本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于扩增t淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法。
背景技术：
t淋巴细胞在机体免疫中发挥不可替代的作用。目前t淋巴细胞相关的生物制品已经广泛应用于包括恶性肿瘤免疫细胞治疗在内的多个领域。因而，优化扩增t淋巴细胞方案能够推动t淋巴细胞制品在临床中的应用。
传统的符合临床应用规范的t淋巴细胞扩增方案主要依赖于满足gmp要求的t淋巴细胞活化珠子(该珠子表面粘附有活化所需的抗cd3活化抗体和抗cd28抗体)和以游离状态提供的白细胞介素2(il-2)的共同作用。该方案在以下两个方面具有改进的需求：一，该珠子价格昂贵且技术为跨国公司垄断，提高了临床推广难度；二，该珠子生物兼容性差，为避免珠子在患者体内积累，需要在t淋巴细胞制品回输患者前去除，增加了额外的操作步骤。
囊泡是一种细胞分泌的具有磷脂双层膜结构的小囊泡。囊泡内部可以包裹蛋白、核酸等物质，可以作为生物活性物质运输或传递的天然载体(且具有较高的生物兼容性)。另外，囊泡表面存在的蛋白或磷脂可以作为运输的“向导”，能够实现囊泡内生物活性物质的靶向特定细胞递送。然而，天然分泌的囊泡因产量低，包裹物质的种类以及数量不受控制，严重制约了囊泡作为药物或者生物活性物质载体的应用。因此，探索利用物理、化学等人工手段获取大量，且能够主动包裹(或负载)特定种类、数量的生物活性物质的囊泡，使其能够满足生物医学研究及应用具有重大意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种用于扩增t淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法，该方法能够满足药品生产质量管理规范(gmp)，且容易实现批量、标准化生产。利用该方法能够以相对较低廉的成本获取数量较多膜性囊泡，且可以通过人为控制囊泡内含物(t淋巴细胞活性物质)的种类和数量进而制备满足不同应用需求的膜性囊泡。本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种用于扩增t淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法，其特征在于，它包含如下步骤：
s1：包装细胞的培养；
s2：包装细胞的灭活；
s3：灭活的包装细胞与t淋巴细胞活化混合物的共孵育；
s4：利用挤压技术(extrusion)制备囊泡悬液；
s5：密度梯度离心法纯化包裹t淋巴细胞活化混合物的囊泡。
优选的，步骤s1所述的包装细胞可以为除t淋巴细胞之外的原代细胞或永生化的细胞株(系)，且不限于未经基因修饰的细胞，培养在37℃、含5％的二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中进行；
优选的，步骤s2所述的细胞灭活方法可以为一定剂量的伽马射线照射(例如20-500gr)，也可以为某些化疗药物的处理(例如15ug/ml的丝裂霉素处理4个小时)；
优选的，步骤s3所述的t淋巴细胞活化混合物包括但不限于：抗cd3活化抗体(克隆号okt3)，抗cd28活化抗体，白细胞介素2，白细胞介素7，白细胞介素15，白细胞介素21等；
优选的，步骤s4所述挤压技术(extrusion)包括利用手动以及自动的挤压装置(例如脂质体挤出仪)，依次通过不同孔径(例如：10um、5um、1um)的微孔滤膜(例如聚碳酸酯滤膜)；
优选的，步骤s5所述的密度梯度离心是以碘克沙醇、蔗糖、氯化铯、氯化铷或溴化铯为密度材料，所述密度梯度为10％、20％、30％、40％、50％或更多不同浓度的所述梯度材料溶液。离心的速度为10000-200000g，离心的时间为1-24小时，离心的温度为0-37摄氏度；
优选的，步骤s5所述获得的囊泡包裹有t淋巴细胞活性混合物，可以用于体内、体外t淋巴细胞的活化和增值。
本发明的有益效果是：本发明提供的膜性囊泡制备方法能够满足药品生产质量管理规范(gmp)，且容易实现批量、标准化生产；利用该方法能够以相对较低廉的成本获取数量较多囊泡；该方法能够通过人为控制囊泡内含物(t淋巴细胞活性物质)的种类和数量进而制备满足不同应用需求的膜性囊泡；同时，通过改变包装细胞的种类，该方法具有改变膜性囊泡靶向性的潜力。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以同时从材料和方法做出若干变形和改进，所有这些改进均应落入本发明的精神和范围之内。
实施例1：
本实施例提供了利用k562细胞制备用于扩增t淋巴细胞的囊泡制备方法，具体步骤包括：
1：将k562细胞置于培养瓶中，培养液采用无血清x-vivo培养基，培养在37℃、含5％的二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中进行，通过调整细胞状态使其处于对数生长期；
2：利用50gr的伽马射线照射处于对数生长期的k562细胞；
3：将2中经灭活后的k562细胞用磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)洗涤两遍，之后用包含有t淋巴细胞活化混合物的pbs缓冲液重悬(30ug/ml的抗cd3抗体(克隆号为okt3)；15ug/ml的抗cd28抗体；2×10^6u/ml的白细胞介素2；1ug/ml的白细胞介素15；1ug/ml的白细胞介素7)，并将灭活的k562细胞密度调整为2×10^7个/ml；
4：将上述细胞悬液置于冰上孵育30分钟，然后依次用10um、5um、1um孔径的聚碳酸酯滤膜，利用脂质体挤出仪制备囊泡悬液；
5：利用非线性密度梯度离心法回收步骤4中获得的囊泡。非线性密度梯度液是通过在超速离心管中从上往下铺10毫升的10％的碘克沙醇以及5毫升的50％的碘克沙醇溶液制得，将s3中的囊泡悬液加入到密度梯度柱的顶端，在离心力为100000g下超速离心2个小时，离心后使用移液器将处于10％和50％碘克沙醇界面的溶液取出。用20毫升pbs缓冲液重悬后，在离心力为100000g下超速离心70分钟，然后弃去上清。重新再用20毫升pbs缓冲液重悬后，在离心力为100000g下超速离心70分钟，然后弃去上清。利用400微升pbs缓冲液重悬沉淀，蛋白定量后分装并保存于负80度冰箱。
实施例2：
本实施例提供了利用自体单核来源的树突状细胞(modc)制备用于扩增t淋巴细胞的囊泡制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：
步骤1中：自体单核来源的树突状细胞需要提前制备，具体步骤包括：s1，征集自愿受试者，抽取50ml外周血，用等量体积生理盐水稀释后，利用ficoll淋巴细胞分离液，通过梯度密度离心法分离外周血单个核细胞(pbmc)，分离得到1×10^8个pbmc；s2，将pbmc用20毫升x-vivo无血清培养基重悬后放入75cm2细胞培养瓶，培养在37℃、含5％的二氧化碳和95％空气的饱和湿度温箱中进行；s3，培养2个小时后，弃去未贴壁的细胞，并用x-vivo无血清培养基将培养瓶冲洗两次，然后添加20毫升树突状细胞诱导培养液(包含如下成分的x-vivo无血清培养基：1，1000u/ml的il-4；2，1000u/ml的gm-csf；3，5％自体血浆)；s4，连续培养4天后，添加20毫升树突状细胞成熟培养液(包含如下成分的x-vivo无血清培养基：1，10ng/ml的il-1β；2，1000u/ml的il-6；3，1ug/ml的pge2；4，80u/ml的tnfα2b；5，500u/ml的tnfα)；s5，继续培养2天后，收细胞，计数，备用。