本发明属于生物医药和基因工程技术领域,具体涉及一种用牛肠源溶菌酶编码核苷酸生产牛肠源溶菌酶蛋白的方法,本发明还涉及用上述工艺生产牛肠源溶菌酶所需的载体、重组质粒、宿主细胞、获得的牛肠源溶菌酶蛋白蛋白产物及该生产方法的应用。
背景技术：
现有技术公开了溶菌酶(lysozyme，ec3.2.1.17)广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，亦存在于哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘、体液及组织细胞内，其中以蛋清中含量最丰富。溶菌酶对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对没有细胞壁的动物体细胞不会产生不利影响，因而安全性很高。口服溶菌酶，可阻止流感和腺病毒繁殖。作为抗生素的替代品，溶菌酶被who和许多国家认定为无毒、无害、安全的，可以应用于食品和饲料添加剂领域，2010年被我国卫生部批准为食品添加剂。
研究显示，溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强机体免疫力和抑菌作用。细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由n一乙酰氨基葡萄糖及n一乙酰胞壁酸交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，降低细菌细胞壁的稳定性，随后细菌因细胞内外渗透压不平衡而引起细胞破裂、细胞质外泄，最终导致菌体细胞死亡。溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复合盐使侵人体内的病毒失去活性。溶菌酶作为机体非特异性免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。
溶菌酶能专一性作用于目的微生物细胞壁。该酶有较宽抑菌谱，对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等)和养殖中常见致病菌(鸡大肠埃希菌、鳗弧菌、副溶血弧菌等)都有较强杀灭作用。据报道，用0.05％溶菌酶与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用，具有良好防腐作用，在饲料中添加溶菌酶可防止霉变，延长饲料贮存期，减少损耗。溶菌酶用于饲料中，与葡萄糖氧化酶有增效作用。抗酸作用还可加入花生四烯酸。如果将溶菌酶与乳酸链球菌素、卵运铁蛋白、葡聚糖、甘氨酸或edta等结合使用，则对抑制或杀灭单核细胞增生李氏菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血孤菌等也有显著作用。
研究还发现，溶菌酶对仔猪腹泻有防治作用。邵春容等报道，仔猪饲喂溶菌酶制剂，腹泻率显著降低，对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒有较强的抑制作用，表明溶菌酶能有效维持仔猪肠道健康的功能。研究同时还发现，溶菌酶具有多种药理作用，它可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强机体的免疫力，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎，修复组织，改善胃肠道功能的目的。
溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒性，是一种安全性高的饲料添加剂。溶菌酶可促进饲料中营养物质的消化、吸收，最大限度地提高饲料的利用率。大量研究与应用表明，在饲料中添加溶菌酶，可以有效提高动物的生长性能，预防疾病的发生，尤其是防治仔猪腹泻，提高机体免疫机能，提高动物健康效果显著。因此，溶菌酶作为一种安全高效的绿色添加剂，在目前食品安全越来越受重视的背景下，将在畜牧生产中发挥越来越重要的作用。
目前市场上的溶菌酶蛋白大部分来源于从鸡蛋提取鸡源溶菌酶,但是，动物在进化过程中，其内在溶菌酶基因各有特点，以适应各种动物的需要，例如牛中某些表达的溶菌酶蛋白就对胃蛋白酶的消化有拮抗作用(nonakay,febsj.276(8),2192-2200(2009))。关于溶菌酶的分子进化的研究也引起了人们的关注(meiyu，molecularphylogeneticsandevolutionvol.5,no.2,april,pp.298–308,1996)，不同物种的溶菌酶的功能始终与不同物种的生活环境，生理特性相适应。猪源的溶菌酶，和牛溶菌酶，与鸡源溶菌酶等蛋白序列不同，功能也各有特点。同时相对从鸡蛋提取的鸡源溶菌酶，重组源溶菌酶具有成本低、安全性高等优势。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的牛肠源溶菌酶蛋白的dna序列及其生产工艺和应用。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列,该核酸被命名为牛肠源溶菌酶蛋白dna序列(lyc-cow)。
本发明的另一个目的是提供一种用上述核苷酸序列生产牛肠源溶菌酶蛋白的方法。
本发明的再一个目的是提供一种重组体,该载体含有牛肠源溶菌酶蛋白dna序列(lyc-cow)核酸序列并可以通过转化宿主实施,如大肠杆南、酵母细胞,表达出溶菌酶蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种宿主细胞,该细胞含有能表达牛肠源溶菌酶蛋白的dna序列(lyc-cow)的重组质粒并可表达具有溶菌酶活性的蛋白。
本发明还提供了这种生产方法以及用该方法生产出的溶菌酶蛋白的应用。
在本发明的一个方面,提供了一种用lyc-cow核苷酸序列生产具有牛肠源溶菌酶活性蛋白的方法,该方法包括:
(1).将分高纯化的编码具有牛肠源溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列,形成牛肠源溶菌酶蛋白的表达载体；
(2).将步聚(1)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达牛肠源溶菌酶蛋白的重组细胞:
(3).高密度培养步(2)中的重组细胞:
(4).分离出具有牛肠源溶菌酶蛋白,并将其制成冻干粉。
在本发明中,“分高的”、“纯化的”或“基本纯的”溶菌酶蛋自(或多肽)编码序列是指,该序列或片段已从天然状态下位于其两边的序列中分离出来,还指该序列或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开,而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中,术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列,如seqidno.1中核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指,位于seqidno.1序列的编码框核苷酸中,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与seqidno.1中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出seqidno.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与seqidno.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列,更佳地能在高度严紧条件下与seqidno.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外,该术语还包括与seqidno.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与牛肠源溶菌酶相同功能的蛋白的、seqidno.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1_90个,较佳地1_60个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为10个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。
获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列,可以通过人工化学合成、从现存的dna库扩增、从含有该序列的细胞、组织、器官中分离纯化得到。
在本发明中,可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体。
在本发明中,术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞,昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。
在本发明中lyc-cow的表达载体是按下述方法获得的:首先,根据seqidno1所述核苷酸序列及表达蛋白所使用的载体ppic9序列,合成如seqidno3所述核苷酸序列；将合成后的序列与pucm19t载体(上海shangon生物工程公司)连接形成lyc-cow-pucml9重组质粒。分别用限制性内切酶xhoi和ecori酶切lyc-cow-pucm19质粒和ppic9质粒并分别进行胶回收；随后用t4dna联接酶连接经过处理的目的片段和ppic9质粒；最后将连接产物转化大肠杆菌菌株dh5a,涂布lb-amp平板,酶切鉴定转化子,抽提质粒,测序验证序列的正确性。
本发明中表达-牛肠源溶菌酶的甲醇酵母表达株株是按如下方法获得的:抽提37℃培养18小时的lyc-cow-ppic9质粒,然后,用3-6ul限制性内切酶saci切割100-200ug抽提的lyc-cow-ppic9质粒3-6小时,完全酶切后用与酶切体积相等的氯仿/异戊醇溶液(两者体积之比为24:1)纯化酶切产物,之后用100％乙醇沉淀酶切的质粒,用10-30ul去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度；制备酵母gs115菌株的感受态；取经限制性内切酶saci切割后回收并定量的lyc-cow-ppic9质粒5～20ug(溶于5-10ul去离子水中),加入80ul酵母gs115感受态细胞,转至电转化杯,电击转化；转化参数为；电压1500伏,电阻200欧姆,电容25微法；电击后迅速加入800ul的1m山梨糖醇；取电击液200-600ul涂md(极限无水葡萄糖培养基)板,30℃培养至克隆长出；用50ml醇母培养基bmmy培养长出的克隆,30℃,取培养上清走sds-page电泳,筛选表达目的蛋白的克隆。
本发明中“酵母gs115菌株感受态的制备”包括如下过程,挑取酵母单菌落接种于50mlypd培养液中，30℃振荡培养至od600＝1.0～2.0。室温，5000rpm离心5min，收集菌体。8×108的细胞重悬于10ml溶液a(100mmlicl，10mmdtt，0.6msorbitol和10mmtris-hcl，ph7.5)中，室温静置30min，4℃，5000rpm离心5min，收集沉淀，然后用1.5ml的ice-cold1msorbitol重悬，离心，收集沉淀；重复以上步骤三次；最后用500μl的ice-cold1msorbitol重悬，置冰上备用。
本发明中毕赤酵母感受态细胞的电转化具体步骤为：取重悬在ice-cold1msorbitol中的酵母感受态细胞80μl(约1010cells/ml)与3μg的线性化dna混合，冰上放置5min(注意：质粒的体积应控制在10μl以内，体积太大会影响转化效率)；将混合物加入ice-cold的0.2cm电转杯中，电转参数为：电压2000v，电容25uf，电阻200ω，电转时间5ms。转化结束后，立即加入0.5ml的ice-cold1msorbitol混匀；从电转杯中将液体吸出，转移到eppendorf管中，30℃静置1小时；然后加入1mlydp培养基，30℃，振荡培养4小时，取适量菌液涂布于md平板；同时转化空质粒ppic9k作为表达的阴性对照。
本发明中“md培养基”按如下方法配制:1.34％酵母氮源(ynb)，2％葡萄糖，4×10-4g/l生物素，1.5％琼脂粉。用于筛选菌株的表现型；每20ml倒一块板；各成份的配制如下:ioxynb:·称34gynb,100g(nh4)2so4用水配成1升溶液,用0.22微米的膜过滤灭苗。500xb:称20mg生物素溶于100ml水中,用0.22微米的膜过滤灭菌；10xd:溶解200g无水葡萄糖于1000ml水中,用0.22微的膜过滤灭菌。
本发明中mut+和muts转化子筛选的具体步骤为：挑取md平板上的his+转化子200个，接种至含有200μlypd的96孔板中，30℃，培养24小时。每孔取1μl菌液点样于mm和md平板上，30℃，培养至白色菌落出现，对比观察，若在md和mm平板上生长均良好的克隆即mut+表型；若md平板上生长良好而在mm平板上生长不良或不长的克隆即为muts表型。
本发明中多拷贝转化子筛选的具体步骤为：重组质粒插入酵母基因组会发生多拷贝插入，一般概率为1～10％，高拷贝插入可能会伴随着高蛋白表达，利用g418不同浓度的抗性可筛选出相对应的拷贝数，取培养在96孔板中的不同克隆，每孔取1μl点在含g418浓度为0.5，1，2，3，4，5mg/ml的ypd平板上。30℃，培养72小时。
本发明中ypd按如下方法配置(1升):1％yeastextract(酵母提取物)；2％peptone(蛋白胨)；2％dextrose(无水葡萄糖)。称10gyeastextract,20gpeptone,20gdextrose,溶于1000ml水中,115℃灭菌20分钟。
本发明中“bmmy培养基”按如下方法配制:1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％酵母氮源，4×10-4g/l生物素，0.5％甲醇。121℃高压灭菌20min，4℃保存。用于诱导表达。
本发明中“bmgy培养基”按如下方法配制:1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％酵母氮，4×10-4g/l生物素，1％甘油。121℃高压灭菌20min，4℃保存。用于诱导表达前菌体的生长。
本发明中的“接种”包括一级接种和二级接种；“一级接种”是指将筛选到的高表达酵母菌株接种于ypd培养基,30℃,250转/分揺床培养36小时；本发明中的“二级接种”即将培养36小时的醇母菌转至bmgy培养基(初始发酵体积的5～10％),30℃,250转/分培养至od6oo＝2～6,离心,弃上清,用25～50％培养体积的水重新悬浮细胞。
本发明中的“上罐发酵"即将配制好的基本盐培养基(50％发酵罐体积)倒入罐中,通热蒸气121℃灭菌20分钟,冷至29℃,用氨水调ph至5-6,加入ptm4-5ml/l基本盐培养基。倒入上述的悬浮细胞,在29℃、400转/分、0.2-0,4氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟条件下培养。
本发明中的“饲喂甘油"是指在上述培养24小时后,以18-20ml/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入50％甘油,时间是4-6小时，搅拌速度提高到600转/分；须注意检测发酵液中的溶解氧气浓度,当溶解氧气浓度低于20％时,停止加入甘油，当溶解氧气浓度回升到20％以上时,恢复甘油供给。
本发明中的“饲喂甲醇"是指停止泵入甘油后,当溶解氧气浓度升高到40％时,开始泵入甲醇溶液,速度为2-3ml/升(起始发酵液体积)/小时，当溶解氧气浓度下降到30％后,提高甲醇速度至5-8ml/升(起始发酵液体积)/小时；当將解氧气浓度下降到20％以上时,提高甲醇速度至10ml/升(起始发酵液体积)/小时；维持此甲醇速度至发酵结束；加入甲醇的时间为3-6天，搅拌速度提高到800-1500转/分,通气量提高到甲醇的时间为3-6天，搅拌速度提高到800-1500转/分,通气量提高到0.6--2氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟；注意检测发酵液中的溶解氧气浓度,当溶解氧气浓度低于20％时,停止加入甲醇，当溶解氧气浓度回升到20％以上时,恢复甲醇供给。
本发明中牛肠源溶菌酶蛋白分离纯化包括以下步骤:首先,发酵结束后,4000转/分离心发酵液,收集上清，然后将发酵上清装入透析袋中,对去高子水透析去盐,4℃下24小时，过港将透析过的发酵上清用0.45微米的膜过滤,然后用naoh溶液调ph至8.0。随后进行纯化过程。
本发明中的纯化过程包括：(1)装柱:以每升发酵液10毫升cm-sephroseff装柱,用0.05mtris-hclph8.0平衡柱子5-8个柱床体积；(2)上样:将发酵液以10-100毫升/分钟的流速上柱；(3)清洗:上样结束后,用0.05mtris-hclph8.0洗脱未结合的蛋白,共洗脱4个柱床体积:(4)洗脱:用含有0.15-0.20mnacl的0.05mtris_hclph8.0溶液洗脱；(5)透析:将洗脱液对去离子水4℃透析24小时；(6)低温喷干。
在本发明中,“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少80％,最佳地至少90％(按干重或湿重计)a纯度可以用任何合适的方法进行测量,如用柱层析、page或hplc法测量多肽的纯度；基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中,术语“溶菌酶蛋白多肽”指具有溶菌酶蛋白活性的seqidno.4序列的多肽。该多肽的氨基酸序列与seqidno2中的氨基酸序列相比缺少氨基端19个氨基酸残基,即1-19位的氨基酸，该19个氨基酸是seqidno2所编码蛋白的分泌肽序列,在蛋白的生物合成过程中被自行切除；该术语还包括具有与牛肠源溶菌酶相同功能的、seqidno.4序列的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸；例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能；又比如,在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括溶菌酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
所述多肽的变异形式包括:同源序列、等位变异体、天然突变体，以及利用抗溶菌酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含溶菌酶多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了溶菌酶多肽的可溶性片段。通常,该片段具有溶菌酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸,通常至少约30个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供將溶菌酶蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然溶菌酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之；这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体，诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术；类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d一氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、γ一氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或甲基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列；还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
另一方面，本发明提供了编码牛肠源溶菌酶蛋白的dna分子的应用,该牛肠源溶菌酶蛋白即通过本发明的的生产方法获得；该牛肠源溶菌酶蛋白可以作为抗感染制剂。
例如，将所述的牛肠源溶菌酶蛋白作为抑菌的饲料添加剂。
或者，如实施例中所示，将所述的牛肠源溶菌酶蛋白作为抑菌性和抗炎症添加剂。
本发明的牛肠源溶菌酶蛋白属于溶菌酶家族一员。溶菌酶是分解粘多糖的多肽类免疫抗菌分子，它具有耐热、耐酸的理化特性,可溶于水、乙醇、油脂类溶剂,通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。本发明人工牛肠源溶菌酶(蛋白序列号，np_001007806，ncbi，thenationalcenterforbiotechnologyinformation)的基因，经过百余次的次筛选和测试，获得了比市场上生物活性更好牛源溶菌酶的dna序列。基因重组表达技术生产的溶菌酶蛋白表达量约1.75g/l，活性最高为48970u/ml，在大规模发酵时，相比鸡源溶菌酶具有较大的成本和稳定性方面的优势，达到了工业化生产的要求。对本发明获得的牛肠源溶菌酶进行杀菌能力测试，结果表明:牛肠源溶菌酶和商品化的鸡源溶菌酶杀菌能力相近，可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌等自然界常见细菌；同时，在相同的比活性时，牛肠源溶菌酶对葡萄球菌杀菌能力强于鸡源溶菌酶；饲喂含有牛肠源溶菌酶制剂的饲料后，奶牛的临床乳房炎和隐形乳房炎均有明显改善。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
具体实施方式
实施例1
将seqidno1中所述核苷酸序列与pucm19t载体连接,形成lyc-cow重组质粒。取200ug,然后用6ul限制性内切酶saci切割3小时,完全酶切后用氯仿/异戊醇將液纯化,之后用100％乙醇沉淀,用1ml去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度；取经限制性内切酶saci切割后回收并定量的lyc-cow-ppic9质粒9ug(落于10ul去离子水中),加入80ul酵母gs115感受态细胞,电击转化，取电击液400ul涂md板,30℃培养至克隆长出，用50ml醇母培养基bmmy培养长出的克隆并走sds-page电泳,筛选出表达目的蛋白的克隆；
如本发明所述方法高密度发酵生产牛肠源溶菌酶,其中,二级接种时将初始发酵体积的10％的酵母菌转至bmgy培养基,30℃,250转/分培养至od600＝6,离心,弃上清,用30％培养体积的水重新悬浮细胞；上罐时,将溶液酸度调至ph＝6后保持不变；加入甘油时,以18ml/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入；泵入甲醇溶液,速度为2.5ml/升(起始发酵液体积)/小时；
在牛肠源溶菌酶纯化过程中,发酵液上样速度为10毫升/分钟，随后按照本发明所述方法分离纯化,得到牛肠源溶菌酶蛋白。
实施例2制备表达-牛肠源溶菌酶的甲醇酵母表达株
抽提37℃培养18小时的lyc-cow-ppic9质粒,然后,用3-6ul限制性内切酶saci切割100-200ug抽提的lyc-cow-ppic9质粒3-6小时,完全酶切后用与酶切体积相等的氯仿/异戊醇溶液(两者体积之比为24:1)纯化酶切产物,之后用100％乙醇沉淀酶切的质粒,用10-30ul去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度；制备酵母gs115菌株的感受态，取经限制性内切酶saci切割后回收并定量的lyc-cow-ppic9质粒5～20ug(溶于5-10ul去离子水中),加入80ul酵母gs115感受态细胞,转至电转化杯,电击转化，转化参数为；电压1500伏,电阻200欧姆,电容25微法。电击后迅速加入800ul的1m山梨糖醇，取电击液200-600ul涂md(极限无水葡萄糖培养基)板,30℃培养至克隆长出，用50ml醇母培养基bmmy培养长出的克隆,30℃,取培养上清走sds-page电泳,筛选表达目的蛋白的克隆。
实施例3毕赤酵母感受态细胞的电转化
取重悬在ice-cold1msorbitol中的酵母感受态细胞80μl(约1010cells/ml)与3μg的线性化dna混合，冰上放置5min(注意：质粒的体积应控制在10μl以内，体积太大会影响转化效率)。将混合物加入ice-cold的0.2cm电转杯中。电转参数为：电压2000v，电容25uf，电阻200ω，电转时间5ms。转化结束后，立即加入0.5ml的ice-cold1msorbitol混匀。从电转杯中将液体吸出，转移到eppendorf管中，30℃静置1小时。然后加入1mlydp培养基，30℃，振荡培养4小时，取适量菌液涂布于md平板。同时转化空质粒ppic9k作为表达的阴性对照；
其中,“md培养基”按如下方法配制:1.34％酵母氮源(ynb)，2％葡萄糖，4×10-4g/l生物素，1.5％琼脂粉。用于筛选菌株的表现型。每20ml倒一块板。各成份的配制如下:ioxynb:·称34gynb,100g(nh4)2s04用水配成1升溶液,用0.22微米的膜过滤灭苗。500xb:称20mg生物素溶于100ml水中,用0.22微米的膜过滤灭菌。10xd:溶解200g无水葡萄糖于1000ml水中,用0.22微的膜过滤灭菌；
其中，mut+和muts转化子筛选的具体步骤为：挑取md平板上的his+转化子200个，接种至含有200μlypd的96孔板中，30℃，培养24小时。每孔取1μl菌液点样于mm和md平板上。30℃，培养至白色菌落出现。对比观察，若在md和mm平板上生长均良好的克隆即mut+表型；若md平板上生长良好而在mm平板上生长不良或不长的克隆即为muts表型；
其中多拷贝转化子筛选的具体步骤为：重组质粒插入酵母基因组会发生多拷贝插入，一般概率为1～10％，高拷贝插入可能会伴随着高蛋白表达。利用g418不同浓度的抗性可筛选出相对应的拷贝数。取培养在96孔板中的不同克隆，每孔取1μl点在含g418浓度为0.5，1，2，3，4，5mg/ml的ypd平板上。30℃，培养72小时；
其中ypd按如下方法配置(1升):1％yeastextract(酵母提取物)；2％peptone(蛋白胨)；2％dextrose(无水葡萄糖)。称10gyeastextract,20gpeptone,20gdextrose,溶于1000ml水中,115℃灭菌20分钟；
其中“bmmy培养基”按如下方法配制:1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％酵母氮源，4×10-4g/l生物素，0.5％甲醇。121℃高压灭菌20min，4℃保存，用于诱导表达；
其中“bmgy培养基”按如下方法配制:1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％酵母氮，4×10-4g/l生物素，1％甘油。121℃高压灭菌20min，4℃保存。用于诱导表达前菌体的生长。
实施例4高表达酵母菌株接种
“接种”包括一级接种和二级接种，“一级接种”是指将筛选到的高表达酵母菌株接种于ypd培养基,30℃,250转/分揺床培养36小时，本发明中的“二级接种”即将培养36小时的醇母菌转至bmgy培养基(初始发酵体积的5～10％),30℃,250转/分培养至od6oo＝2～6,离心,弃上清,用25～50％培养体积的水重新悬浮细胞；
其中,“上罐发酵"即将配制好的基本盐培养基(50％发酵罐体积)倒入罐中,通热蒸气121℃灭菌20分钟,冷至29℃,用氨水调ph至5-6,加入ptm4-5ml/l基本盐培养基。倒入上述的悬浮细胞,在29℃、400转/分、0.2-0,4氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟条件下培养；
“饲喂甘油"是指在上述培养24小时后,以18-20ml/小时/升(起始发酵液体积)的速度泵入50％甘油,时间是4-6小时。搅拌速度提高到600转/分。须注意检测发酵液中的溶解氧气浓度,当溶解氧气浓度低于20％时,停止加入甘油。当溶解氧气浓度回升到20％以上时,恢复甘油供给；
“饲喂甲醇"是指停止泵入甘油后,当溶解氧气浓度升高到40％时,开始泵入甲醇溶液,速度为2-3ml/升(起始发酵液体积)/小时。当溶解氧气浓度下降到30％后,提高甲醇速度至5-8ml/升(起始发酵液体积)/小时。当將解氧气浓度下降到20％以上时,提高甲醇速度至10ml/升(起始发酵液体积)/小时。维持此甲醇速度至发酵结束。加入甲醇的时间为3-6天。搅拌速度提高到800-1500转/分,通气量提高到甲醇的时间为3-6天。搅拌速度提高到800-1500转/分,通气量提高到0.6--2氧气体积/升(起始发酵液体积)分钟，注意检测发酵液中的溶解氧气浓度,当溶解氧气浓度低于20％时,停止加入甲醇，当溶解氧气浓度回升到20％以上时,恢复甲醇供给。
实施例5牛肠源溶菌酶蛋白分离纯化
首先,发酵结束后,,4000转/分离心发酵液,收集上清。然后将发酵上清装入透析袋中,对去高子水透析去盐,4℃下24小时。过港将透析过的发酵上清用0.45微米的膜过滤,然后用naoh溶液调ph至8.0。随后进行纯化过程；
本发明中的纯化过程包括(1)装柱:以每升发酵液10毫升cm-sephroseff装柱,用0.05mtris-hclph8.0平衡柱子5-8个柱床体积；(2)上样:将发酵液以10-100毫升/分钟的流速上柱；(3)清洗:上样结束后,用0.05mtris-hclph8.0洗脱未结合的蛋白,共洗脱4个柱床体积:(4)洗脱:用含有0.15-0.20mnacl的0.05mtris_hclph8.0溶液洗脱；(5)透析:将洗脱液对去离子水4℃透析24小时；(6)低温喷干。
实施例6牛肠源溶菌酶的抑菌活性检测结果
以无菌生理盐水，和sigma的商品化鸡源溶菌酶作为对照，采用牛津杯法检测牛肠源溶菌酶对测试菌株的抑菌作用，同时用微量肉汤稀释法检测牛肠源溶菌酶的mic和mbc，结果表明，重组牛肠源溶菌酶对所测的供试菌的抑菌作用存在差异，其中，对多杀性巴氏杆菌，致病性大肠埃希氏菌，白色念珠菌，牛肠源溶菌酶比sigma的商品化鸡源溶菌酶的抗菌效果好(抑菌环大)，如表1所示.同时在用微量肉汤稀释法时，结果显示，在对抗致病性大肠埃希氏菌多杀性巴氏杆菌，致病性大肠埃希氏菌，白色念珠菌，其相应mbc优于sigma的鸡源溶菌酶标品。
表1牛津杯法检测溶菌酶的抑菌活性(单位：mm)
表
2.溶菌酶对检测菌株的mic和mbc(单位：μg/ml)
实施例7
按萧乾庆(《中国奶牛》,1997(4):17-18)等cmt试验，将牛乳腺红肿明显、乳汁中有凝乳块、cmt为+++之乳区判定为临床乳房炎,同时将无明显临床症状但cmt为+++、++、+、±和-的乳区分别判定为隐性乳房炎强阳性、阳性、弱阳性、可疑和阴性。在治疗试验中,将治疗后cmt结果从原来的+++降低至++或+,或从++降低至+为有效,从原来的+++、++和+降低至-为治愈。选择泌乳期cmt检查阳性(+)及以上牛共计60头,按发病乳区随机分为3组,饲喂含有牛肠源溶菌酶制剂的饲料。每天饲喂牛肠源溶菌酶制剂2克每头。从试验开始至试验结束，每天进行一次cmt检查。试验期为7d，在无菌操作的条件下,将50μl奶样与450μllb培养液混合,再取50μl稀释液于灭菌试管中,立即加入5ml溶化且平衡至47℃的相应琼脂培养基,摇匀后立即倾注于相应的琼脂平板中,37℃培养24h后分别，计算琼脂平板上的菌落数，结果表明：使用牛肠源溶菌酶治疗7d,治愈率为66％～80.00％.与对照组有明显差异。
本发明所涉及的序列如下:
(1)seqidno.1的信息:
(i)序列特征
(a)长度:444bp
(b)类型:核酸
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cdna
(iii)序列推述:seqidno.1
atgaaggctgttttgattttgggtttgttgttgttgtctgttactgttcaaggtaagaagttcgaaaagtgtgaattggctagaactttgagaagatacggtttggatggttacaagggtgtttctttggctaactggatgtgtttgacttacggtgaatctagatacaacactagagttactaactacaacccaggttctaagtctactgattacggtattttccaaattaactctaagtggtggtgtaacgatggtaagactccaaaggctgttaacggttgtggtgtttcttgttctgctatgttgaaggatgatattactcaagctgttgcttgtgctaagactattgtttctagacaaggtattactgcttgggttgcttggaagaacaagtgtagaaacagagatgtttcttcttacattagaggttgtaagttgtga
(2)seqidno.2的信息:
(i)序列特征
(a)长度:147个氨基酸
(b)类型：氨基酸
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(iii)序列描述:seqidno.2
mkavlilgllllsvtvqgkkfekcelartlrrygldgykgvslanwmcltygesryntrvtnynpgskstdygifqinskwwcndgktpkavngcgvscsamlkdditqavacaktivsrqgitawvawknkcrnrdvssyirgckl
(3)seqidno.3的(i)序列特征
(a)长度·390碱基
(b)类型:核酸
(c)链性:单链
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(iii)序列描述:seqidno.3
aagaagttcgaaaagtgtgaattggctagaactttgagaagatacggtttggatggttacaagggtgtttctttggctaactggatgtgtttgacttacggtgaatctagatacaacactagagttactaactacaacccaggttctaagtctactgattacggtattttccaaattaactctaagtggtggtgtaacgatggtaagactccaaaggctgttaacggttgtggtgtttcttgttctgctatgttgaaggatgatattactcaagctgttgcttgtgctaagactattgtttctagacaaggtattactgcttgggttgcttggaagaacaagtgtagaaacagagatgtttcttcttacattagaggttgtaagttgtga
(4)seqidno.4的信息:
(i)序列特征
(a)长度:129个氨基酸
(b)类型:氨基酸
(c)链性:单链
(d)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(iii)序列描述:seqidno.4
kkfekcelartlrrygldgykgvslanwmcltygesryntrvtnynpgskstdygifqinskwwcndgktpkavngcgvscsamlkdditqavacaktivsrqgitawvawknkcrnrdvssyirgckl
序列表
<110>上海复华兴生物技术有限公司
<120>一种新的牛肠源溶菌酶蛋白的dna序列及其生产工艺和应用
<130>20171001
<141>2017-11-22
<160>4
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<210>1
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