，8为tris-nacl洗涤后的固定化bsa，9为500mm咪唑溶液洗脱后的固定化bsa,10为1000mm咪唑溶液洗脱后的固定化bsa。从图中可知，fe3o4-ida-ni²⁺磁性微粒子对bsa没有吸附作用，而nad激酶则可以稳定地结合在fe3o4-ida-ni²⁺磁性微粒子上，并且在tris-nacl溶液和500mm咪唑溶液的作用下洗去部分杂蛋白，在1000mm咪唑溶液的作用下将nad激酶洗脱下来。这说明fe3o4-ida-ni²⁺磁性微粒子对nad激酶具有特异性吸附作用。

具体实施方式

实施例1：

称取4.05g的fecl3·6h2o，加入80ml乙二醇，经磁力搅拌至完全溶解形成澄清透明溶液。称取10.8g无水乙酸钠和3g聚乙二醇-4000加入上述溶液中，磁力搅拌，使其全部溶解。然后将混合液体倒入聚四氟乙烯衬底的不锈钢反应釜中密封，温度为180℃反应12h。反应结束后自然冷却至室温，将得到的产物磁性分离，并分别用去离子水和无水乙醇洗涤3~5次，放入真空干燥箱中60℃干燥过夜，得到超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子。

在18ml纯水中溶解1.0g的naoh，待其完全溶解后，加入10ml的1,4-二氧六环和5ml的环氧氯丙烷，混合均匀后，称取0.5g超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子加入溶液中，在超声波清洗器中超声使均匀分散，置于恒温振荡器中，摇床反应10h。反应结束后，去离子水洗涤3~5次，得环氧化的四氧化三铁亚微米粒子。

将环氧化的超顺磁四氧化三铁亚微米粒子分别加入10ml的ida（0.4mol/l，ph7.0）和10ml的碳酸盐缓冲液（0.1mol/l，ph9.5），置于摇床反应10h，用去离子水洗涤，得fe3o4-ida亚微米粒子。

加入0.1mol/l的niso4溶液20ml，置于摇床反应8h。将反应产物用去离子水和无水乙醇溶液洗涤，得fe3o4-ida-ni²⁺亚微米粒子，并低温保存于20%的乙醇溶液中。

在含抗生素的lb培养基中培养含6×his标签的nad激酶基因的工程菌（e.coli），37℃摇床反应。待其od值为0.5~0.8时，加入iptg诱导产生nad激酶，30℃过夜。离心收集e.coli，重悬于低浓度（10mmol/l）咪唑溶液中，破胞后高速冷冻离心，将nad激酶蛋白上清液低温保存。取25mg的fe3o4-ida-ni²⁺亚微米粒子用ph=7.8的pbs缓冲液清洗5次，在4℃的条件下，加入1ml制备好的nad激酶蛋白液，轻微摇晃10min，将剩余溶液倒出，然后用ph=7.8的pbs缓冲液清洗5次，得到固定化nad激酶。

实施例2：

称取2.7g的fecl3·6h2o，加入80ml乙二醇，经磁力搅拌至完全溶解形成澄清透明溶液。称取7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇-4000加入上述溶液中，磁力搅拌，使其全部溶解。然后将混合液体倒入聚四氟乙烯衬底的不锈钢反应釜中密封，温度为200℃反应8h。反应结束后自然冷却至室温，将得到的产物磁性分离，并分别用去离子水和无水乙醇洗涤5次，放入真空干燥箱中在60℃条件下干燥过夜，得到超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子。

在18ml纯水中溶解0.6g的naoh，待其完全溶解后，加入10ml的1,4-二氧六环和5ml的环氧氯丙烷，混合均匀后，称取0.5g超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子加入溶液中，在超声波清洗器中超声使均匀分散，置于恒温振荡器中，摇床反应4h。反应结束后，去离子水洗涤5次，得环氧化的四氧化三铁亚微米粒子。

将环氧化的超顺磁四氧化三铁亚微米粒子分别加入20ml的ida（0.4mol/l，ph7.0）和20ml的碳酸盐缓冲液（0.1mol/l，ph9.5），置于摇床反应24h，用去离子水洗涤，得fe3o4-ida亚微米粒子。

加入0.1mol/l的niso4溶液20ml，置于摇床反应12h。将反应产物用去离子水和无水乙醇溶液洗涤，得fe3o4-ida-ni²⁺亚微米粒子，并低温保存于20%的乙醇溶液中。

在含抗生素的lb培养基中培养含6×his标签的nad激酶基因的工程菌（e.coli），37℃摇床反应。待其od值为0.5~0.8时，加入iptg诱导产生nad激酶，30℃过夜。离心收集e.coli，重悬于低浓度（10mmol/l）咪唑溶液中，破胞后高速冷冻离心，将nad激酶蛋白上清液低温保存。取25mg的fe3o4-ida-ni²⁺亚微米粒子用ph=7.8的pbs缓冲液清洗5次，在4℃的条件下，加入1ml制备好的nad激酶蛋白液，轻微摇晃10min，将剩余溶液倒出，然后用ph=7.8的pbs缓冲液清洗5次，得到固定化nad激酶。

实施例3：

称取2.7g的fecl3·6h2o，加入80ml乙二醇，经磁力搅拌至完全溶解形成澄清透明溶液。称取7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇-4000加入上述溶液中，磁力搅拌，使其全部溶解。然后将混合液体倒入聚四氟乙烯衬底的不锈钢反应釜中密封，温度为200℃反应8h。反应结束后自然冷却至室温，将得到的产物磁性分离，并分别用去离子水和无水乙醇洗涤5次，放入真空干燥箱中在60℃条件下干燥过夜，得到超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子。

在18ml纯水中溶解0.6g的naoh，待其完全溶解后，加入10ml的1,4-二氧六环和2ml的环氧氯丙烷，混合均匀后，称取0.5g超顺磁性四氧化三铁亚微米粒子加入溶液中，在超声波清洗器中超声使均匀分散，置于恒温振荡器中，摇床反应4h。反应结束后，去离子水洗涤5次，得环氧化的四氧化三铁亚微米粒子。

将环氧化的超顺磁四氧化三铁亚微米粒子分别加入20ml的ida（0.4mol/l，ph7.0）和20ml的碳酸盐缓冲液（0.1mol/l，ph9.5），置于摇床反应24h，用去离子水洗涤，得fe3o4-ida亚微米粒子。

加入1mol/l的niso4溶液20ml，置于摇床反应12h。将反应产物用去离子水和无水乙醇溶液洗涤，得fe3o4-ida-ni²⁺亚微米粒子，并低温保存于20%的乙醇溶液中。

在含抗生素的lb培养基中培养含6×his标签的nad激酶基因的工程菌（e.coli），37℃摇床反应。待其od值为0.5~0.8时，加入iptg诱导产生nad激酶，30℃过夜。离心收集e.coli，重悬于低浓度（10mmol/l）咪唑溶液中，破胞后高速冷冻离心，将nad激酶蛋白上清液低温保存。取50mg的fe3o4-ida-ni²⁺亚微米粒子用ph=7.8的pbs缓冲液清洗5次，在4℃的条件下，加入4ml制备好的nad激酶蛋白液，轻微摇晃20min，将剩余溶液倒出，然后用ph=7.8的pbs缓冲液清洗5次，得到固定化nad激酶。