本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种微卫星遗传标记监测曼氏无针乌贼种质的方法。
背景技术：
曼氏无针乌贼俗称墨鱼、日本无针乌贼，在我国沿海分布较广，曾是我国“四大海产之一”。其不仅肉味鲜美，营养丰富，而且还具有重要的药用价值。我国著名的“墨鱼干”、“螟蛹誊”、“乌鱼穗”、“乌鱼蛋”等产品均主要是曼氏无针乌贼及其性腺的干制品。
20世纪70年代末以来，曼氏无针乌贼产量连续降至最低水平，80年代中后期，浙江沿海渔场曼氏无针乌贼已经无法形成渔汛，并逐步绝迹。修复曼氏无针乌贼资源，逐步恢复我国四大海产工作本世纪初已开展。随着曼氏无针乌贼人工育苗技术的突破，曼氏无针乌贼的人工养殖业已快速发展，但由于养殖生产中亲本数量少，不注重选育种，致使近亲繁殖，导致自然种质资源衰退、乌贼性早熟、成体小等养殖种质性状退化现象出现，任其发展可能影响到曼氏无针乌贼种质延续及其养殖业的正常发展。迫切需要运用现代分子生物学手段开展曼氏无针乌贼的种质检测、资源保护及良种选育等方面的研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种微卫星遗传标记监测曼氏无针乌贼种质的方法，所选用的微卫星序列seqidno:1-19等位基因数目多，多态性高，弥补了当前曼氏无针乌贼种质监测中遗传背景模糊、分子标记数量少的局限，且该方法监测效率高，周期短。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种微卫星遗传标记监测曼氏无针乌贼种质的方法，包括dna的提取，引物的设计，pcr扩增，种质监测。利用分子标记技术可在没有物理标记的情况下实现曼氏无针乌贼的种质监测，且避免了水生环境的干扰，对曼氏无针乌贼资源的保护和合理开发利用具有重要意义。
作为优选，dna的提取过程中，提取曼氏无针乌贼基因组dna，用限制酶mbol将基因组dna在37℃下酶切3h，回收400-1000bpdna片段。该条件下，酶切产物中400-1000bp大小的dna片段浓度高，提高了曼氏无针乌贼的利用率。
作为优选，引物的设计过程中，根据微卫星序列seqidno:1-19两端的侧翼序列设计引物，引物设计条件为：gc含量为40%-60%，退火温度为48-60℃，引物长度为18bp-24bp。所得上下游引物与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。
微卫星序列seqidno:1-19如下所示：
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作为优选，pcr扩增过程中，将5μl10×buffer、4μldntp、2utaq聚合酶、2μl上游引物、2μl下游引物、2μl模板dna混合，加灭菌水至终体积50μl，将混合物在95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，循环完成后再置于72℃延伸10min。该条件下，taq聚合酶活性高，靶序列变性彻底，能够达到有效的扩增量。
作为优选，种质监测过程中，将pcr扩增产物转到聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳分型，经硝酸银染色后进行拍照，并利用软件gel-proanalyzer`4.5获取每条乌贼的基因型数据，利用popgen32软件统计各个微卫星标记基因座的等位基因频率(p)、等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、哈德温伯格平衡phw，计算出多态性信息含量pic。该过程能够科学地评价一个种群中基因的多样性、基因库的丰富程度以及各群体在多个基因位点上的遗传变异程度，使种质监测过程更加准确客观。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所选用的微卫星序列seqidno:1-19等位基因数目多，多态性高，弥补了当前曼氏无针乌贼种质监测中遗传背景模糊、分子标记数量少的局限；种质监测过程能够科学地评价一个种群中基因的多样性、基因库的丰富程度以及各群体在多个基因位点上的遗传变异程度，使种质监测过程更加准确客观。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
一种微卫星遗传标记监测曼氏无针乌贼种质的方法，包括以下步骤：
1)dna的提取：提取曼氏无针乌贼基因组dna，用限制酶mbol将基因组dna在37℃下酶切3h，回收400-1000bpdna片段，用分光光度计测定dna样品的纯度和浓度，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dna片段的大小。该条件下，酶切产物中400-1000bp大小的dna片段浓度高，提高了曼氏无针乌贼的利用率；
2)引物的设计：根据微卫星序列seqidno:1-19两端的侧翼序列设计引物，引物设计条件为：gc含量为40%-60%，退火温度为48-60℃，引物长度为18bp-24bp。所得上下游引物与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低；
3)pcr扩增：将5μl10×buffer、4μldntp、2utaq聚合酶、2μl上游引物、2μl下游引物、2μl模板dna混合，加灭菌水至终体积50μl，将混合物在95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，循环完成后再置于72℃延伸10min。该条件下，taq聚合酶活性高，靶序列变性彻底，能够达到有效的扩增量；
4)种质监测：将pcr扩增产物转到聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳分型，经硝酸银染色后进行拍照，并利用软件gel-proanalyzer`4.5获取每条乌贼的基因型数据，利用popgen32软件统计各个微卫星标记基因座的等位基因频率(p)、等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、哈德温伯格平衡phw，计算出多态性信息含量pic。
实施例2：
微卫星序列seqidno:1-19的筛选方法包括以下步骤：
1)基因组dna的提取：提取曼氏无针乌贼基因组dna，用限制酶mbol将基因组dna在37℃下酶切3h，回收400-1000bpdna片段。该条件下，酶切产物中400-1000bp大小的dna片段浓度高，提高了曼氏无针乌贼的利用率；
2)连接产物的制备：将接头a(5'-gatcgtcgacggtaccgaattct-3',seqidno:20)和接头b(5'-gtcaagaattcggtaccgtcgac-3',seqidno:21)等比例混合，使终浓度为25μmol/l，在95℃保温10min，冷却至室温，接着与酶切回收dna片段在15℃连接，得连接产物。将接头连接于曼氏无针乌贼dna片段，为该dna片段提供了一段已知的序列，极大地方便了连接产物的扩增；
3)连接产物的扩增：以连接产物为模板，以接头b为引物进行pcr扩增，pcr扩增体系为：5μl10×buffer、4μldntp、2utaq聚合酶、2μl接头b、2μl模板dna，加灭菌水至终体积50μl；pcr扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min。该条件下，taq聚合酶活性高，靶序列变性彻底，能够达到有效的扩增量；
4)链霉素磁珠捕捉：取25μlpcr扩增产物与5μl的生物素探针(ca)12（20mmol/l）杂交，杂交溶液为6×ssc＋0.1%sds，总体积为100μl，先在95℃变性5min，然后在65℃杂交60min，加入包被有链霉素的磁珠，混合30min，磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。吸附了dna的磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，避免了离心等手工操作流程，提高了dna纯化过程的自动化程度；
5)洗脱片段的扩增：将磁珠与te缓冲液混合，在95℃水浴5min，待磁力架固定磁珠后，分离磁架，得到含有微卫星dna片段的上清液，以该上清液为模板，以接头b为引物，进行pcr扩增，pcr扩增体系为：5μl10×buffer、4μldntp、2utaq聚合酶、2μl接头b、2μl模板dna，加灭菌水至终体积50μl；pcr扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min。纯化pcr扩增产物，接着与pmd18-t载体连接，转化dh5α感受态细胞，涂布于含有iptg、x-gal和氨苄青霉素的lb平板，37℃培养过夜，以菌液为模板进行pcr扩增，检测，挑取部分克隆送上海英骏生物公司测序，得微卫星序列。将待测序列克隆到载体上测序，所获得的模板量大，纯度高，提高了测序的效率和准确度；
6)微卫星标记的获取：根据测序所得微卫星两端的侧翼序列设计引物，引物设计条件为：gc含量为50%-60%，退火温度为50-60℃，引物长度为18bp-24bp，对引物的5'端用fam修饰，幷以曼氏无针乌贼基因组dna为模板进行pcr扩增反应，pcr扩增体系为：5μl10×buffer、4μldntp、2utaq聚合酶、2μl上游引物、2μl下游引物、2μl模板dna，加灭菌水至终体积50μl，再加入0.1μl，0.1μl；pcr扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min。将各pcr产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上检测各引物多态性，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星标记20个，其核苷酸序列如seqidno.1至seqidno.20所示。通过荧光标记的特异性探针对pcr产物进行标记跟踪，极大地简化了定量检测的过程，且自动化过程重复性好，灵敏度高，特异性强，结果清晰。
实施例3：
一种微卫星遗传标记监测曼氏无针乌贼种质的方法，包括以下步骤：
1)dna的提取：提取曼氏无针乌贼基因组dna，用限制酶mbol将基因组dna在37℃下酶切3h，回收400-1000bpdna片段，用分光光度计测定dna样品的纯度和浓度，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dna片段的大小。该条件下，酶切产物中400-1000bp大小的dna片段浓度高，提高了曼氏无针乌贼的利用率；
2)引物的设计：根据微卫星序列seqidno:1-19两端的侧翼序列设计引物，引物设计条件为：gc含量为40%-60%，退火温度为48-60℃，引物长度为18bp-24bp。所得上下游引物与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低；
3)pcr扩增：将5μl10×buffer、4μldntp、2utaq聚合酶、2μl上游引物、2μl下游引物、2μl模板dna混合，加灭菌水至终体积50μl，再加入0.1μl二苯溴甲烷以及0.1μl3-甲基二苯甲酮，将混合物在95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min，循环完成后再置于72℃延伸10min。该条件下，taq聚合酶活性高，靶序列变性彻底，能够达到有效的扩增量；所加入二苯溴甲烷、3-甲基二苯甲酮与buffer具有协同作用，使taq聚合酶活性区域的位点发生了突变，实现了对酶基因的修饰，提高了taq聚合酶的特异性、表达量和酶活力，大大提升了扩增的效率，缩短了种质监测的周期；
4)种质监测：将pcr扩增产物转到聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳分型，经硝酸银染色后进行拍照，并利用软件gel-proanalyzer`4.5获取每条乌贼的基因型数据，利用popgen32软件统计各个微卫星标记基因座的等位基因频率(p)、等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、哈德温伯格平衡phw，计算出多态性信息含量pic。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110>浙江海洋大学
<120>一种微卫星遗传标记监测曼氏无针乌贼种质的方法
<160>21
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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