本发明涉及神经肽
技术领域：
：，本发明具体是一种虎斑乌贼神经肽fmrfamide及其用途。
背景技术：
：：头足类（cephalopoda）属于软体动物门头足纲，广泛分布在各个海域，在生物的系统演化的过程中占有重要地位。其肉质鲜美可口，肌肉含有相当丰富的营养物质，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是还具有重要的研究价值，其墨囊可以促进血液凝固且还含有抗菌成分，海螵蛸可以用作医学药材，耳石可以用来分析物种存在的年轮和海洋环境随时间和空间的变化特点。另外头足类还是海洋生态系统中重要的生物因子，在生态系统食物链中作为捕食者和被捕食者，对维持海洋生态系统的稳定具有重要的作用。神经肽是广泛存在于动物体内的小分子多肽，由神经组织分泌，具有调节神经活动、机体生长、发育等各种生理功能，神经肽同时还能充当生长因子、营养因子等信息分子。神经肽是一类比较古老的信息分子，真菌乃至细菌体内都存在神经肽。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种虎斑乌贼神经肽fmrfamide，运用分子生物学技术手段探测神经肽fmrfamide对虎斑乌贼生殖行为影响的机制，以及对整个乌贼生殖调控机理。验证fmrfamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性。本发明的目的之二在于提供一种虎斑乌贼神经肽fmrfamide的用途，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：虎斑乌贼神经肽fmrfamide，其特征在于cdna序列全长约1856bp，开放阅读框996bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kda，等电点9.09。神经肽fmrfamide作用机理的探测方法包括神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析、神经肽fmrfamide组织特异性表达分析和神经肽fmrfamide脑组织表达定位分析。神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析步骤包括：提取成熟虎斑乌贼脑组织总rna，使用反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总rna进行cdna第一条链合成，将合成的cdna置于-30~-15℃保存备用；根据ncbi数据库中获得已报道的软体动物物种fmrfamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼fmrfamide基因核心序列片段的简并引物：fmrf-f：gctgaagatgaactggaagag；fmrf-r：caaawaactgaatgwcgcagg；fmrf-5'outer：gatgtctctagcttgcttcc；fmrf-5'inner：gatggagccgcacacacagac；fmrf-3'outer：gaaaccctgaggaccaagaagctgacaa；fmrf-3'inner：ggcggtgaagacgatgacgtgaact；m13-f：tgtaaaacgacggccagt；m13-r：caggaaacagctatgacc；5’raceadapter：ggccaggcgtcgactagtacgggggggggg；5’raceouterprimer：acuacuacuaggggcgtcgacgta；5’raceinnerprimer：acuacuacuaggggcgtcga；3’raceadapter：gcgagcacagaattaatatttttttttttt；3’raceouterprimer：gcggatccgaattaatacgact；3’raceinnerprimer：gcgagcacagaattaatacgact。神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析步骤包括：以虎斑乌贼脑组织cdna作为模板，简并引物fmrfamide-f和fmrfamide-r进行fmrfamide基因核心片段的pcr扩增；pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min；电泳检查产物，用qiagen公司的dna凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pmd18-t载体相连接，转化至e.coli5α感受态细胞中，进行pcr检测后，将阳性克隆产物进行测序。神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析步骤包括：利用目的基因已知序列设计分别用于fmrfamide基因3’端race和5’端race扩增的特异性引物3’fmrfamide-outter、3’-fmrfamide-inner和5’-fmrfamide-outter、5’-fmrfamide-inner。其中，fmrfamide基因cdna全长为：agaacaaggagaagatcccacgttccaatcaacgcaaaggcgaagagcacacagctaaaagcaacaacaacaaacaatcattcccccataaataaaaaaaggctgattcattggactgaagagaaaacaacgcacgttggtgccttgttgttttcctcttgctcgtagttctcagcgtgtaccttcgtatctttttgtctgtgtgtgcggctccatcaccgtaccccgtctttgctagtgtcccctacctctgtagtcggacctaagtcatcttgttcctgtaggagcgcccatttacccttggcagatttagaaagaataacgggaccccgtgatgcgttgttggagtccctgtagcctacttgtcgtcatcgccatctactgtctctcttcgcatacgtctgaagcctttgatttggcccaggcatgcgtcgagtctcagcgaatgagtcttcttccgatttgtgatacaatctttgctgtacagcaagaaggagctcagcaaagtgcggatgatggactgagaagcaaacgtttcatacgctttggaagagccctgtcaggagatgctttcttgcgttttgggaaaaatgtaccagaccttcctttcgaagataaaagattccttcgatttggacgagcagctcctcagttggatgacttgctcaaacaagccctgcagagagttgaaagcttgcaaaaggccgacgacaccagtgttcgacgaaagcgatccacagacgccgctcccccaaagcaaacagatagtgctgaacagaaaaacgatagcgcaaaaatcacaaaaagatacgtcgatgacgtcgaagattctgatgtgaagagattcatgcgcttcggtaagagatttatgcgttttggccgtaacccgagcgatgttggcaacaaactgaacgaaaagcgattcatgagatttggacgtgatcccgaaaaaaggttcatgcgttttggcaaatcagatgacaagaggttcatgagattcggtcgaaaccccggcgatgctgaagatgaactggaagaggataaacgttttatgagattcggacgtggagacgaagaggatgaggaagaagccgaaaaacgatttatgagatttggacgtgaccctgaaaagaaattcatgagatttgggaagaacggcgaagaaaagaggttcatgcgctttggtcgaaaccctgaggaccaagaagctgacaagagatttatgagatttggacgcggcggtgaagacgatgacgtgaactcagaggaaaaacgttttatgagatttggtcgatctgcagaaaaatgcaaaggatgtctggaaggttaatggctgatgtctctagcttgcttccttctttggctgaacagagacaaaaagaaatacaaaataaaagcttctgattaaatactttacattttacaaaaatgtaattcagt。神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析步骤包括：使用lasergene软件对fmrfamide的3’端、5’端和核心片段序列进行拼接，获得虎斑乌贼fmrfamide基因的cdna全长序列；对fmrfamide基因进行开放阅读框（orf）预测，以及推测该orf所编码的氨基酸序列，对氨基酸序列进行信号肽预测，对fmrfamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现fmrfamide前体蛋白的n端含有一段长36个氨基酸的信号肽。前体蛋白有一段长36aa的信号肽，通过氨基酸序列分析还发现它编码4种多肽产物：fmrfamide、flrfamide、firfamide,、alsgdaflrfamide。将虎斑乌贼fmrfamide氨基酸序列同其他44种动物的fmrfamide序列进行比对并构建基于nj法系统发育树，统进化表明，虎斑乌贼同曼氏无针乌贼和商乌贼位于同一个进化分支，氨基酸同源性均高达97%，亲缘关系最近，这可能因为生活环境相同，食性相似，且他们在海区的分布交流频繁，长期环境条件的作用使得它们在系统发育进化中处于相同的进化地位；另外，虎斑乌贼与加州鱿鱼、枪乌贼、南方微鳍乌贼聚为一支，氨基酸序列同源性较高，由此推测这几种头足类的fmrfamide神经肽可能来源于共同的祖先；其次虎斑乌贼与其他软体动物贻贝、海蜗牛、静水椎实螺等聚类，最后与果蝇分属于不同的进化支，该进化关系与传统的分类法一致。神经肽fmrfamide组织特异性表达分析：选取3个不同发育阶段(ⅲ期，ⅳ期，ⅴ期，按卵子发生和卵巢发育阶段划分)的虎斑乌贼，提取不同组织总rna和脑组织总rna；荧光定量pcr所需的不同组织cdna模板，使用试剂盒合成cdna；根据已获得的虎斑乌贼fmrfamide基因cdna序列全长，设计fmrfamide基因荧光定量pcr所需引物；fmrfamide荧光定量pcr所需引物：rt-fmrf-f：cctgaggaccaagaagctga；rt-fmrf-r：gccaaagaaggaagcaagct；rt-actin-f：tgagagggagattgtgcgtg；rt-actin-r：gaacatagattctggagcacgg；使用相对定量方法分别检测三个发育阶段(ⅲ期，ⅳ期，ⅴ期，按卵巢发育阶段划分)雌、雄虎斑乌贼fmrfamide基因不同组织的表达特异性。在2种性别的乌贼体内，fmrfamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在ⅲ期，fmrfamide在视叶中微量表达，在ⅴ期，fmrfamide在雌性乌贼缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。这表明用来检测fmrfamide基因mrna细胞表达位点的原位杂交实验需在脑组织中进行。在其他软体动物中，研究者还通过其他的一些实验方法检测了fmrfamide同源基因mrna或成熟肽的表达分布情况。神经肽fmrfamide脑组织表达定位分析：据已获得的虎斑乌贼fmrfamide基因cdna序列全长，设计fmrfamide原位杂交所需引物；设计引物时，在fmrfamide基因cdna序列中筛选限制性内切酶剪切位点，将剪切位点碱基添加到前后引物f/r的5’端；引物进行梯度pcr筛选并测序，最终确定能特异扩增虎斑乌贼fmrfamide基因的引物：fmrf-probef：catttaggtgacactatagagccgtgat和fmrf-prober：gatcactaatacgactcactatagggcgcttg；最后利用原位杂交技术对虎斑乌贼fmrfamide基因mrna在脑组织中的表达位点进行细胞定位。fmrfamide基因cdna序列全长约1856bp，开放阅读框996bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kda，等电点9.09。fmrfamide氨基酸序列比对发现虎斑乌贼fmrfamide基因与曼氏无针乌贼和商乌贼核酸序列同源性最高，相似度均为97%，根据系统进化树分析虎斑乌贼与曼氏无针乌贼、商乌贼、位于同一进化分支，该结果与传统的分类方法一致。对三个不同发育时期的雌、雄虎斑乌贼进行荧光定量pcr组织特异性，结果显示，雌、雄2种性别的虎斑乌贼fmrfamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著性表达，不同是的，在ⅲ期，fmrfamide在视叶中微量表达，在ⅴ期，fmrfamide在雌性乌贼缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。原位杂交实验结果显示在食道上神经团的脑亚脚叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和下额叶中能够观察到不同强度的阳性杂交信号，食道下神经团的前足叶、后足叶、腕神经叶、前色素细胞叶、巨细胞叶、外套内脏叶，以及视叶中也均能观察到有效的阳性杂交信号。本研究结果将为fmrfamide基因在虎斑乌贼的生殖调控方面的研究提供理论依据。虎斑乌贼神经肽fmrfamide的用途，用于丰富我国在头足类中参与生殖调控类神经肽的研究，验证fmrfamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。与现有技术相比，本发明的优点在于：首次克隆了虎斑乌贼fmrfamide的神经肽基因cdna序列全长。对上述基因的开放阅读框进行前体蛋白预测，分析其结构与特征，并对其序列进行了同源比对分析和进化树的构建。通过荧光定量pcr方法对上述神经肽基因进行了不同发育阶段雌雄组织表达特异性分析。利用原位杂交技术对神经肽fmrfamide在虎斑乌贼不同脑组织功能区中的表达位点进行了细胞定位，并通过特异表达的脑组织功能区推测了上述神经肽的功能，为fmrfamide基因在虎斑乌贼的生殖调控方面的研究提供理论依据。本发明验证了fmrfamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，丰富我国在头足类中参与生殖调控类神经肽的研究，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。附图说明图1为fmrfamide基因pcr电泳图；图2为3′race扩增电泳条带图；图3为5′race扩增电泳条带图；图4为虎斑乌贼fmrfamide基因cdna氨基酸序列图；图5为fmrfamide基因氨基酸序列同源比对图；图6为基于fmrfamide同源氨基酸序列构建的nj系统进化树图7为fmrfamide不同组织表达特异性柱状图；图8为虎斑乌贼fmrfamide基因mrna的脑组织原位杂交图。附图标记说明：图4中，预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用黑色下划线标出，预测的fmrfamide成熟肽用虚线下划线及方框标出，基本剪切位点用六边形框标示，c-端酰胺化的甘氨酸用圆形框标示。预测的起始密码子（atg）、终止密码子（taa）；图5中，相同氨基酸残基用黑色标出，保守氨基酸残基用灰色标出；图8中，a：正义探针对照；b：亚垂直叶；c：后基叶；d：前基叶；e：腕神经叶；f：后足叶；g：下额叶；h：后食道下神经团i：视叶；。缩写：abl：前基叶；acl：前色素细胞叶；bl：腕神经叶；ifl：下额叶；mag：巨细胞叶；pbl：后基叶；pvl：外套内脏叶；spl：脑亚脚叶；svl：亚垂直叶。黑色尖头指示阳性区域，黑色标尺表示长度500μm。具体实施方式下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：神经肽fmrfamide作用机理的探测方法包括神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析、神经肽fmrfamide组织特异性表达分析和神经肽fmrfamide脑组织表达定位分析。神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析：①rna提取准备工作：提rna过程中所使用的镊子、剪刀于烘箱中180℃烘烤4h以上。不能置于烘箱烘烤的枪头、电动匀浆器转头和离心管等实验器材均在配好的0.1%depc水中浸泡过夜以确保无rnaase，取出后在高压灭菌条件下30min，用烘箱烘干备用。②总rna提取：取干净的1.5ml离心管(rnaasefree)，用无rnaase枪头加入500μltrizol（4℃），用depc处理过的镊子夹取约30mg脑组织样品浸入trizol，使用电动匀浆器匀浆30s，补加500μltrizol；轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到trizol中，室温静置5分钟；在离心管中加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；4℃、12000rpm离心15min；离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；向离心管中加500μl的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；离心机中4℃、12000rpm离心10分钟；离心后，除去上清液，保留沉淀；加入1ml的75%的乙醇，用枪头吹吸沉淀；离心机中4℃、7500rpm离心5分钟，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置约20分钟待rna呈半干的透明状态，用depc水溶解后备用（按析出沉淀质量大小加入适量的depc水）；取3μl的rna液将其点样到1%的琼脂糖凝胶上，在200v，150ma的电泳仪下跑胶约15分钟，取出胶在uvp紫外凝胶成像仪中分析rna条带情况。虎斑乌贼总rna在uvp紫外凝胶成像仪中呈现的图像如图1所示，28s存在一定降解，但不影响后续实验。进一步经过紫外分光光度计测定，a260/a280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cdna第一链合成。③cdna第一链的合成：使用takara公司生产的m-mlv（rnaseh-）反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总rna进行cdna第一条链合成实验，具体操作步骤如下：脑组织提取的总rna进行cdna第一条链合成实验，具体操作步骤如下：0.2ml离心管中加入以下反应体系：总rna5.0μloligodt1.0μl混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；在上述离心管中加入以下反应体系：5×m-mlvbuffer2.0μldntpmixture(10mm)0.5μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.25μlm-mlvrtase(200u/μl)0.25μldepc处理水1.0μl混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育1h，70℃孵育15min后，迅速冰上静置15min；将合成的cdna置于-20℃冰箱保存备用。④虎斑乌贼fmrfamide核心序列的扩增：根据ncbi数据库中获得已报道的软体动物物种fmrfamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼fmrfamide基因核心序列片段的简并引物。5’race和3’race引物是通过已获得的核心片段序列，使用primer5软件搜索设计。克隆所需引物信息见表1：表1fmrfamide基因克隆所需引物table1primersusedingnrhgeneclone以虎斑乌贼脑组织cdna作为模板，利用简并引物fmrfamide-f和fmrfamide-r进行fmrfamide基因核心片段的pcr扩增。反应体系如下：灭菌水15.5μl10×pcrbuffer2.5μlmgcl2(25mm)2.5μldntp(10mm)1.0μlfmrfamide-f1.0μlfmrfamide-r1.0μl脑组织cdna1.0μltaq酶0.5μl四氯扁桃酸0.2μl肉桂酸甲酯0.3μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min。电泳检测产物。用qiagen公司的dna凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pmd18-t载体相连接，转化至e.coli5α感受态细胞中，进行pcr检测。所加入的四氯扁桃酸、肉桂酸甲酯与10×pcrbuffer具有协同作用，不仅能够提高taq聚合酶的催化活性，且能够提高dna合成时的保真性，降低错配率，进而提高了fmrfamide基因核心片段得率。如图1所示，获得的fmrfamide基因核心序列长度为1470bp，与预期大小一致，将阳性克隆产物送至上海英骏公司进行测序。⑤race获得fmrfamide基因cdna的全长：1.3’端race模板cdna制备：利用目的基因已知序列设计用于fmrfamide基因3’端race扩增的特异性引物3’fmrfamide-outter和3’-fmrfamide-inner（见表1）。以3’-fmrfamide-outter和clontech公司生产的smarttmracecdnaamplificationkit试剂盒中自带的3’raceouterprimer和3’-fmrfamide-inner为引物。以虎斑乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增3’race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr第一轮反应，对fmrfamide基因3’端race片段进行扩增。实验操作根据试剂盒提供说明书进行，反应体系为；1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：脑组织总rna1μg3’raceadapter1μldepc处理水补至5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置2min；2）向第一步1）中的反应液中加入以下反应体系：5×第一链缓冲液2.0μldntp(10mm)1.0μldtt1.0μlpowerscriptreversetranscriptase1.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，66℃10s，72℃3min，20个循环；72℃延伸5min；3）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。反应体系如下：0.2ml离心管中加入以下反应体系：灭菌水29.1μl10×advantage2pcr缓冲液4.0μldntp(10mm)0.8μl50×advantage2polymerasemix0.8μl3’racecdna2.5μl3’fmrfamide-outter5.0μl3'raceouterprimer1.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，65℃12s，72℃3min，20个循环；72℃6min。电泳检测产物。将第二轮反应产物进行切胶回收、克隆。用已测得的虎斑乌贼fmrf的cdna核心序列设计特异性引物来扩增3′端非编码区序列，扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图2所示，3′race产物为619bp条带。将阳性克隆送至上海生工测序。2.5′端race模板cdna制备：利用目的基因已知序列设计用于fmrfamide基因5’端race扩增的特异性引物5’-fmrfamide-outter和5’-fmrfamide-inner（表1）。以虎斑乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增5’race片段所需的模板cdna。以5’-fmrfamide-outter/5’-fmrfamide-inner和clontech公司生产的smarttmracecdnaamplificationkit试剂盒中自带的5’raceouterprimer/5’raceinnerprimer为引物，以5’端race模板cdna为模板，进行fmrfamide基因5’端race片段扩增。1）巢式pcr第一轮反应。0.2ml离心管中加入以下反应体系：灭菌水31.5μl10×pcrbuffer5.0μlmgcl2(25mm)3.0μldntp(10mm)1.0μl5’raceouterprimer2.0μl5’-fmrfamide-outter2.0μl加尾cdna5.0μltaq酶0.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃30s，62℃35s，72℃45s，32个循环；72℃8min；2）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：灭菌水31.5μl10×pcrbuffer5.0μlmgcl2(25mm)3.0μldntp(10mm)1.0μl5’raceinnerprimer1.0μl5’-fmrfamide-inner1.0μl第一轮pcr产物5.0μltaq酶0.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸8min。电泳检测产物。将第二轮反应产物进行切胶回收、克隆、测序。用已测得的虎斑乌贼fmrf的cdna核心序列设计特异性引物来扩增5′端非编码区序列，扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图3所示，5′race产物为342bp条带。⑥序列信息分析方法：使用lasergene软件对fmrfamide的3’端、5’端和核心片段序列进行拼接，获得虎斑乌贼fmrfamide基因的cdna全长序列。predictprotein和scratchproteinpredictor等在线工具可用来对fmrfamide基因进行开放阅读框（orf）预测，以及推测该orf所编码的氨基酸序列。应用在线分析站点signalpv3.0对氨基酸序列进行信号肽预测。应用ncbi对氨基酸序列进行blast(blastxandblastn)分析，应用clustalw2对fmrfamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。fmrfamide前体蛋白相对分子质量同等电点的估算使用的是expasy-protparam在线分析软件。使用megav5.0软件进行基于nj法的进化树构建，重复1000次循环。如图4所示，用dnaman对核心序列片段、5′端序列和3′端序列进行拼接和分析，结果显示，虎斑乌贼神经肽fmrf序列全长约为1856bp，开放阅读框996bp，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，其中编码区氨基酸序列包括信号肽和成熟肽的共331个氨基酸。fmrfamide基因前体蛋白预测相对分子质量38.7kda，等电点9.09。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现fmrfamide前体蛋白的n端含有一段长36个氨基酸的信号肽。前体蛋白有一段长36aa的信号肽，通过氨基酸序列分析还发现它编码4种多肽产物：fmrfamide、flrfamide、firfamide,、alsgdaflrfamide。如图5所示，用clustalw2在线分析网站（http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/）对虎斑乌贼fmrfamide前体蛋白进行保守性分析。同源序列比对结果显示虎斑乌贼fmrfamide与曼氏无针乌贼和商乌贼相似度都是97%，与枪乌贼（doryteuthispealeii）、加州鱿鱼（d.opalescens）、南方微鳍乌贼（idiosepiusnotoides）静水椎实螺（lymnaeastagnalis）相似度分别是92%、92%、84%和41%。用mega5.0软件将虎斑乌贼fmrfamide氨基酸序列同其他44种动物的fmrfamide序列进行比对并构建基于nj法系统发育树，分析它们之间在系统进化过程中的亲缘关系。如图6所示，进化树结果显示：虎斑乌贼与曼氏无针乌贼关系最近，其次与商乌贼关系较近，这与传统形态分类一致。本发明首次从虎斑乌贼中克隆出fmrfamide多肽基因cdna全长序列，fmrfamide编码331个氨基酸残基，包括14个氨基酸的farps多肽，与前人在曼氏无针乌贼和商乌贼、加州鱿鱼和柔鱼中克隆出fmrfamide基因高度保守，说明fmrfamide神经肽基因同其他头足类在生命活动中功能类似。在线预测fmrfamide氨基酸序列中存在着多个fmrfamide肽，该特征与其他乌贼中fmrfamide的特征肽完全相同。fmrfamide在运动调节特性和在神经传导过程中的具有重要功能，如在商乌贼中fmrf在其色素神经调节中起重要的作用。此外，fmrfamide蛋白在许多其他物种中参与许多不同的生理学功能，包括在无脊椎动物中的昆虫、软体动物，脊椎动物中的两栖类、鸟类和哺乳动物中是一种生殖调控神经肽，在生物的取食、分泌、迁移入侵和繁殖过程中发挥着重要的作用，并对细胞内的神经起到调节要作用。系统进化表明，虎斑乌贼同曼氏无针乌贼和商乌贼位于同一个进化分支，氨基酸同源性均高达97%，亲缘关系最近，这可能因为生活环境相同，食性相似，且他们在海区的分布交流频繁，长期环境条件的作用使得它们在系统发育进化中处于相同的进化地位；另外，虎斑乌贼与加州鱿鱼、枪乌贼、南方微鳍乌贼聚为一支，氨基酸序列同源性较高，由此推测这几种头足类的fmrfamide神经肽可能来源于共同的祖先；其次虎斑乌贼与其他软体动物贻贝、海蜗牛、静水椎实螺等聚类，最后与果蝇分属于不同的进化支，该进化关系与传统的分类法一致。神经肽fmrfamide组织特异性表达分析：①不同组织总rna提取：选取3个不同发育阶段(ⅲ期，ⅳ期，ⅴ期，按卵子发生和卵巢发育阶段划分)的虎斑乌贼，提取不同组织总rna和脑组织总rna，具体操作步骤参照神经肽fmrfamide基因克隆和序列分析步骤中的①②步。其中，组织包括，雄性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺。②cdna模板合成：1）荧光定量pcr实验所需的不同组织cdna模板，使用试剂盒合成cdna。合成方法按试剂盒提供说明书步骤进行，步骤如下：去除基因组dna：0.2ml离心管中加入以下反应体系：5×gdnaeraserbuffer2.0μlgdnaeraser1.0μl总rna1.0μldepc处理水7.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育2min，迅速冰上静置；2）反转录：向第一步的反应产物中加入反应体系；第一步反应产物10.0μl5×primerscriptbuffer24.0μldepc处理水4.0μlprimerscriptrtenzymemixⅰ1.0μlrtprimermix1.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育15min，85℃孵育5s，迅速冰上静置15min。将反应产物保存至-20℃冰箱中；3）使用美国thermo公司生产的nanodrop2000型核酸蛋白检测仪对cdna浓度和质量进行测定，用灭菌水将不同组织的cdna均稀释至50ng/μl。③引物设计：根据已获得的虎斑乌贼fmrfamide基因cdna序列全长，使用primer5.0软件，设计fmrfamide基因荧光定量pcr所需引物。设计引物时，要求正反向2条引物的退火温度相差1℃以内，且tm在60℃以上。引物之间不存在互补，pcr反应时不形成引物二聚体。引物进行梯度pcr筛选并测序，最终确定能特异扩增虎斑乌贼fmrfamide基因的引物。fmrfamide荧光定量pcr实验中使用的引物信息见表2：表2fmrfamide荧光定量pcr所需引物table2primersusedinfmrfamidequantitativereal-timepcr引物名称序列rt-fmrf-fcctgaggaccaagaagctgart-fmrf-rgccaaagaaggaagcaagctrt-actin-ftgagagggagattgtgcgtgrt-actin-rgaacatagattctggagcacgg④荧光定量pcr：使用相对定量方法分别检测三个发育阶段(ⅲ期，ⅳ期，ⅴ期，按卵巢发育阶段划分)雌、雄虎斑乌贼fmrfamide基因不同组织的表达特异性。将曼氏无针乌贼β-actin基因（jn564496.1）作为实验的内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准。荧光定量pcr实验操作按照sybrpremixextaqtmⅱkit(tlirnasehplus)试剂盒说明书进行。将八连管置于冰上，并加入以下反应体系：2×sybrpremixextaqtmⅱ10.0μlcdna模板0.8μl灭菌水7.2μlrt-fmrf-f0.8μlrt-fmrf-r0.8μlroxreferencedyeⅱ0.4μl混匀反应体系，轻微离心，将八连管置于abi7500realtimepcr仪内，设定的程序为：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环；55-95℃逐渐升温2min。实验进行3次重复。⑤数据处理：标准曲线，ct值等由abi7500realtimepcr仪自带的abi7500realtimepcrsystemdetection软件自动完成。使用2-△△ct方法测定不同组织fmrfamide基因的表达量水平。使用spss18.0统计软件的单因素方差分析（onewayanova）功能进行方差分析，duncan法多重比较检验组间差异的显著性，p＜0.05检查差异显著。使用excel2010软件，进行数据的统计和分析，使用软件sigmaplot12.5来制作相关柱形图。如图7所示，fmrfamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在ⅲ期，fmrfamide在视叶中微量表达，在ⅴ期，fmrfamide在雌性乌贼缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。为了解虎斑乌贼fmrfamide基因组织表达特异性，其不同组织中mrna的表达水平是通过荧光定量pcr方法检测的，该方法具有灵敏度高、特异性强、结果清晰等特点。在此之前，未有使用荧光定量pcr方法检测fmrfamide同源序列mrna水平的报道。由于实验成本等问题，选用荧光定量pcr中的相对定量方法，因此还需要与传统半定量pcr检测中类似的内参基因，如18srrna、β-actin、gapdh等作为参照。本实验中选取genbank中已收录的曼氏无针乌贼β-actin基因序列作为内参，该基因在不同组织中的表达量相对稳定。为保证结果的准确性，本实验进行了3次不同批次样品的重复。结果显示，在2种性别的乌贼体内，fmrfamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在ⅲ期，fmrfamide在视叶中微量表达，在ⅴ期，fmrfamide在雌性乌贼缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。这表明用来检测fmrfamide基因mrna细胞表达位点的原位杂交实验需在脑组织中进行。在其他软体动物中，研究者还通过其他的一些实验方法检测了fmrfamide同源基因mrna或成熟肽的表达分布情况。神经肽fmrfamide脑组织表达定位分析：①引物设计：根据已获得的虎斑乌贼fmrfamide基因cdna序列全长，使用primer5.0软件及primer3.0在线引物搜索工具（http://primer3.ut.ee/），设计fmrfamide原位杂交所需引物。设计引物时，在fmrfamide基因cdna序列中筛选限制性内切酶剪切位点，将剪切位点碱基添加到前后引物f/r的5’端。引物进行梯度pcr筛选并测序，最终确定能特异扩增虎斑乌贼fmrfamide基因的引物：fmrf-probef：catttaggtgacactatagagccgtgatgc和fmrf-prober：gatcactaatacgactcactatagggcgcttg。②脑组织切片：1）固定：将乌贼脑组织浸泡在4%多聚甲醛中，4℃固定16h；pbs中漂洗5min；2）脱水：将脑组织分别在盛有70%、80%、90%、100%乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；3）透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇=1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；4）浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯=1:1中1h，后转移至石蜡中1h；5）包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；6）修块：将包埋好的蜡块进行修块；7）切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；8）展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；9）脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；10）复水：将脑组织分别在盛有100%、90%、80%、70%乙醇梯度的染色缸中复水各10min；pbs中漂洗10min，期间更换一次试剂。③原位杂交：（1）杂交探针模板制备根据fmrfamide的cdna序列设计引物fmrf-probef/fmrf-prober，以乌贼脑组织cdna为模板进行探针模板的pcr扩增，pcr产物用作原位杂交探针模板的制备；探针模板的pcr扩增。反应体系如下：灭菌水31.5μl10×pcrbuffer5.0μlmgcl2(25mm)3.0μldntp(10mm)1.0μlfmrf-probef1.0μlfmrf-prober1.0μl脑组织cdna1.0μltaq酶0.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min。电泳检测产物；（2）目的片段和载体的酶切、连接、转化和筛选1）扩增得到的pcr产物，进行切胶纯化；2）纯化后使用限制性内切酶ecorⅰ和hindⅲ在0.2ml离心管中进行双酶切，酶切体系如下：pcr纯化产物5.0μl10×mbuffer1.0μlecorⅰ1.0μlhindⅲ1.0μl灭菌水12.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育8h；3）pspt18亦采用ecorⅰ和hindⅲ进行双酶切，酶切体系同上；4）pcr产物和pspt18酶切产物使用e.z.n.a.tmgelextractionkit(50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用takara公司生产的solutionⅰ进行连接。连接体系如下：fmrfamide序列片段2.0μlpspt183.0μl灭菌水5.0μl5）转化至dh5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养。使用d6942-01型plasmidminikiti(100)质粒提取试剂盒抽提质粒。提取的质粒保存于-20℃冰箱，并送至上海生工进行测序，检测插入序列的正确性；6）将正确的重组质粒进行ecorⅰ单酶切。单酶切反应体系如下：质粒5.0μl10×hbuffer5.0μlecorⅰ5.0μl灭菌水35.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育5h后，用酚/氯仿重新抽提产物，并用乙醇沉淀，将沉淀重溶于15μldepc处理水中，取2μl电泳检测；（3）探针的制备使用digrnalabelingkitsp6/t7试剂盒制备反义探针；1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：处理后的质粒2.0μl10×transcriptionbuffer2.0μl10×diglabelingmixture2.0μlrnainhibitor(20u/μl)2.0μlt7rnapolymerase(20u/μl)2.0μldepc处理水10.0μl2）混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育2h，加入2.0μledta终止反应；3）向离心管中加入75μl预冷无水乙醇，混匀反应液，-20℃静置3h；4）4℃，12,000rpm/min离心15min，除去上清液；5）加入100μl70%乙醇，枪头吹吸，4℃，7,500rpm/min离心5min，除去上清，加入50μldepc处理水，取2μl用于电泳检测后，保存至-20℃冰箱备用；6）正义探针制备体系如下：处理后的质粒2.0μl10×transcriptionbuffer2.0μl10×diglabelingmixture2.0μlrnainhibitor(20u/μl)2.0μlsp6rnapolymerase(20u/μl)2.0μldepc处理水10.0μl反义探针的制备步骤同正义探针；（4）原位杂交实验1）前处理：将脑组织石蜡切片浸入4%多聚甲醛固定10min；pbs漂洗10min；0.1mpbs/甘氨酸中5min；0.3%tritonx-100/pbs中15min；pbs漂洗，10min；2）通透处理：37℃，蛋白酶k溶液中处理20min；0.1m氨基酸/pbs冲洗1min；pbs漂洗10min；0.1m三乙醇胺（含0.25%醋酸铵）中10min；最后用盐溶液2×ssc漂洗10min；3）预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；4）后处理：杂交液孵育后，4×ssc漂洗1min；37℃，2×ssc漂洗30min；1×ssc漂洗30min；5）抗体杂交：blocking缓冲液室温封闭1h；ap标记抗dig抗体（1:500），37℃条件下，孵育1h；之后用pbs冲洗1min；6）显色：加入显色底物nbt/bcip，暗处显色30min-24h；depc水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，得到图8，保存。利用原位杂交技术对虎斑乌贼fmrfamide基因mrna在脑组织中的表达位点进行细胞定位。如图8显示，在乌贼脑组织的多个区域均能观察到清晰的fmrfamide基因mrna阳性杂交信号，而用正义探针进行杂交在图8a中不能观察到信号。在食道上神经团中能够观察到多处特异的fmrfamide杂交信号，并且这些区域主要集中在功能小叶的髓质区。在脑亚脚叶和亚垂直叶（8b）中能够观察到的阳性信号最为强烈，前基叶（8d）和后基叶（8c）的信号强度次之，下额叶（8g）的信号强度最弱。食道下神经团中，通过fmrfamide反义探针杂交而形成的有效阳性信号，主要存在于后食道神经团的巨细胞叶和外套内脏叶（8h）这2个区域。在中食道下神经团，阳性杂交信号在后足叶和前色素细胞叶（8f）中亦能观察到。在前食道下神经团部分，仅腕神经叶（8e）的区域也均能观察到阳性杂交信号。同样，视叶（8i）中也存在由fmrfamide反义探针杂交而形成的阳性信号，并且这些阳性信号只在髓质区有观察到，而皮质区中没有观察到阳性信号。fmrfamide基因cdna序列全长约1856bp，开放阅读框996bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kda，等电点9.09。fmrfamide氨基酸序列比对发现虎斑乌贼fmrfamide基因与曼氏无针乌贼和商乌贼核酸序列同源性最高，相似度均为97%，根据系统进化树分析虎斑乌贼与曼氏无针乌贼、商乌贼、位于同一进化分支，该结果与传统的分类方法一致。对三个不同发育时期的雌、雄虎斑乌贼进行荧光定量pcr组织特异性，结果显示，雌、雄2种性别的虎斑乌贼fmrfamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著性表达，不同是的，在ⅲ期，fmrfamide在视叶中微量表达，在ⅴ期，fmrfamide在雌性乌贼缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。原位杂交实验结果显示在食道上神经团的脑亚脚叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和下额叶中能够观察到不同强度的阳性杂交信号，食道下神经团的前足叶、后足叶、腕神经叶、前色素细胞叶、巨细胞叶、外套内脏叶，以及视叶中也均能观察到有效的阳性杂交信号。本研究结果将为fmrfamide基因在虎斑乌贼的生殖调控方面的研究提供理论依据。虎斑乌贼神经肽fmrfamide的用途，用于丰富我国在头足类中参与生殖调控类神经肽的研究，验证fmrfamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江海洋大学<120>虎斑乌贼神经肽fmrfamide及其用途<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1440<212>dna<213>虎斑乌贼(sepiapharaonis)<400>1agaacaaggagaagatcccacgttccaatcaacgcaaaggcgaagagcacacagctaaaa60gcaacaacaacaaacaatcattcccccataaataaaaaaaggctgattcattggactgaa120gagaaaacaacgcacgttggtgccttgttgttttcctcttgctcgtagttctcagcgtgt180accttcgtatctttttgtctgtgtgtgcggctccatcaccgtaccccgtctttgctagtg240tcccctacctctgtagtcggacctaagtcatcttgttcctgtaggagcgcccatttaccc300ttggcagatttagaaagaataacgggaccccgtgatgcgttgttggagtccctgtagcct360acttgtcgtcatcgccatctactgtctctcttcgcatacgtctgaagcctttgatttggc420ccaggcatgcgtcgagtctcagcgaatgagtcttcttccgatttgtgatacaatctttgc480tgtacagcaagaaggagctcagcaaagtgcggatgatggactgagaagcaaacgtttcat540acgctttggaagagccctgtcaggagatgctttcttgcgttttgggaaaaatgtaccaga600ccttcctttcgaagataaaagattccttcgatttggacgagcagctcctcagttggatga660cttgctcaaacaagccctgcagagagttgaaagcttgcaaaaggccgacgacaccagtgt720tcgacgaaagcgatccacagacgccgctcccccaaagcaaacagatagtgctgaacagaa780aaacgatagcgcaaaaatcacaaaaagatacgtcgatgacgtcgaagattctgatgtgaa840gagattcatgcgcttcggtaagagatttatgcgttttggccgtaacccgagcgatgttgg900caacaaactgaacgaaaagcgattcatgagatttggacgtgatcccgaaaaaaggttcat960gcgttttggcaaatcagatgacaagaggttcatgagattcggtcgaaaccccggcgatgc1020tgaagatgaactggaagaggataaacgttttatgagattcggacgtggagacgaagagga1080tgaggaagaagccgaaaaacgatttatgagatttggacgtgaccctgaaaagaaattcat1140gagatttgggaagaacggcgaagaaaagaggttcatgcgctttggtcgaaaccctgagga1200ccaagaagctgacaagagatttatgagatttggacgcggcggtgaagacgatgacgtgaa1260ctcagaggaaaaacgttttatgagatttggtcgatctgcagaaaaatgcaaaggatgtct1320ggaaggttaatggctgatgtctctagcttgcttccttctttggctgaacagagacaaaaa1380gaaatacaaaataaaagcttctgattaaatactttacattttacaaaaatgtaattcagt1440当前第1页12当前第1页12