本发明涉及虾青素小球藻粉制备领域，具体涉及一种富硒虾青素小球藻粉的制备方法。
背景技术：
小球藻为绿藻门、绿藻纲、小球藻科的一类单细胞藻类，在自然界广泛分布，常见种主要有普通小球藻、蛋白核小球藻、椭圆小球藻等，已经报道的能产虾青素的是小球藻chlorellazofingiensis，野外(新)采集到的能产生虾青素的新小球藻品系也在本研究之列，也是本研究的独创之处。充足的维生素含量、高蛋白质含量、相对平衡的必须氨基酸、绿藻精、dha、epa是其主要特点，107.5g小球藻干粉足以提供一个人一天除维生素c以外所有维生素的需求。
在湖北荆门等的全国一些省市盛产樟树，有些市列为“市树”，在台湾原产林木中，樟木享有“药王”的美誉，樟树叶中含有丰富的类胡萝卜素，干樟叶中含量高达1％-2％，以叶黄素和β-胡萝卜素含量较多，具有重要的药理功能，可以作为虾青素生物合成的前体物质。
硒是一种生物抗氧化剂，它在小球藻的代谢中，很可能是作为生长因子参与虾青素等色素合成相关酶系的正向调节，适当浓度时刺激细胞的生长及次级代谢产物的合成。由于通过多重组合诱变技术使藻体富虾青素，加之又富硒，硒蛋白的抗氧化与天然虾青素具有协同效应，所以小球藻具有重要而广泛的医学保健功能，如虾青素能防癌抗癌、抗高血压、抗糖尿病、抗高血脂和脂肪肝、抗老年痴呆症、抗炎抗渍疡、治疗心血管疾病、治疗神经系统疾病、提高人的记忆力和免疫功能、解酒、美容功能、抗衰老和延年益寿。
特别需要指出的是：硒有保护视网膜、预防白内障、预防近视、增强视力的功能。人和动物眼的巩膜、水晶体、视网膜含硒量很高，视力敏锐的鹫鹰，其视网膜硒含量比人高100倍。
有机硒是人类和动物的主要营养方式，目前硒已经被掺入到许多复合维生素(如善存片，已经打入美国药店，英文名叫centrum)和复合无机物的制剂中。目前市场上出售的小球藻产品主要有片剂、胶囊、绿藻精口服液等，有一定的营养功能，缺点是产品营养成分的保健功效欠突出。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种富硒虾青素小球藻粉的制备方法。由于湖北省恩施特色富硒马铃薯汁本身含有丰富的有机硒，硒的转化率高，藻体的含硒量可以根据消费者的需求人工控制，所以，得到的小球藻食品兼具硒、虾青素和小球藻三者的多种营养和保健功能，为开发小球藻片和胶囊、小球藻面条、小球藻面包、小球藻饼干、小球藻饮料、小球藻提取液酿造的绿酒、富硒及其他必需微量元素富化小球藻食品奠定了优良的基础。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种富硒虾青素小球藻粉的制备方法，包括如下步骤：
s1、选取已经经过紫外线选育的小球藻良好品系，用60coγ射线重复辐照和超级诱变剂亚硝基胍(ntg)配合处理对小球藻藻种进行进一步选育，得到相对优秀的新品系；
s2、在优化和改良的bg11培养基中培养，1升bg11培养基中添加22克类胡萝卜素提取物，提取物中类胡萝卜素的平均含量为12.52mg/gdw，富硒马铃薯汁100ml和100ml浓缩富硒泉水，ph为6.7；
s3、用一系列平行的40.0w红光灯管和1.2米长28.0w蓝光灯管照射藻液(总光照强度为252μmolm-2s-1)，连续培养至对数生长期，测定d600nm；每天震荡摇动培养物2次，防止黏壁；
s4、诱导小球藻产生富硒蛋白
在培养期间，可以向培养体系连续多次添加适量浓缩富硒泉水，使最终含硒量达到用户的需求；
s5、培养1到2天后，通过1.2米长蓝光灯管+高光强+氮饥饿+51.8g/l葡萄糖和20.0g/l木糖，进行生物量发酵和诱导部分虾青素，然后在广泛诱导阶段，分步提高光照强度高约555μmolm-2s-1，继续光照，再通过3.0mg/l茉莉酸甲酯加0.2mg/l水杨酸组合0.063ml/l乙烯利诱导获得虾青素硒小球藻藻种，虾青素含量进一步增加1倍以上；
s6、通过最新优化的组合酶法加高压均质破壁得到小球藻粉，并通过新型虾头壳内源酶辅助提取虾青素。
优选地，可以在富硒小球藻中添加雨生红球藻源天然虾青素，进一步提高天然虾青素含量。
优选地，所述s1具体包括如下步骤：
将处于对数生长期的藻种过滤，得藻泥，用新鲜bg11培养液进行清洗，然后按一定接种密度进行接种，在三角瓶中培养24h后，进行辐照处理，先经0.5kgy的60coγ-射线辐照，剂量率5gy.min-1，每个剂量重复3次，接着用ntg诱变处理(取浓度梯度分别为0.2，0.4，0.8g/l的ntg处理对数生长期藻液，在25℃水浴锅中处理12min后，加入等量的硫代硫酸钠终止反应；离心收集藻细胞，血球计数法对藻细胞进行计数，选择致死率在60％-90％的处理)后，涂布于固体平板上培养，挑选有淡橘红色的、形态特殊且个体大的活细胞，再经扩大培养后进行虾青素含量等特性检测，筛选得到稳定的突变株系；最后用1.2kgy的60coγ-射线辐照，剂量率5gy.min-1，继续培养9d后，挑出橘红色的、形态有变化、细胞周质空间宽、藻落较大的克隆进行液体培养，进行虾青素等含量检测；筛选得到稳定的有一定虾青素含量的突变新株系。
优选地，所述s5具体包括如下步骤：
将对数期的小球藻分别接种于新配制培养基中，在接种量为7ml，温度为25±1℃，平行蓝光灯管照射(260μmolm-2s-1)，光暗周期为12h：12h的培养箱中培养一天，震荡摇瓶一次，将培养基中的葡萄糖和木糖浓度分别调整到51.8g/l和20.0g/l，硝酸钠的浓度分别为0，2mmol/l，取15ml种子接入装有95ml培养基的250ml的三角瓶中，在蓝光灯管照射下进行培养，采用两步法诱导：在生长前期采用适当光照强度的蓝光灯管照射下进行培养，后期用355μmolm-2s-1强光培养，进行虾青素的诱导实验，得到明显高度的虾青素含量和生物量；提高光照强度高约555μmolm-2s-1，继续光照；然后加入茉莉酸甲酯和水杨酸使终浓度分别达到3.0mg/l和0.2mg/l进行培养，再加入0.063ml/l乙烯利，共培养21天，每隔3天考察藻体内虾青素含量的变化，以未作相应处理作为对照，每个培养天数3次重复。
优选地，所述步骤s6中的新型虾头壳内源酶通过以下方法制备所得：
以下所有操作均在4℃下进行；
先将新鲜荆州特产龙虾虾头快速绞碎、捣碎、研磨、匀浆，加入冷的新设计的处理液(0.03medta、1％β-巯基乙醇、7mmchaps、0.92mmdtt、3.5×10-2ml-半胱氨酸、3.5×10-2mcacl2，调整ph至7.2)处理9小时，硫酸铵一级沉淀饱和度35％，二级沉淀饱和度75％，得到粗提的相对高活力的内源酶，-20℃下存放备用。
优选地，所述步骤s6中优化的组合酶法加高压均质破壁的具体步骤为：采用添加量为藻粉质量的0.7％-1.2％的内源酶粗酶和微质量百分比纤维素酶(1800u/mg，上海源叶生物科技有限公司出品，添加量为藻粉质量的0.039％-0.099％)相结合进行酶法破壁，大大减少了纤维素酶加入量，并且用gyb30-6a高压均质机进行高压均质破壁，优化后的破壁条件为：15mpa，25℃，循环3次，破壁压力明显降低，能耗明显减少；52℃，ph4.2条件下酶解2小时进行辅助新提取，并且进行含量测定。最终带来的是相对低的成本、高破壁率和高提取率。
本发明具有以下有益效果：
得到的小球藻食品兼具硒、虾青素和小球藻三者的多种营养和保健功能，为开发小球藻片和胶囊、小球藻面条、小球藻面包、小球藻饼干、小球藻饮料、小球藻提取液酿造的绿酒、富硒及其他必需微量元素富化小球藻食品奠定了优良的基础。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种富硒虾青素小球藻粉的制备方法，包括如下步骤：
s1、用60coγ射线重复辐照和超级诱变剂亚硝基胍(ntg)处理对小球藻藻种进行选育，得到优秀的新品系；
具体步骤：藻种诱变程序：出发藻种→60coγ射线辐照→ntg诱变处理→γ射线重复辐照→很佳诱变藻种。
γ射线辐照处理：从诱变育种技术来看，60coγ射线作为电离射线的一种，能量较高，它可引发藻种基因突变和染色体畸变，给藻种以60coγ射线处理很有可能产生有利于生产的突变株，从而选育到优良藻株。
将处于对数生长期的藻种过滤，得藻泥，用新鲜bg11培养液进行清洗，然后按一定接种密度进行接种，在三角瓶中培养24h后，进行辐照处理，先经0.5kgy的60coγ-射线辐照，剂量率5gy.min-1，每个剂量重复3次，接着用ntg诱变处理后，涂布于固体平板上培养，筛选得到有淡橘红色的且个体大的稳定的突变株系；最后用1.2kgy的60coγ-射线辐照，剂量率5gy.min-1，继续培养9d后，挑出橘红色的、形态有变化、细胞周质空间宽、藻落较大的克隆进行液体培养，进行虾青素含量检测；每个剂量重复3次。
ntg诱变处理：目前，诱变育种广泛利用的一类重要化合物是烷化剂，其中烷化剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍有超级诱变剂之称，可以使基因发生并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发临近位置的基因陆续连锁突变，采用亚硝基胍处理小球藻，具体过程如下：在预实验的基础上，取浓度梯度分别为0.2，0.4，0.8g/l的ntg处理对数生长期藻液，在25℃水浴锅中处理12min后，加入等量的硫代硫酸钠终止反应；离心收集藻细胞，血球计数法对藻细胞进行计数，选择致死率在60％-90％的处理，经过平板培养后，挑选有淡橘红色的、形态特殊且个体大的活细胞，再经扩大培养后进行虾青素含量等特性检测，筛选得到稳定的突变株系。
s2、在改良和优化的bg11培养基中培养，1升bg11培养基中添加22克湖北荆门的樟树叶的类胡萝卜素提取物(提取物中类胡萝卜素的平均含量为12.52mg/gdw)，添加适量″世界硒都″湖北省恩施土家族苗族自治州的丰富的特色资源富硒马铃薯汁100ml和100ml(高山)浓缩富硒泉水；ph为6.7
s3、用一系列平行的40.0w红光灯管和1.2米长28.0w蓝光灯管照射藻液，连续培养至对数生长期，测定d600nm；每天震荡摇动培养物2次，防止黏壁；
s4、诱导小球藻产生富硒蛋白
在培养期间，可以向培养体系(连续)多次添加适量(高山)浓缩富硒泉水，使最终含硒量达到用户的需求；
s5、培养1到2天后，通过1.2米长蓝光灯管+高光强+氮饥饿+51.8g/l葡萄糖和20.0g/l木糖进行生物量发酵和诱导部分虾青素(具体的步骤是：将对数期的小球藻分别接种于新配制培养基中，在接种量为7ml，温度为25±1℃，平行蓝光灯管照射((光照强度为260μmolm-2s-1)，光暗周期为12h：12h的培养箱中培养一天，震荡摇瓶一次，将培养基中的葡萄糖和木糖浓度分别调整到51.8g/l和20.0g/l，硝酸钠的浓度分别为0，2mmol/l，取15ml种子接入装有95ml培养基的250ml的三角瓶中，在蓝光灯管照射下进行培养，采用两步法诱导：在生长前期采用适当光照强度的蓝光灯管照射下进行培养，后期用355μmolm-2s-1强光培养，进行虾青素的诱导实验，得到明显高度的虾青素含量和生物量；提高光照强度高约555μmolm-2s-1，继续光照；然后加入茉莉酸甲酯和水杨酸使终浓度分别达到3.0mg/l和0.2mg/l进行培养，再加入0.063ml/l乙烯利，共培养21天，每隔3天考察藻体内虾青素含量的变化，以未作相应处理作为对照，每个培养天数3次重复。最终获得虾青素高硒小球藻藻种，虾青素含量进一步增加1倍以上；
s6、通过最新优化的组合酶法加高压均质破壁得到小球粉，并通过新型虾头壳内源酶辅助提取虾青素。
s6所述的优化的组合酶法加高压均质破壁的具体步骤方法如下：
采用内源酶粗酶(添加量为藻粉质量的0.7％-1.2％)和微质量百分比纤维素酶(1800u/mg，上海源叶生物科技有限公司出品，添加量为藻粉质量的0.039％-0.099％)相结合进行酶法破壁，大大减少了纤维素酶加入量，并且用gyb30-6a高压均质机进行高压均质破壁，优化后的破壁条件为：15mpa，25℃，循环3次，破壁压力明显降低，能耗明显减少；52℃，ph4.2条件下酶解2小时进行辅助新提取，并且进行含量测定。最终带来的是相对低的成本、高破壁率和高提取率。
所述步骤s6的新型内源酶粗酶提取的具体步骤为：
(以下所有操作均在4℃下进行)：先将新鲜荆州特产龙虾虾头快速绞碎、捣碎、研磨、匀浆，加入冷的新设计的处理液(0.03medta、1％β-巯基乙醇、7mmchaps、0.92mmdtt、3.5×10-2ml-半胱氨酸、3.5×10-2mcacl2，调整ph至7.2)处理9小时，硫酸铵一级沉淀饱和度35％，二级沉淀饱和度75％，得到粗提的相对高活力的内源酶，-20℃下存放备用。
本具体实施可以在富硒小球藻中添加雨生红球藻源天然虾青素，进一步提高天然虾青素含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。