本发明属于生物工程下游后处理领域，具体地，涉及一种制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称pha)是微生物在其他营养限制而碳源过剩条件下合成的一种储藏性颗粒物，是一种生物高分子聚酯化合物。pha具有普通热塑性塑料的特性，但有别于传统的石油化工塑料，pha具备良好的生物相容性、可降解性、压电性和光学活性，使其在工业、农业、医药卫生、食品等领域有着广阔的应用前景，在可降解农用地膜领域和可降解塑料用品和医学领域，pha作为目前最好的生物可降解材料已经显现出巨大的潜力。
传统的pha生产是以罗氏真氧杆菌(r.eutropha)、基因改造的大肠杆菌(e.coli)为生产菌种发酵而成，生产存在染菌几率高、能耗高、底物转化率不高、下游处理成本高等缺点，导致成本长期居高不下，严重阻碍了pha的大规模应用。
以嗜盐菌为底盘菌开发的pha生产技术克服了传统pha生产中存在的多个问题，首先嗜盐菌生长在高盐高碱环境下，而这种生长条件可以抑制绝大部分微生物的生长，反应在生产上就是无灭菌开放式发酵，不仅不会染菌，而且无需灭菌，大大降低了能耗和管理成本。其次，通过合成生物学技术开发的工程菌可以低成本碳源高效合成聚3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(phbv)、聚3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(p3hb4hb)等多种性能优异的pha产品，进一步加快了商业化应用速度。
pha作为细菌内含物，胞内成分相当复杂，提取难度相当大，在pha发展的漫长历程中，研究者们对提取做了大量的研究。已有的提取工艺包括有机溶剂抽提法、机械破碎法、次氯酸钠-表面活性剂法、酶法等。有机溶剂法的缺点是溶剂回收困难，生产环境危险，只适合实验室提取；机械破碎法主要包括超声波破壁或者高压匀浆破壁，能耗大，放大难度大；次氯酸钠-表面活性剂法的缺点是次氯酸钠刺激性强，工作环境差，对pha分子量破坏严重，且含有表面活性剂的废水处理难度大；酶法的缺点是要用到多种昂贵的酶类，成本很高。
因此开发一种反应条件温和、对设备无特殊要求、原料廉价、适合工业化放大的方法，可以大大降低生产成本，加快pha的商业化应用。公开号cn02112208的发明专利公开了一种可有效降低pha分离提取成本的方法，该方法先用物理法对细菌进行破壁，然后用碱液调ph至碱性，在碱性的预处理液中，加入阴离子表面活性剂和凝聚剂，分离提取处理液中的沉淀，然后洗涤干燥，得到成品。该方法反应条件温和，设备简单，但是采用物理法进行破壁，能耗较高，且要加入大量的表面活性剂，废水处理复杂，而且要用大量清水洗涤，污水排放量大。
公开号cn98100266的发明专利公开了一种从细菌菌体内分离提取pha的方法，包括如下步骤：1)用含有表面活性剂的碱性溶液处理菌体；2)固液分离，分离出去大部分非pha成分；3)用碱性蛋白酶处理pha；4)分离提取pha颗粒；5)干燥得到pha产品。该方法反应条件温和，成本较低，但是耗碱量大，表面活性剂添加量大，而且需要加碱性蛋白酶，额外地增加了成本，且只是实验室工艺，未考虑工业化放大。
嗜盐菌生产pha的一大优点是提取工艺简便，发酵液脱盐后，可以利用内外渗透压不同加水稀释破壁，也可以在高温下加少量碱液和表面活性剂实现快速破壁，加快反应速率，提高产品纯度。
技术实现要素：
本发明人在前人工作的基础上，结合嗜盐菌(例如，盐单胞菌)的自身特性，开发了一种高效、低成本、高纯度的pha提取工艺，该提取工艺适合多种pha产品，比如phb、phbv、p3hb4hb等。本发明在实验室7.5l发酵水平和中试的1m3发酵罐和5m3发酵水平都进行了大量实验，有很强的工业化放大价值。
本发明的目的是提供一种制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法，该方法是从嗜盐菌发酵液中高效低成本的提取pha的工艺方法，该方法工艺温和，成本低廉，对设备要求低，可实现大规模工业化生产。
因此，本发明了提供了一种制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备嗜盐菌发酵液并通过固液分离得到浓缩菌液；
(2)对步骤(1)得到的浓缩菌液进行洗涤；
(3)对步骤(2)得到的洗涤后的菌液进行细胞壁破壁裂解以得到破壁液；
(4)去除步骤(3)得到的破壁液中的非pha物质，收集pha；
(5)纯化pha；
(6)干燥pha。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，所述pha可为各种pha产品，例如，聚羟基丁酸(phb)、聚3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(phbv)、聚3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(p3hb4hb)等。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(1)中所述的嗜盐菌可以是诸如嗜盐古菌(halobacteriaceae)、盐单胞菌(halomonadaceae)等的嗜盐菌。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(1)中，所述固液分离可以采用离心法或者过滤法，或者絮凝法，优选的是离心法。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(2)中，浓缩菌液的洗涤方法可为向固液分离后的浓缩菌液加水充分搅拌洗涤，离心去除杂质，其中，加水量可为浓缩菌液的1-10倍。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(3)中，菌体细胞壁破壁裂解方法可包括以下步骤：
a.洗涤浓缩后的盐单胞菌菌液复水创造低渗环境；
b.调节菌液温度至最适破壁温度；
c.调节菌液的ph至最适ph；
d.加入阴离子表面活性剂。
优选地，上述步骤a中，洗涤浓缩后的盐单胞菌菌液复水后的体积为浓缩菌液体积的1-10倍。
优选地，上述步骤b中，菌液破壁所需温度可为30℃-120℃，优选为40℃-100℃，更优选为60℃-90℃。
优选地，上述步骤c中，菌液破壁所需的最适ph可为8.5-13.0，优选为9.0-12.0，更优选为9.5-11.5。
优选地，上述步骤d中，菌液破壁所需的阴离子表面活性剂可为十二烷基磺酸钠，简称sds。
优选地，上述步骤d中，菌液破壁所需的阴离子表面活性剂(例如，sds)添加量可为破壁菌液体积的0％-5％(w/v)，优选为0.2％-1.0％(w/v)。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(3)中，菌液破壁所需时间可为0.5h-2h，优选为0.5h-1.5h。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(3)中，菌液破壁过程中可以使用较高的转速(优选2000rpm-20000rpm)离心，以促进细胞壁的裂解。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(4)中，所述的分离pha和非pha物质的方法可为离心法、过滤法或絮凝法，优选为离心法。所述的非pha物质包括但不仅限于，细胞碎片、蛋白质、核酸、nacl、sds等杂质。优选地，所述的离心法采用的离心机可以是低速离心机或高速离心机，优选为高速离心机，离心机的分离因素为2000-20000，优选为4000-20000，优选为5000-20000。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(5)中，所述的pha的纯化方法可为：向除去非pha物质的pha浓缩液加入水，充分搅拌洗涤，然后离心去除洗涤液，重复此过程2-3次，即可完成pha的纯化。上述的pha纯化方法中，pha浓缩物加水洗涤过程中，加水量可为浓缩物体积的1-10倍，优选为1-5倍。
本发明的制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法中，优选地，步骤(6)中，所述的pha干燥方法可以为常温通风干燥、加热通风干燥、真空冷冻干燥、喷雾干燥，与上游的固液分离效果有关。
本发明的pha提取工艺对菌体的pha含量要求不高，且由于嗜盐菌自身独特的可在低渗环境下自行破壁的生理特性，菌体的破壁条件与传统的破壁条件相比，破壁ph更低，表面活性剂的添加量更低，甚至在有些用途下，可以不加表面活性剂，降低了废水处理难度。
本发明提供的从盐单胞菌halomonastd菌株发酵液中提取pha的方法完成了从实验室7.5l发酵罐到1m3发酵罐中试试验再到5m3示范生产线的一系列实验，实用性、科学性、工业化放大价值得到了充分的验证。
本发明与已有的提纯工艺相比，具有以下优点：
(1)该工艺是国际上首次针对嗜盐菌生产聚羟基脂肪酸酯开发的工业化提取工艺，是蓝水生物技术的核心技术，具有重要的市场价值；
(2)该工艺全过程不使用任何有机溶剂，生产环境简单安全；
(3)提取设备简单，在现有的发酵工厂基础上稍加改造即可投入生产；提取所需原料价格低廉，来源广泛。
具体实施方式
实施例1：实验室条件下从盐单胞菌菌发酵液中提取pha
一、盐单胞菌halomonastd01[保藏编号：cgmccno.4353，已在专利申请(专利公告号：cn102120973b)中授权]以葡萄糖为碳源发酵生产phb，发酵48h，生物量为83g/l，phb含量80％。
发酵培养基：
氯化钠40g/l，葡萄糖30g/l，玉米浆粉10g/l，尿素2g/l，硫酸镁0.2g/l，磷酸二氢钾4.2g/l，微量元素母液i10ml/l，微量元素母液ii1ml/l。
1l微量元素母液i：将5g柠檬酸铁铵和2g二水合氯化钙与0.5mol/l盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/l盐酸水溶液补足至1升。
1l微量元素母液ii：将七水硫酸锌100mg，四水氯化锰30mg，硼酸300mg，六水氯化钴200mg/l，五水硫酸铜10mg，六水氯化镍20mg，钼酸钠30mg与0.5mol/l盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/l盐酸水溶液补足至1升。
发酵培养条件：
按10％的接种量将二级种子液接入到上述优化后的发酵培养基中，7.5l发酵罐初始装液3l，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，初始溶氧控制在30％-50％，通过调节转速和通气来控制溶氧，最大转速800rpm，最大通风量1.5vvm，转速和通气达到最大后，不控制溶氧；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/l之间；用5mnaoh控制发酵ph为8.5。
提取方法：
1、菌体的离心和洗涤
取盐单胞菌halomonastd01发酵液300ml，配平后对称置于高速离心机中，离心条件为：转速6000rpm，时间20min。离心结束后，小心移去上清液，然后加水恢复体积，搅拌均匀后继续离心，离心条件为：5000rpm，时间10min。离心结束后，弃掉上清，菌体恢复体积至300ml，搅拌均匀后，洗涤后的菌液倒入到500ml烧杯中，准备破壁。
2、菌液的细胞壁破壁
将装有300ml盐单胞菌halomonastd01菌液的500ml烧杯置于60℃带磁力搅拌水浴中，待菌液温度升至60℃后，用5mnaoh调节菌液ph为10.0，加入2g十二烷基磺酸钠(sds)，反应60min。
3、phb的纯化
破壁反应结束后，离心去除非pha杂质，离心条件为：4500rpm，10min。离心结束后，小心移去上清液，加水恢复体积，搅拌均匀后，继续离心，洗涤离心操作重复2次。洗涤离心后的pha与离心管粘着紧密，可完全弃掉上清液，pha固形物不会损失。
4、phb的干燥
将装有phb沉淀物的离心管置于-80℃超低温冰箱中冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干后phb磨碎后混合均匀，测定phb质量、含量、分子量。最后所得产品纯度98％，分子量5×105da，回收率90％。
二、盐单胞菌halomonastd40(该菌种已在以下非专利文献中公开：chen,x.,yin,j.,ye,j.,zhang,h.,che,x.,ma,y.,li,m.,wu,l-p.,chen,g-q.,engineeringhalomonasbluephagenesistd01fornon-sterileproductionofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),bioresourcetechnology(2017)，并由北京蓝晶微生物科技有限公司提供)以葡萄糖和γ-丁内酯为碳源发酵生产p3hb4hb，发酵48h，生物量为77g/l，p3hb4hb含量70％。
发酵培养基：
氯化钠60g/l，葡萄糖20g/l，玉米浆粉15g/l，尿素2g/l，硫酸镁0.2g/l、磷酸二氢钾5g/l，微量元素母液i10ml/l，微量元素母液ii2ml/l。
1l微量元素母液i：将5g柠檬酸铁铵和2g二水合氯化钙与0.5mol/l盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/l盐酸水溶液补足至1升。
1l微量元素母液ii：将七水硫酸锌100mg，四水氯化锰30mg，硼酸300mg，六水氯化钴200mg/l，五水硫酸铜10mg，六水氯化镍20mg，钼酸钠30mg与0.5mol/l盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/l盐酸水溶液补足至1升。
发酵培养条件：
按10％的接种量将二级种子液接入到上述优化后的发酵培养基中，7.5l发酵罐初始装液3l，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，初始溶氧控制在30％-50％，通过调节转速和通气来控制溶氧，最大转速800rpm，最大通风量1vvm，转速和通气达到最大后，不控制溶氧；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/l之间，发酵过程中补加γ-丁内酯以促进4hb的积累；用5mnaoh控制发酵ph为8.5。
提取方法：
1、菌体的离心和洗涤
取盐单胞菌halomonastd40发酵液300ml，配平后对称置于高速离心机中，离心条件为：转速6000rpm，时间20min。离心结束后，小心移去上清液，然后加水恢复体积，搅拌均匀后继续离心，离心条件为：5000rpm，时间10min。离心结束后，弃掉上清，菌体恢复体积至300ml，搅拌均匀后，洗涤后的菌液倒入到500ml烧杯中，准备破壁。
2、盐单胞菌halomonastd40洗涤后菌液的细胞壁破壁
将装有300ml盐单胞菌halomonastd40菌液的500ml烧杯置于90℃带磁力搅拌水浴中，待菌液温度升至90℃后，用5mnaoh调节菌液ph为10.5，加入1.5g十二烷基磺酸钠(sds)，反应90min。
3、p3hb4hb的纯化
破壁反应结束后，离心去除非pha杂质，离心条件为：4500rpm，10min。离心结束后，小心移去上清液，加水恢复体积，搅拌均匀后，继续离心，洗涤离心操作重复2次。洗涤离心后的pha与离心管粘着紧密，可完全弃掉上清液，pha固形物不会损失。
4、p3hb4hb的干燥
将装有p3hb4hb沉淀物的离心管置于-80℃超低温冰箱中冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干后phb磨碎后混合均匀，测定phb质量、含量、分子量。最后测得产品纯度95％，分子量6.0×105da，回收率90％。
实施例2：中试条件下从盐单胞菌发酵液中提取pha
发酵方法：以盐单胞菌halomonastd40为发酵菌株，以葡萄糖和γ-丁内酯为碳源发酵生产p3hb4hb，1m3发酵罐发酵体系为700l，发酵时间36h，生物量89g/l，p3hb4hb含量65％。
发酵培养基：
氯化钠30g/l，葡萄糖30g/l，玉米浆液50ml/l，尿素2g/l，硫酸镁0.8g/l，磷酸二氢钾4g/l，微量元素母液i10ml/l，微量元素母液ii10ml/l。
微量元素母液i和ii配制方法与实施例1中7.5l发酵体系相同。
发酵培养条件：
按10％的接种量将二级种子液接入到上述优化后的发酵培养基中，1000l发酵罐初始装液600l，发酵体系不灭菌直接发酵。温度37℃，通气量1vvm，罐压0.05mpa，初始转速100rpm，溶氧低于30％后手动调节转速，最大转速280rpm；转速和通气达到最大，不控制溶氧。发酵过程中通过间歇补料的方式控制葡萄糖浓度为5-20g/l之间；发酵过程中通过补加γ-丁内酯积累4hb；5mnaoh自动调节ph为8.5。
提取方法：
1、菌体的离心
700升盐单胞菌halomonastd40发酵液用碟片式高速离心机离心，离心机转速6000rpm，分离因素8000，离心机额定处理量500l/h。
2、菌体的洗涤离心
离心后的菌体浓缩液泵入到洗涤罐中，加水至700升刻度线，搅拌转速150rpm，充分摇匀，然后用碟片式离心机离心，离心条件同上。
3、盐单胞菌halomonastd40菌体细胞壁破壁
洗涤离心后的菌体浓缩液泵入到破壁罐中，加水恢复体积至700l，搅拌转速150rpm，充分搅匀，调节菌液温度为80℃，温度升至80℃后，用8mnaoh调节ph至10.5，加5kgsds，计时2h，破壁结束后，调节破壁液温度为30℃，温度降至40℃以下后，用盐酸调ph至8.0以下。
4、破壁液的固液分离
破壁液采用离心法进行固液分离，所用离心机为碟片式离心机，离心机处理量为500l/h。
5、pha的洗涤纯化
pha的洗涤离心方法与菌体的洗涤离心大致相同，每一级离心的浓缩液打入到洗涤罐中，加水恢复体积，充分搅拌均匀，继续离心，洗涤离心2次的pha浓缩液，用管式离心机继续离心，管式离心机转速20000rpm，分离因素15000，pha浓缩液经管式离心机离心后呈固形物状态，与实验室试验效果相似。
6、pha的干燥
管式离心后产生的pha块状物，经充分破碎后，置于70℃烘箱中通风干燥，完全干燥后测定pha产量、纯度和分子量。最终所得产品纯度90％，分子量5.5×105da，回收率85％。
实施例3：工业化条件下从盐单胞菌发酵液中提取pha
发酵方法：以盐单胞菌halomonastd40为发酵菌株，以葡萄糖和γ-丁内酯为碳源发酵生产p3hb4hb，5m3发酵罐发酵体系为4m3，发酵时间36h，生物量99g/l，p3hb4hb含量65％。
发酵培养基：
氯化钠30g/l,葡萄糖30g/l,玉米浆液30ml/l，尿素2g/l，硫酸镁1.2g/l，磷酸二氢钾4g/l，微量元素母液i10ml/l、微量元素母液ii10ml/l。
微量元素母液i和ii配制方法与实施例1中7.5l发酵体系相同。
发酵培养条件：
按10％的接种量将二级种子液接入到上述优化后的发酵培养基中，5m3发酵罐初始装液3m3，发酵体系不灭菌直接发酵。温度37℃，通气量180m3/h，罐压0.05mpa，初始转速90rpm，溶氧低于30％后手动调节转速，最大转速170rpm；转速和通气达到最大后，不控制溶氧。发酵过程中通过间歇补料的方式控制葡萄糖浓度为5-20g/l之间；发酵过程中通过补加γ-丁内酯积累4hb；8mnaoh自动调节ph为8.5。
提取方法：
1、菌体的离心
4m3盐单胞菌halomonastd40发酵液用碟片式高速离心机离心，离心机转速5500rpm，分离因素8000，离心机额定处理量2m3/h。
2、菌体的洗涤离心
离心后的菌体浓缩液泵入到洗涤罐中，加水至4m3刻度线，搅拌转速80rpm，充分摇匀，然后用碟片式离心机离心，离心条件同上。
3、盐单胞菌halomonastd40菌体细胞壁破壁
洗涤离心后的菌体浓缩液泵入到破壁罐中，加水恢复体积至4m3，搅拌转速80rpm，充分搅匀，调节菌液温度为90℃，温度升至90℃后，用8mnaoh调节ph至10.5，加30kgsds，计时1.5h，破壁结束后，调节破壁液温度为30℃，温度降至40℃以下后，用盐酸调ph至8.0以下。
4、破壁液的固液分离
破壁液采用离心法进行固液分离，所用离心机为碟片式离心机，离心机处理量为2m3/h。
5、pha的洗涤纯化
pha的洗涤离心方法与菌体的洗涤离心大致相同，每一级离心的浓缩液打入到洗涤罐中，加水恢复体积，充分搅拌均匀，继续离心，洗涤离心重复3次。
6、pha的干燥
最后一级离心产生的pha浓缩液体积为800l用喷雾干燥机喷干，喷雾干燥机蒸发量为50kg/h，测定喷干后的pha产量、纯度和分子量。最终所得产品纯度85％，分子量7.0×105da，回收率80％。