九子连环草甘露糖结合蛋白的制作方法

本发明涉及分子生物学基因工程技术领域，具体涉及一种编码九子连环草甘露糖结合蛋白的dna序列及氨基酸序列。

背景技术：

九子连环草，calanthediscolorlindl.，属于兰科植物，是一种传统的中草药，性温，味甘辛，无毒。可用以散结，解毒，活血，舒筋。九子连环草作为一种常用中药材，所含甘露糖结合蛋白丰度很低，但其凝血活性很强。单子叶甘露糖结合蛋白家族，是植物蛋白里的一个十分重要的家族分支，其组成成员十分庞大。这一家族的蛋白具有专一特异性结合甘露糖或甘露寡糖的能力，并且广泛分布于单子叶植物中，同时还具有多种十分有价值的生物学活性，如抗真菌活性及抗虫活性等。vandamme,balzarinij,smeets等人先后从兰科植物火烧兰和二叶兰的块茎中分离出两种以单体形式存在的抗真菌甘露糖结合蛋白(ehmbp和lombp)。目前，还没有关于编码兰科植物九子连环草甘露糖结合蛋白的基因全序列报道。

技术实现要素：

鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种编码九子连环草甘露糖结合蛋白的dna序列及氨基酸序列。

本发明所述九子连环草甘露糖结合蛋白的核苷酸序列如序列表中seqidno:1所示。

本发明所述九子连环草甘露糖结合蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno:2所示。

本发明通过从九子连环草新鲜嫩叶组织中提取的rna，利用同源克隆和race(rapidamplificationofcdnaends)技术，快速克隆编码九子连环草甘露糖结合蛋白的基因。

本发明具有以下有益效果：

使用本发明所述技术方法和引物能够快速准确地获得一种兰科植物九子连环草甘露糖结合蛋白的基因全长序列及氨基酸序列。丰富了植物甘露糖结合蛋白家族成员信息，为后续应用和研究提供技术支持。

附图说明

图1是提取的九子连环草嫩叶组织的总rna电泳图谱，

图2是对九子连环草甘露糖结合蛋白基因进行3’race克隆片段的电泳图谱，其中a图是第一轮扩增的pcr产物；b图是第二轮扩增的pcr产物。

图3是对九子连环草甘露糖结合蛋白基因进行5’race克隆片段的电泳图谱。

图4是九子连环草甘露糖结合蛋白的核苷酸序列(cdna全长)的电泳图谱。

具体实施方式

1.材料和方法

1.1材料

植物材料：九子连环草新鲜嫩叶组织：直接剪取。

菌株：所用克隆菌株为大肠杆菌(escherichiacoli(migula)castellanietchalmers)top10。

质粒：peasy-t1cloningvector，大小为3928bp，具有氨苄青霉素(amp)和卡那霉素(kal)两种筛选标记，便于重组子的筛选，具有带游离t的5’-黏性末端，为pcr产物的专用克隆载体(购买于北京全式金生物技术有限公司)。

试剂盒和酶：trizol试剂购买自invitrogen公司；小量胶回收试剂盒购于axygen公司。

t4dnaligase、m-mlv反转录酶、tdt(核苷酸末端转移酶)、ribonucleaseinhibitor、easytaqdnapolymerase、easypfudnapolymerase及fermentas限制性内切酶bamhⅰ、hindⅲ均购自北京全式金生物技术有限公司。

其余化学药品均为分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1九子连环草总rna的提取

九子连环草总rna的提取过程参照invitrogentrizol试剂盒的说明，如下：

(1)取0.1mg左右新鲜的或-80℃低温保存的九子连环草嫩叶组织迅速置于充满液氮的研钵中，将组织充分研磨成粉末状；

(2)用药匙将粉末分装到两个液氮预冷过的1.5ml离心管中，并向其中加入1ml的trizol试剂，充分震荡混匀，置于冰上约5min；

(3)向管中加入200μl氯仿，充分混匀后放置5min，然后在4℃，12，000g离心5min；

(4)将上层水相转移到新的已预冷过的离心管中，加入500μl异戊醇，充分混匀后放置5min，然后在4℃，12，000g离心5min；

(5)倒掉上清，加入75％乙醇将沉淀悬起，4℃，7，500g离心3min；

(6)重复步骤5；

(7)尽量将上清倒净，将离心管置于通风处风干约10min，使残留乙醇挥发干净；

(8)向管中加入20-25μlrnaasefree的depc处理过的水(depc水)，通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。

1.2.2非特异性简并引物的设计

分析已知的兰科单子叶植甘露糖结合蛋白序列(所用序列均来自ncbigenbankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，根据保守区域结合pcr引物设计原理,设计简并引物用于九子连环草甘露糖结合蛋白的基因克隆。

正向引物(forwardprimer)(fp)：5’-gactgc/taac/tctcgtc/gctc/g-3’；

反转录引物(tp1)：5’-gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgt(18)-3’；

反向引物(reverseprimer)(tp2)：5’-gtcaacgatacgctacgtaacg-3’；

反向引物(reverseprimer)(tp3)：5’-tacgtaacggcatgacagtg-3’。

1.2.3mrna反转录成cdna

mrna的反转录操作如下(参照takaram-mlv的说明书)：

(1)取0.5ml离心管中加入如下成分：

(2)上面的混合物置于70℃10min，使rna变性；随后迅速置于冰上2min；短暂离心收集混合液体至管底，并继续向其中加入以下成分，步骤(1)(2)的总体积是20μl：

(3)轻弹管底使液体混匀，然后短暂离心将液体收集至管底，置于42℃保温1min；

(4)96℃高温5min使反转录酶失活从而中止反应；

(5)经短暂离心收集反应物置于冰上，可储存在-20℃。

1.2.4第一轮pcr扩增反应

按以下反应体系添加pcr反应液：

按以下条件进行pcr反应：将pcr反应混合液先经94℃，热变性5min，再扩增(94℃，30s；53℃，30s；72℃，45s；进行35个循环)，再于72℃下10min。反应在geneamppcrsystem2400热循环仪(promega公司，北京)上进行。

1.2.5第二轮pcr反应

第二轮pcr反应以本实施例1.2.4中所述的第一轮pcr反应产物为模板，将第一轮pcr产物用蒸馏水稀释10倍，用本实施例1.2.2中的所述引物tp3代替引物tp2，再次按本实施例1.2.4中反应体系配制pcr反应液进行pcr扩增。

1.2.61％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物

具体操作为：称取1g的琼脂糖于一个250ml的三角瓶中，另外量取100mlte缓冲液(10mmtris-hcl，ph＝8.0，1mmedta)于三角瓶中，在微波炉中加热使其充分溶解至均匀透明状，置于室温下稍微降温后，取50μl的溴化乙锭(eb)加入其中，摇匀后即可倒胶。待胶凝固之后，将样品(pcr产物、rna等)加入点样孔，打开电泳槽的电源，使样品在适当电压下顺电流方向泳动，电泳结束后在紫外成像仪中观察，结果如图2示。

1.2.7pcr扩增产物的回收(参照axygen柱式小量胶回收试剂盒说明书)

(1)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，并置于已称好重量的1.5ml离心管中，再次称重算出胶块的重量，将该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)；

(2)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混匀后置于75℃水浴中约8min直至胶块完全融化，每2-3min间断混合；

(3)加入0.5个bufferde-a体积的bufferde-b混匀；当分离的dna片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇；

将上步中的混合液转移到dna制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min，弃滤液；

(4)将制备管放回离心管，加500μlbufferw1，12,000×g离心30s，弃滤液；

(5)将制备管放回离心管，加700μlbufferw2，12,000×g离心30s，弃滤液；

(6)以步骤5同样方法再用700μlbufferw2洗涤一次12,000×g离心1min；将制备管放回离心管，≥13,000×g空转2min，再将制备管置于常温下约10min，使多余乙醇挥发干净；

(7)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在dna制备膜正中央加入25-30μlelute或去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱dna。

1.2.8pcr扩增产物的连接和转化(参照peasy-t1cloningvector小型试剂盒说明书)

在0.2ml离心管中依次加入以下成分：

轻轻混合，22-37℃反应5min即可完成连接，反应结束后，将离心管置于冰上；连接好的重组质粒最好立即用于转化。

2-5μl的连接反应产物直接加到装有50ul感受态细胞的1.5mlep管中，冰浴30min，42℃热激90s，再次放置在冰上2min，加入600ul无抗lb培养基，37℃，200rpm摇荡1h。1h后，取出ep管，2500rpm离心5min，取掉600ml上清，轻轻吹打悬菌。涂在带有amp抗性的固体lb培养板上，37℃过夜培养。

1.2.9转化子的鉴定和测序

选择形状形态规则饱满的单菌落，并挑取到液体培养基中扩大培养。培养5h后，取少量菌液用菌落pcr法或提取重组质粒进行双酶切来鉴定转化子。

确认目的片段插入载体后，剩余菌液继续在37℃下培养过夜。将过夜培养物送上海基天生物工程技术服务有限公司测序，同时将菌种加终体积10％的甘油保存在-20℃冰箱(短期保存)。

所得序列在ncbi(美国国家生物技术信息中心)上进行blast相似性搜索，同时采用dnaman5.2.2.0等软件进行序列分析，根据实际序列进一步确认插入的片段是九子连环草甘露糖结合蛋白的3’端。

1.2.105’racepcr反应

1.2.10.1引物设计

根据3’-race测序得到的九子连环草甘露糖结合蛋白3’端序列设计5’-race反应所需的特异性引物，用于巢式pcr，如下：

反转录巢式引物(np1)：5’-cacgccaccatcttcttc-3’；

巢式引物(np2)：5’-ctcggcaaggcgtaaatg-3’；

巢式引物(np3)：5’-tagcttccgctggccctgt-3’。

1.2.10.2mrna反转录出单链cdna及纯化

用本实施例1.2.10.1中所述的np1作为反转录引物，按照本实施例1.2.3中所述方法进行反转录。反转录完成后向得到的cdna中加入2-3μl的rnasea，37℃水浴30min去除rna后，用小量胶回收试剂盒直接回收纯化，最终洗脱体积根据cdna的量而定。

1.2.10.3cdna的同聚物加尾(tdttailingofcdna)

tdttailing反应中使用的cdna量可根据第一步中所提取的总rna的量而定。

(1)向0.2ml离心管中加入以下成分：

(2)在94℃温育2-3min，迅速置于冰上冷却2min，经短暂离心后收集样品，放置于冰上；

(3)加1μltdt轻轻混匀(终体积20μl)，37℃保温30min；

(4)60℃10min热失活tdt，短暂离心收集加尾产物并放于冰上。

1.2.10.4cdna加尾产物的pcr反应

以本实施例1.2.10.3中的加尾cdna作反应底物，以本实施例1.2.2中的tp1和本实施例1.2.10.1中的np2作引物，按照本实施例1.2.4中的pcr条件，进行pcr扩增。反应产物置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.10.5巢式pcr反应

取本实施例1.2.10.4中的pcr产物1μl稀释到9μlte缓冲液中，稀释10倍。用本实施例1.2.2中的tp2和本实施例1.210.1中的np2作引物，按照本实施例1.2.4中的pcr条件，进行第一轮的pcr扩增。反应完成后将反应产物用灭菌的蒸馏水稀释10倍，用本实施例1.2.2中的tp3和1.2.10.1中的np3作引物，再次以本实施例1.2.4中的pcr条件，进行pcr扩增。反应产物置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.11pcr扩增片段的电泳检测、回收和连接

按照本实施例1.2.6，1.2.7和1.2.8所述进行。电泳检测结果如图3示。

1.2.12pcr扩增片段的转化、鉴定和测序

按照本实施例1.2.8和1.2.9中要求进行。

1.2.13九子连环草甘露糖结合蛋白基因全长序列的获得

根据本实施例中3’和5’race的测序结果，设计这段拼接序列包含编码区在内的正向引物flfp：5’-atgaagatgaacatactcctctgc-3’和反向引物flrp：5’-ttactcatcacccataaccttcacaa-3’。再次按照本实施例1.2.4中的pcr条件进行pcr扩增，以反转录的九子连环草cdna为模板，改用easypfudnapolymerase(2.5u/l)，退火温度设定50℃进行pcr扩增，得到完整准确的九子连环草甘露糖结合蛋白全长基因。

按照本实施例1.2.6，1.2.7和1.2.8中的方法依次进行扩增产物的电泳检测、切胶回收和连接，并且转化至感受态细胞中。根据本实施例1.2.9中方法进行阳性克隆的鉴定和测序分析。得到九子连环草甘露糖结合蛋白基因的的全长核苷酸序列(cdna序列)，电泳检测结果如图4示。

从序列表seqidno:1所示的核苷酸序列可以看出，所得到的九子连环草cdna全长序列由513个核苷酸组成，包含一个完整的开放阅读框，编码着如序列表seqidno:2所示的由170个氨基酸组成的甘露糖结合蛋白前体蛋白。对cda进行的结构域分析表明，cda氨基酸序列中存在一个完整的甘露糖结合蛋白功能性结构域，并与雪花莲甘露糖结合蛋白(galanthusnivalisagglutinin,gna)一样，具有3个典型的“qxdxnxvxy”甘露糖结合活性中心，属于在进化上比较保守的雪花莲相关甘露糖结合蛋白。

<110>四川大学

<120>九子连环草甘露糖结合蛋白

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>513

<212>dna

<213>兰科九子连环草（orchidaceaecalanthediscolorlindl.）

<400>1

atgaagatgaacatactcctctgcaccgcatatctcacactcctcatcaccccatcatca60

ggccaactctacaaccacttgctctctggtcagcgcctcaacacaggccaatctcttgta120

cagagcggctatatcttcatcatccaaaatgactgcaatcttgtcctctacaatttgggt180

actgcaatttgggcttcgggaacccatggtaggggtaacggatgctatcttatcatgcag240

cgagacggtaaccttgttgtctatgacagaaataatcgcgccatatgggcaagtaacact300

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cctacacaaaatgggacagtgctgccttcgggtgcggagcagaataaggtgagggaaatg480

gggaagattgtgaaggttatgggtgatgagtaa513

<210>2

<211>170

<212>prt

<213>兰科九子连环草（calanthediscolorlindl.）

<400>2

metlysmetasnileleuleucysthralatyrleuthrleuleuile

151015

thrproserserglyglnleutyrasnhisleuleuserglyglnarg

202530

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115120125

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145150155160

glylysilevallysvalmetglyaspglu

165170