本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的引物组合、mlpa探针、基因芯片及试剂盒。
背景技术：
先天性心脏病(congernitalheartdiseases，chd)现已成为广泛发生一种先天性出生缺陷。我国每年约有15-20万先天性心脏病患儿出生，在新生儿中其发病率约为0.7-1.0％，是新生儿非感染性死亡的重要死亡原因之一。先天性心脏病按照有无合并其他畸形大致分为两类，一类为孤立型的先天性心脏病，另一类为综合征型先天性心脏病。综合征型先天性心脏病患儿多呈现出典型的外貌特征，伴或不伴有不同程度智力或生长发育异常及先天性多器官发育畸形等，其常见综合征型先天性心脏病为down氏综合征，holt-oram综合征，努南综合征，digeoge综合征等。
近年来，大量流行病学调查研究显示多种因素包括遗传因素，环境因素及其二者的共同作用参与了先天性心脏病的发生，其中，遗传因素与先天性心脏病发生密切相关，其中染色体微缺失和微重复也是胚胎染色体异常的常见类型。染色体微缺失/微重复是指染色体上出现长度为1.5kb-10mb的缺失或重复。尽管每种微缺失综合征发病率都很低，如较常见的22q11微缺失综合征发生率为1∶4000，但由于临床检测技术的限制，大量的微缺失综合征患者在产前筛查和产前诊断中无法检出，更为重要的是作为胚胎植入前诊断的最主要的样本类型，平衡易位患者的胚胎必须通过分析微重复和微缺失来判定胚胎是否发生异常。因此，如果在试管婴儿技术中能够避免移植有染色体微缺失/微重复的胚胎，将具有很重要的意义。
目前微缺失综合征的诊断技术主要包括高分辨率核型分析、荧光原位杂交、bobs液态基因芯片检测或微阵列比较基因组杂交，其中，高分辨率核型分析方法仅能发现少部分较大片段的微缺失异常，荧光原位杂交方法特异性好，但是只能进行靶向性诊断。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的只能一次检测一个位点的问题，本发明提供一种可以同时快速检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的试剂盒，使用本发明提供的引物、mlpa探针或基因芯片方法简单，成本低廉，临床应用价值高。
为实现本发明的技术目的，本发明一方面提供一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的引物组合，其具有如seqidno.1-66所示的核苷酸序列。
其中，所述引物组合是基于nipa2基因、sh2b1基因、gja5基因、tbx1基因、crkl基因、mapkk1基因、eef2k基因、cdr2基因、mhy11基因和gata4基因设计的多个引物对，其依次具有seqidno.1-66所示的核苷酸序列。
为实现本发明的技术目的，本发明另一方面提供一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的mlpa探针组合，其具有如seqidno.1-66所示的核苷酸序列。
其中，所述每个mlpa探针上具有荧光标记和通用引物。
其中，所述通用引物对依次具有如seqidno.67-68所示的核苷酸序列。
为实现本发明的技术目的，本发明再一方面提供一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的试剂盒，其包括上述的引物组合或上述的mlpa探针组合。
其中，所述试剂盒还包括反应液。
其中，所述反应液包括常规的用于mlpa杂交连接反应的缓冲剂、连接酶、聚合酶以及用于pcr反应的缓冲剂、连接酶、聚合酶或其他相关试剂。
其中，上述试剂可以通过市售获得。
其中，所述mlpa杂交连接反应的反应条件为在95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时。
其中，所述pcr反应的条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
为实现本发明的技术目的，本发明再提供一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的方法，其采用上述引物组合或mlpa探针组合或试剂盒对待测样本进行检测。
其中，所述对待测样本进行检测是指对待测样本的全基因组dna进行检测。
其中，所述待测样本可以是任意一种可以提取出的全基因组dna的样本，包括但不限于血液、羊水细胞、皮肤组织等
其中，所述采用上述引物组合或mlpa探针组合或试剂盒对待测样本进行检测包括：
提取待测样本的dna溶液后，进行变性处理，得到变性后的基因组dna；
利用所述引物组合制成的mlpa探针组合或所述mlpa探针组合或试剂盒中的mlpa探针组合与变形后的基因组dna进行杂交连接反应，获得连接产物；
将得到连接产物进行pcr反应后，对pcr扩增产物进行毛细管电泳，得到毛细管电泳结果；
对毛细管电泳结果进行分析后，判断待测样本是否发生先天性心脏病微缺失。
其中，所述变性处理是将dna溶液在98℃处理5分钟。
其中，所述杂交连接反应的反应液为：
其中，所述杂交连接反应的反应条件为在95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时。
其中，所述pcr反应的反应液为：
其中，所述pcr反应的反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
为实现本发明的技术目的，本发明还提供一种检测先天性心脏病微缺失或/和微重复的基因芯片，包括固相载体及附着在其上的基因探针。
其中，所述基因探针具有如seqidno.1-66所示的核苷酸序列。
其中，所述固相载体为适用于制作基因芯片的任一一种固相载体。
有益效果
本发明方法利用具有seqidno.1-66所示的核苷酸序列的引物组合或mlpa探针或基因芯片或试剂盒可以在一个管中同时检测多个位点的先天性心脏病微缺失或/和微重复，特异性好，反应灵敏，检测时间短，方法简单、从点突变到大染色体缺失/插入都可以进行检测，成本低廉，临床应用价值高。
附图说明
图1是本发明实施例1进行毛细管电泳的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解的是这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1引物、探针及试剂盒
1、引物
依据内参基因gapdh和目的基因notch3的序列信息，设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下检测出待测样本的先天性心脏病微缺失或/和微重复的本发明的seqidno.1-66所示的核苷酸序列的引物序列。
二级结构评估及tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如在本发明的一个实施例中，采用dnafoldingform评估其二级结构，具体是(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/dna-folding-form)；采用mlpa自带软件raw-probe评估其tm值。
2、mlpa探针
根据mlpa原理，将上述引物进行标记，并与通用引物序列结合，形成mlpa探针，其中，本发明的mlpa探针所使用的通用引物的序列如seqidno.67-68所示；所述对上述引物标记采用常规技术，例如荧光标记。
3、基因芯片
本申请的基因芯片是采用常规方法将步骤2获得的探针固定在聚合物基片行，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成本申请的mlpa探针。本申请的基因芯片的使用方法与常规方法相同。
4、试剂盒
该试剂盒包括步骤1中的引物，或步骤2中的mlpa探针。
优选条件是包括步骤2中的mlpa探针。
当试剂盒中包括步骤2中的mlpa探针时，其中还包括杂交连接反应用的反应液和pcr反应用的反应液。
进一步的，杂交连接反应用的反应液为本领域mlpa反应常规使用的缓冲液、连接酶或其他相关试剂；pcr反应液为本领域常规使用的pcr反应常规使用的buffer、dntp、mgcl2、mlpa-f、mlpa-r、hotstarttaq、ddhb2bo。
进一步的，本发明的试剂盒所使用的条件包括杂交连接反应条件和pcr反应条件，其中，杂交连接反应条件为95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时；pcr反应的条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
实施例2正常dna样本的检测
利用实施例1中的试剂盒对人的正常dna进行检测，该dna从人的血液中提取，具体操作如下：
1样本的获取及处理
采集人的外周血，并采用常规的dna提取试剂盒提取样本中的全基因组dna，获得全基因组dna样本，利用thermoscientificnanodrop2000紫外分光光度计测量dna样本浓度，并稀释至20ng/μl，备用；
抽取其中的5μl基因组dna(总量为100ng)于200μlpcr反应管中98℃变性5分钟，得到变性后的全基因组dna。
2反应液的配制
将试剂盒中的每条探针分别稀释至500fmol/ul，配制成probemix；然后配制杂交连接反应液，即
3杂交连接反应
取步骤2配制的杂交反应液5μl，加入步骤1的pcr反应管中，枪头反复吹吸至完全混匀后，在95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时，得到连接产物。
4pcr扩增
配制pcr反应液，并以每管24μl分装于200μlpcr薄壁反应管中，取步骤3得到的连接产物1μl作为pcr反应模板进行pcr扩增，得到扩增产物。
其中，pcr反应液为：
pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
5.数据分析
将得到扩增产物均做3个平行管，并设立有内参基因，进行毛细管电泳实验，得到如图1所示的电泳图，将试验结果采集的荧光数据利用abi3730xl测序仪处理后，得到峰型的面积数据。取每个基因的峰型面积(area)数据的平均值(dq值)，通过相对定量的方式计算是否存在拷贝数变异，即：dq值＝待检样品的待检基因(notch3)峰型面积/待检样品的内参基因(gapdh)峰型面积对照样品的待检基因(notch3)峰型面积/对照样品的内参基因(gapdh)峰型面积
当计算结果为0.80＜dq＜1.20，则判定样本正常，没有发生微缺失(normal)；
当计算结果为dq＝0.00，则判断样本为纯合子缺失(homozygousdeletion)；
当计算结果为0.40＜dq＜0.65，则判断样本为杂合子缺失(heterozygousdeletion)；
当计算结果为1.3＜dq＜1.65，则判断样本为杂合子重复(heterozygousduplication)；
当计算结果为1.75＜dq＜2.15，则判断样本杂合子/纯合子三倍重复(heterozygoustriplication/homozygous)。
根据图1所示的毛细管电泳图可以看出，本发明的包含多个引物的mlpa探针对一个样本进行检测的峰图清晰，无噪音，可见，本发明提供mlpa探针特异性好、灵敏度高，而且多对mlpa探针可以同时对一个样本进行检测，效率高，成本低廉。
应用实施例
采集19份患有先天性心脏病的患者的血液样本，采用常规方法提取其全基因组dna，获得19份待检测的样本。先将19份待检测的样本采用常规的荧光原位杂交方法进行基因检测，得到如表1所示的检测结果，再将19份待检测的样本采用本发明实施例2所述的方法进行检测，获得如表2所示的计算结果。
表1常规方法检测结果
表2本发明方法检测结果
注：图中斜体字体表示微重复，斜体加黑字体表示微缺失。
根据表1和表2所示的检测结果可知，本发明方法所检测的结果与常规方法检测结果相同，均检测出样本f1、h9、a11、g12发生了微缺失，g2既发生了微缺失也发生了微重复，其他样本发生了微重复，而且，根据表2所示的检测结果，还可以根据实施例2步骤5中的判断标准直接判断样本中微重复或微缺失发生的具体基因以及发生类型。
并且，在试验中还发现，采用常规方法进行需要对样本进行多次的不同基因检测才能判定样本是否发生了微重复或/和微缺失，检测时间长达2天以上，而本发明方法一次性就可以检测一个样本是否发生了微重复或微缺失，而且可以判断该样本中发生了微重复或微缺失的具体基因及发生类型，仅需8小时。
可见，本发明方法具有与常规方法同样的检测效果，而且检测效率高，准确率好。