一种厚壳贻贝降压肽的制作方法

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体是一种厚壳贻贝降压肽。

背景技术：

厚壳贻贝（myliuscoruscus）又称海红，是贻贝目壳菜蛤属中的一种，主要分布于黄、渤海和东海沿岸，浙江省自然资源丰富，尤其在舟山（舟山嵊泗有“贻贝之乡”之称）。目前，随着对海洋生物活性物质的深入研究，越来越多的生理活性物质被发现，特别是对多肽的研究。贝类多肽主要功能体现在抗氧化，抗肿瘤，抗菌等多个方面，在医药，化妆等领域扮演着越来越重要的角色。

在现代社会中，高血压已经成为了影响人类健康的主要病因之一。科学家们通过研究高血压的发病机制，致力寻找安全高效的抗高血压药物来保障人类的健康。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种厚壳贻贝降压肽，氨基酸序列为val-phe-pro-lys-pro，体外活性显示具有较好的血管紧张素转化酶(ace)抑制活性。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种厚壳贻贝降压肽，氨基酸序列为val-phe-pro-lys-pro（vfpkp）。

作为优选，降压肽的制备方法包括分步酶解：在厚壳贻贝粉末中加入蒸馏水，搅拌，加入木瓜蛋白酶酶解，酶解结束后离心取上清液，在上清液中加入胰蛋白酶酶解，酶解结束后离心取上清液，浓缩，加入80~98%的乙醇醇沉，离心取上清液，将上清液浓缩干燥得到降压肽粗品；将得到的降压肽粗品进行sephadexg-15凝胶色谱柱层析纯化后再进行高效液相色谱分离纯化得到降压肽纯品。得到的降压肽c端氨基酸为脯氨酸；n端为具支链的疏水氨基酸，具有较好的抑制ace活性作用。

作为优选，厚壳贻贝粉末与蒸馏水的质量体积比为1g：15~25ml；搅拌过程中温度条件为50~70℃恒温，搅拌时间为1.5~2.5h；酶解结束后均采用沸水浴灭酶。充分搅拌使得厚壳贻贝粉末均匀分布在蒸馏水中，形成的酶解底物适合木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的分步酶解。

作为优选，木瓜蛋白酶的加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.3~0.5倍，酶解ph为6.5~7.5，酶解时间为1.0~3.0h；胰蛋白酶加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.07~015倍，酶解ph为9.5~10.5，酶解时间为2.0~4.0h；胰蛋白酶酶解结束后溶液ph调至中性，酶解液浓缩至原体积的1/25~1/15。采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解方式将厚壳贻贝粉末中的蛋白质酶解成分子量小的活性物质。木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件不同，采用分步酶解的方式使得两种蛋白酶的酶解效率均处于较高状态。

作为优选，sephadexg-15凝胶色谱柱层析纯化操作为：用蒸馏水将sephadexg-15凝胶溶胀后装柱，检查柱均匀性后上样，用自动取样器收集洗脱液，在280nm下测紫外吸光度，做曲线；重复上样，根据吸光度曲线收集分离的溶液；上样溶液由质量体积比为1g：3~7ml的降压肽粗品和蒸馏水混合而成。先采用sephadexg-15凝胶色谱柱层析初步纯化降压肽粗品，减少后续高效液相色谱分离纯化的时间成本、原料成本和人工成本。

作为优选，高效液相色谱分离纯化条件为：色谱柱：反相c18键合硅胶柱；流动相：0~4min，水；4~16min，60~80%水，20~40%乙腈；16~35min，乙腈；流速：0.7~1.3ml/min，柱温25~35℃，检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到降压肽纯品。

作为优选，厚壳贻贝粉末为厚壳贻贝闭壳肌脱脂干燥得到。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的一种厚壳贻贝降压肽，氨基酸序列为val-phe-pro-lys-pro，降压肽c端氨基酸为脯氨酸；n端为具支链的疏水氨基酸，体外活性显示具有较好的血管紧张素转化酶（ace）抑制活性。抑制血管紧张素转换酶（ace）的活性，使肾素—血管紧张素系统（ras）处于抑制状态，同时使激肽释放酶-激肽系统（kks）处于激活状态，产生具有降低血压作用的舒缓激肽。

附图说明

图1为凝胶纯化图；

图2为液相纯化图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种厚壳贻贝降压肽，氨基酸序列为val-phe-pro-lys-pro（vfpkp）。

降压肽的制备方法包括分步酶解：在厚壳贻贝粉末中加入蒸馏水，搅拌，加入木瓜蛋白酶酶解，酶解结束后离心取上清液，在上清液中加入胰蛋白酶酶解，酶解结束后离心取上清液，浓缩，加入80~98%的乙醇醇沉，离心取上清液，将上清液浓缩干燥得到降压肽粗品；将得到的降压肽粗品进行sephadexg-15凝胶色谱柱层析纯化后再进行高效液相色谱分离纯化得到降压肽纯品。得到的降压肽c端氨基酸为脯氨酸；n端为具支链的疏水氨基酸，具有较好的抑制ace活性作用。

厚壳贻贝粉末与蒸馏水的质量体积比为1g：15~25ml；搅拌过程中温度条件为50~70℃恒温，搅拌时间为1.5~2.5h；酶解结束后均采用沸水浴灭酶。

木瓜蛋白酶的加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.3~0.5倍，酶解ph为6.5~7.5，酶解时间为1.0~3.0h；胰蛋白酶加入量为厚壳贻贝粉末质量的0.07~015倍，酶解ph为9.5~10.5，酶解时间为2.0~4.0h；胰蛋白酶酶解结束后溶液ph调至中性，酶解液浓缩至原体积的1/25~1/15。

sephadexg-15凝胶色谱柱层析纯化操作为：用蒸馏水将sephadexg-15凝胶溶胀后装柱，检查柱均匀性后上样，用自动取样器收集洗脱液，在280nm下测紫外吸光度，做曲线；重复上样，根据吸光度曲线收集分离的溶液；上样溶液由质量体积比为1g：3~7ml的降压肽粗品和蒸馏水混合而成。

高效液相色谱分离纯化条件为：色谱柱：反相c18键合硅胶柱；流动相：0~4min，水；4~16min，60~80%水，20~40%乙腈；16~35min，乙腈；流速：0.7~1.3ml/min，柱温25~35℃，检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到降压肽纯品。

实施例2：

降压肽的最优选制备方法，包括以下步骤：

1）分步酶解：取25g厚壳贻贝粉末，加入500ml蒸馏水，在60℃水浴下磁力搅拌2h；调节ph至7，加入10g木瓜蛋白酶，酶解3h；在100℃的水浴中加热15min灭酶，在3500r/min下离心20min，去沉淀；调节ph至10，在60℃的恒温水浴中加热，加入2.5g胰蛋白酶，酶解3h；调节ph至中性后，100℃的水浴下加热灭酶15min；静置后3500r/min下离心35min，离心后取上清液，浓缩至原体积的1/20，用95％的乙醇进行醇沉，离心，，醇沉上清液浓缩后干燥即为降压肽粗品；

2）sephadexg-15凝胶色谱柱层析：取sephadexg-15凝胶，加适量蒸馏水，在60℃下水浴加热6h，室温密闭放置24h；用抽气泵对凝胶脱气1h；取足量的蒸馏水，放入超声中脱气15min；装柱;取18g多肽溶于100ml蒸馏水中，上样，用自动取样器收集3min/支，收集100支；在280nm下测紫外吸光度，重复上样，根据吸光度曲线收集分离的溶液。根据制备得到的凝胶纯化图图1所示，需要收集的是组分2溶液；

3）高效液相色谱纯化：色谱条件如下：色谱柱为反相c18键合硅胶柱(zorbaxc18,250mm×4.6mm,5μm)；流动相：0~4min，水；4~16min，60~80%水，20~40%乙腈；16~35min，乙腈；流速：0.7~1.3ml/min；流速：1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为254nm和280nm，得到液相纯化图图2，收集主要吸收峰溶液冻干得到降压肽纯品。图2中明显的吸收峰只有降压肽的吸收峰，由此可见得到的降压肽纯度很高。

实施例3：

将实施例2得到的降压肽纯品进行ace活性抑制测定：37℃、ph8.3条件下，ace催化水解血管紧张素ⅱ(angⅱ)模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(hhl)产生马尿酸(hip)，它在紫外228nm处具有特征吸收峰，通过生成物hip的变化计算ace抑制率。具体操作如下：用1.5ml离心管，空白对照组加入100μl5mmol/lhhl，用硼酸缓冲液(ph8.3)补足至120μl，37℃恒温水浴保温5min，加入5μl0.1u/mlace启动反应；样品组加入100μl5mmol/lhhl和20μl水解液后，37℃恒温水浴保温5min，加入5μl0.1u/mlace启动反应。之后两组均37℃恒温保持30min后，加入1mol/lhcl200μl中止反应，补加175μl硼酸缓冲液。用高效液相色谱法测定hip含量。对应的峰面积分别为s对照和s样品，公式为：

ace抑制率(%)=(s对照－s样品)/s对照×100

结论：实施例2分离得到的是一个新的生物活性肽，具有较好的ace抑制活性，其ic50为142.0±3.5mg/l。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。