本发明涉及一种基于crispr/cas9体系的同源修复载体构建方法，具体涉及一种用于构建cdna文库构建筛选的质粒载体的方法，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
：：crispr/cas9基因组定向编辑技术是近几年发展起来的对基因组进行定向精确修饰的一种技术。通过将外源的dna导入受体细胞染色体的特定位点上，从而特异地改造基因组，研究基因的功能。该技术可以对基因组中的靶位点进行缺失、敲入、核苷酸修正等操作。2013年，科学家第一次将crispr/cas9应用到人类和小鼠细胞系中对基因进行敲除，随后人们在模式植物和其他农作物中也成功获得了应用，经过改造的crispr/cas9系统也迅速地被应用到拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。相对于转基因技术，crispr/cas9系统具有操作简单、快捷、不需要巨大的资金投入、在遗传编辑之后不留下转基因的痕迹，无须引用外源基因，因而生物安全性高，不具有转基因争议。目前为止，利用crispr/cas9统实现基因组的定向编辑还只能对内源基因的定向敲除，还无法实现定点引入外源基因，对全面研究基因的功能起到一定的限制作用。因此，以现有的crispr/cas9载体为基础，构建一种能实将外源基因定点交换到内源基因位置，真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的crispr/cas9系统，为植物定点转基因改良、新基因定点引入等具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能实将外源基因定点交换到内源基因位置，真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的crispr/cas9系统的方法，载体构建只需通过一步pcr，简单易行，无需对酶切载体与pcr产物纯化回收，组装效率高。为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：一种基于crispr/cas9体系的同源修复载体构建方法，包括如下步骤：(1)靶位点设计sgrna靶位点的选择使用crispr在线设计工具(http://crispr.dbcls.jp/)，以拟南芥as基因为靶基因，选择靠近5'端得分最高的g-n19-ngg23bp序列，其中第一个g是小rna转录的起始信号位点，ngg是cas9基因定位的pam序列，需要插入grna载体的是g-n19共20bp序列，共设计两个打靶位点的target，实现大片段敲除；同时在as基因的打靶载体上装入as基因的同源修复片段，实现as基因在cas9敲除的同时，以载体上的as基因的同源臂做模板进行修复。(2)引物设计所用引物见表1。表1本研究所用引物信息table1primersμsedinthisstμdy注：下划线部分表示同源末端序列，加粗斜体部分为靶位点序列note,μnderlinedisthehomologoμsarmsofphdeandtheboldseqμenceisthetargetlocμs.(3)打靶载体phde-asgrna的构建①pcr扩增目的片段：pcr反应总体积共100μl，平均分装至2个pcr小管；pcr反应条件为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：1.5％琼脂糖凝胶电泳pcr产物，在紫外透照台上切下目的条带，将目的条带装入1.5mlep管，-4℃冷冻20min，15000rpm低温离心20min，吸取上清液于pcr小管中，测定浓度，记录od260/od280，-20℃保存；③phde质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μl，50℃恒温过夜，然后以酶切前的phde质粒作对照，配制0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取一个pcr小管，先后加入0.3μl线性化phde载体、3μl重组酶以及1.2μl回收的as基因片段，采用重组酶技术，将回收纯化后的as基因片段与bsai酶切线性化的载体重组连接，组装条件为50℃恒温反应1h；⑤重组子转化与鉴定：将重组产物利用热击法转化dh5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液pcr鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析，pcr反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s,72℃45s)，72℃2min；⑥重组质粒的提取和鉴定：将阳性克隆过夜培养后用碱裂解法提取质粒，测定浓度，记录od260/od280，以该质粒为模板进行pcr分析，用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳pcr产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒；⑦重组质粒送样测序：将质粒pcr鉴定为阳性的质粒送至生工广州分公司测序验证，测序引物为μ626-idf。(4)同源重组修复模板载体phde-asgrna-as的构建①pcr扩增as基因同源臂片段：pcr反应体系与前述相同，总体积共100μl，混匀后平均分装至2个pcr小管，pcr反应条件为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：将1.5％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，测浓度，记录od260/od280，-20℃保存；③phde-asgrna质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μl，37℃恒温反应15min，用0.5％琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取pcr小管，先后加入0.3μl线性化phde-asgrna载体、3μl重组酶以及1.2μl回收的同源臂片段，组装条件为50℃恒温反应1h；⑤重组子转化与鉴定：将重组产物利用热击法转化dh5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液pcr鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析；pcr反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s,72℃45s)，72℃2min；⑥重组质粒的提取和鉴定：将阳性克隆过夜培养后提取质粒，测定浓度，记录od260/od280，以该质粒为模板进行pcr分析，用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳pcr产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒；⑦重组质粒送样测序：将质粒pcr鉴定为阳性的质粒送样到生工广州分公司测序，测序引物为ecor1-f。本发明的有益效果是：(1)phde-asgrna-as重组质粒是在phde-asgrna重组质粒的基础上，在特定位点装入与as基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂(ecor1位点插入)，作为同源重组修复的模板，达到定点引入回复突变基因的目的。(2)采用同源重组技术，通过pcr扩增目的条带、回收，载体的酶切线性化，组装等过程将基因敲除目标片段与同源重组修复臂片段先后克隆到同一载体上，能实将外源基因定点交换到内源基因位置，真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的crispr/cas9系统的方法，载体构建只需通过一步pcr，简单易行，无需对酶切载体与pcr产物纯化回收，组装效率高。具体实施方式下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。采用粗皮桉无菌苗下胚轴为外植体进行组培再生，具体方法如下：1拟南芥幼苗的培植取50-80粒种子于1.5ml离心管，加入1ml75％的酒精缓慢晃动6min，使种子充分消毒，弃酒精，加入1ml无水乙醇，摇匀后静置5min以上，用1ml移液枪轻轻将种子从离心管吸出打在无菌滤纸上干燥。将干燥后的种子均匀撒在基本培养基中(ms培养基+7g/l琼脂+20g/l蔗糖，ph5.8)，用报纸包好培养基(防止见光)置于冰箱4℃过夜处理，使种子春化，以促进花芽形成和花器发育。整个操作过程需在超净工作台中完成。第二天将低温过夜处理的培养基(去掉报纸)置于光照培养箱中23℃培养7天，幼苗移栽至花盆，继续放置在光照培养箱中23℃培养供后续实验。2靶位点设计sgrna的靶位点是符合(n)20ngg的序列。本文针对拟南芥as1基因设计了两个靶位点。as1序列信息如下，5’端下划线部分为靶位点1，3’端下划线序列为靶位点2。带波浪下划线为pam的序列。5’-gcgggatcactgggttaggaggctgaacttgttgttcagaatgtaaaaaccctccattcgaattagccatcacaaccgttgcagcagcggcagcagcagggacaacgttagaccgctctttgacaagcttctcagcgaaactctcgagaatccgatcgtacttactctcgtcaataggctcaactctcttgttactctctttctcttctctctgttgcttctccttaaacacttcccaccacttccctaaccgctttgccgtcctcccgggaacctcagcagcaatcttcttccacttgttgccgtgtttctcctgaagacggatcacaagcctctgctcttcctctgtcaaagaccctttcttgatccctggcttaagataattcttccatctctctaaacaagacttggcgtcacggttcaaaggtttgttcatacgctcagacacaagatgccattctctcggaccgaactgtctaacgtaagcacgtaacaatgcatcttcttcaccactccaacgttgtctctctttcatctcctactcctcctgacatcacttcttcccatctcaccatccttcttcatc-3’3引物设计本实验表达载体的构建采用同源重组法，因此引物设计上有所不同。sgrna的引物设计时需额外在上下游引物5’端各自加上20bp的与载体酶切后两端同源的序列，作为重组的接头，其他引物正常设计。本文所用引物见表2。表2本文所用的pcr引物序列注：下划线部分表示同源末端序列，加粗斜体部分为靶位点序列。4表达载体phde-asgrna的构建4.1pcr扩增目的基因pcr反应体系(primestarmaxdnapolymerase)见表3。总体积共100μl，混匀后迷你离心机离心(使管壁上液体收集至管底)1秒，用移液枪轻轻吹打后(离心后管底浓度高)平均分装至2个pcr小管。整个操作过程需在冰上操作，迅速完成。pcr反应条件(primestarmaxdnapolymerase)为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温。表3as-grna基因pcr扩增反应体系4.2琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收(1)琼脂糖凝胶配制(3孔梳)称取0.42g琼脂糖溶于28ml1×tae缓冲液，即1.5％琼脂糖凝胶；(2)电泳将pcr产物全部加入一个胶孔，100bpmarker为比对，电压100v，电流50ma，功率50w，时间1h，电泳液为1×tae；(3)凝胶成像系统上拍照记录，然后在紫外透照台上切下目的条带；(4)将目的条带装入1.5mlep管，-4℃冷冻20min，15000rpm低温离心20min，最后吸取上清液于pcr小管中，测定浓度，记录od260/od280，-20℃保存。4.3phde-mch质粒的酶切(线性化)和鉴定酶切体系见表4，总体积20μl，50℃恒温过夜；电泳分析：以酶切前的phde-mch质粒作对照，配制0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。表4phde-mch载体酶切体系4.4目的片段与载体重组取一个pcr小管，先后加入0.3μl线性化phde-mch载体、3μl重组酶以及1.2μl回收的as基因片段。采用重组酶技术，将回收纯化后的as基因片段与bsai酶切线性化的载体重组连接。组装条件为50℃恒温反应1h。4.5重组子转化与鉴定(1)转化：取出1管(100μl)制备好的dh5a感受态细胞，放在冰上融化；将重组产物(约4.5μl)全部加入管中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃热击90秒，勿摇动离心管，快速将离心管转移至冰浴2分钟以上；(2)复苏：加500μl无抗生素的lb液体培养基，150rpm摇菌40-60分钟；(3)培养：5000rpm离心1min，弃上清，剩下约100μl管底菌涂平板(加50mg/l卡那霉素的yep固体培养基)，设置阳性对照(不加卡那霉素的yep固体平板涂布少量菌液)和阴性对照(加50mg/l卡那霉素的yep固体培养基，涂布100μl无菌水)，倒置培养皿，于37℃培养12h，观察菌落；(4)筛选重组子：挑取一个单菌落至1.5ml离心管，加入500μl含50mg/l卡那霉素的yep液体培养基(挑取单菌落数不少于10个)，200rpm、37℃摇菌3-4h；做菌液pcr(体系见表3-4)，pcr反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s,72℃45s)，72℃2min，并以1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。表5菌液pcr体系4.6重组质粒的提取和鉴定准备灭菌的10ml离心管，加入3ml含50mg/l卡那霉素的液体yep培养基，选取阳性克隆各100μl分别加入各管，37℃、200rpm摇床过夜培养。第二天提取质粒，测定浓度，记录od260/od280，以该质粒为模板进行pcr分析，体系见表6。用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳pcr产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒。质粒提取操作步骤：(1)取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，10000rmp离心1min，弃上清，重复收集一次，将管倒置于滤纸上使残余菌液流尽；(2)菌体沉淀重悬浮于200μl溶液ⅰ中(需剧烈振荡，可以用涡旋，使菌体分散混匀，放置2分钟以上)；(3)加入溶液ⅱ300μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡，要轻柔，不要超过2分钟)；(4)加入预冷的溶液ⅲ300μl，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀。15000rmp离心10min；(5)取750μl上清液移入加有750μl异丙醇的eppendorf管，颠倒数次匀,15000rmp离心10min；(6)弃上清，加入1ml75％乙醇，颠倒数次，然后15000rmp离心2min；(7)将管倒置于滤纸尽量使液体流尽，室温干燥30分钟；(8)加入30μl灭菌的ddh2o溶解沉淀，浓度测定，记录od260/od280。表6重组质粒pcr分析反应体系注：总体积10μl，反应条件为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温。4.7重组质粒送样测序将质粒pcr鉴定为阳性的质粒送至生工广州分公司测序验证。测序引物为μ626-idf。5同源重组修复表达载体phde-asgrna-as的构建phde-asgrna-as重组质粒是在phde-asgrna-mch重组质粒的基础上，在特定位点装入与as1基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂(ecor1位点插入)，作为同源重组修复的模板，达到定点引入回复突变基因的目的。5.1pcr扩增同源臂片段pcr反应体系(primestarmaxdnapolymerase)见表7。总体积共100μl，混匀后平均分装至2个pcr小管。整个操作过程需在冰上操作，迅速完成。pcr反应条件(primestarmaxdnapolymerase)为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温。表7同源臂ecor1pcr扩增反应体系5.2琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收(1)琼脂糖凝胶配制(大梳子)称取0.42g琼脂糖溶于28ml1×tae缓冲液，即1.5％琼脂糖凝胶；(2)电泳将pcr产物全部加入一个胶孔，100bpmarker为比对，电压100v，电流50ma，功率50w，时间1h，电泳液为1×tae；(3)凝胶成像系统上拍照记录，然后在紫外透照台上切下目的条带；(4)将目的条带装入1.5mlep管，-4℃冷冻20min，15000rpm低温离心20min，吸取上清液于pcr小管中，测定浓度，记录od260/od280，-20℃保存。5.3phde-asgrna-mch质粒的酶切(线性化)和鉴定酶切体系见表8，总体积20μl，37℃恒温反应15min；电泳分析：以酶切前的phde-asgrna-mch质粒作对照，配制0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析。表8phde-asgrna-mch载体酶切体系5.4目的片段与载体重组取一个pcr小管，先后加入0.3μl线性化phde-asgrna-mch载体、3μl重组酶以及1.2μl回收的同源臂片段。组装条件为50℃恒温反应1h。5.5重组子转化与鉴定将同源臂片段与线性化的phde-asgrna-mch载体的重组产物利用热击法转化dh5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液pcr鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析。pcr反应体系见表9，pcr反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s,72℃45s)，72℃2min。表9菌液pcr体系5.6重组质粒的提取和鉴定准备灭菌的10ml离心管若干支，每管加入3ml含50mg/l卡那霉素的液体yep培养基，选取阳性克隆各100μl分别加入各管，37℃、200rpm摇床过夜培养。第二天提取质粒(操作见3.3.6质粒提取)，测定浓度，记录od260/od280，以该质粒为模板进行pcr分析，体系见表10。用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳pcr产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒。表10重组质粒pcr分析反应体系注：总体积10μl，反应条件为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃。5.7重组质粒送样测序将质粒pcr鉴定为阳性的质粒送样到生工广州分公司测序，测序引物为ecor1-f。序列表<110>广东石油化工学院<120>一种基于crispr/cas9体系的同源修复载体构建方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2400<212>dna<213>未知(unknown)<400>1ttctgtcttctacttgaatttacacatgtaaagatataaatcgattttatttataaacca60aagtgttgcagctgactaaatcaacatcaagcttgagaaaacaaagccatggataaactg120aagtgataaatggaacacaaaggtaaaagaaacaaatacaaagctgaggtaaggaaccca180aaagtctaagtaaacattggagacacccaaatgatcaaagacaaaaaaaaacaaaaaaaa240acaaaaaaaaaaccttacattacattacaagttacaacaaagagtttaggagacggtggg300gcggtctaatctgcaacccatttgttgttcaagaaacttggtgagtctgatatgcctaga360ggtccattgatcagccagtttctggtctttggcctctgcgtctcgcctcaaaccaacgag420ctgttctctgtactctccttcgatcttctccattgcgttcttctgctcttccctaagagc480tttcatctttgcctcaatctcctccatcttctccctttgtctacacgtcttctctgactc540tagctgcagctccagccttcttagcctccatgcagcctctttcttatggtctgcccaagc600tcggtgcccttcctccaactctctacaacactccacaagctctgacaagaacacactctc660gctactcccactacaagacggcatcatactccctaacacaagtccccctggaccgttctc720tgctctctcaggctgttgctgctgcagccacgggattggcggttgaggcgcagctgcagc780cactgtggaaggcgataatgtcaaagttaccgagggaggccttgcaacaacattgttccc840attgttagaagtagctaaccaaggcgggatcactgggttaggaggctgaacttgttgttc900agaatgtaaaaaccctccattcgaattagccatcacaaccgttgcagcagcggcagcagc960agggacaacgttagaccgctctttgacaagcttctcagcgaaactctcgagaatccgatc1020gtacttactctcgtcaataggctcaactctcttgttactctctttctcttctctctgttg1080cttctccttaaacacttcccaccacttccctaaccgctttgccgtcctcccgggaacctc1140agcagcaatcttcttccacttgttgccgtgtttctcctgaagacggatcacaagcctctg1200ctcttcctctgtcaaagaccctttcttgatccctggcttaagataattcttccatctctc1260taaacaagacttggcgtcacggttcaaaggtttgttcatacgctcagacacaagatgcca1320ttctctcggaccgaactgtctaacgtaagcacgtaacaatgcatcttcttcaccactcca1380acgttgtctctctttcatctcctactcctcctgacatcacttcttcccatctcaccatcc1440ttcttcatctgtaccaaattcaaaatcaacccgtttcataaatctctccaattcaaaact1500ctaaaagatcgaaacaaatctacaagatctgtcgaattttcgaattagaaattacaaagt1560ctgaaaaatttccgtttcaagaaatgaaaatgacaaaaactttgacaatgtttgaagcaa1620aacttggaataatttgttattatcacactatacaacctatattctggaaaccaaacaggg1680gaaattaatgctgaccccaaaacactattaagcaaagacttattaagaagataagagagt1740taaaattattactataaaacaaaataaaaatgcttaccaaatgatattgaaaagataaat1800aatcccaaactcaagagcaacttccatcacacagatttgctctctctctcactttttttt1860ttttatatagttggagaaaatggaagagagaaaacgaaaagaccaaagtgagagaggctt1920ttaaaaccagacgacgtacacgattagaccacagagacggcataattaaaataaaatctt1980taaaaaaaaaaagagagaaaaagtttaccgactgagacacagacgttttcccctttttac2040atcacaagtggggaaaaaaaaaactctgacagaggcgcgtggaggtgaaaagttgaaatt2100ccataagttcgttgtttgtcattgacaatattaaacctttttttatatatatttactaca2160ttgggatctcaaaattcatttttctataacattatgagaaataaaatgacaatctaatgt2220aggggatgctttaaatttaaatgaaaaagtgttgtactttagtggctgaaaagtcattta2280cttgtcaaaatgatagaagaaaaactaaccattcaagaaaataatgctccatttataaac2340aactccttcactcaaacaatagaattttatgtccaatttgagtaacattaatttccactt2400<210>2<211>60<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ctagagtcg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