本发明涉及一种透明质酸钠凝胶技术领域，具体涉及一种交联透明质酸钠生物膜的制备方法。
背景技术：
透明质酸是重复二塘结构单元β-d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖相互标题链接构成的线性黏多糖。透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。由于透明质酸具有粘弹性分离、粘弹性保护和粘弹性填充等特性，已使其在普外科和妇产科防止术后粘连的临床医学以及烧伤、创伤和整形外科等医学领域中得到广泛应用。但是由于天然透明质酸在体内容易降解，在体内长期存留，难以发挥其优异的物理化学特性，往往会限制其疗效的发挥。近年来在预防粘连和软组织填充等方面的应用，要求透明质酸在人体内应具有较长的存留时间，有时甚至要求在体内长期存留。通常为了获得较长时间有效的透明质酸钠填充物，采用修饰和交联的方法对透明质酸分子进行改造，改变透明质酸的某些属性。交联透明质酸钠凝胶同时是将透明质酸与交联剂在水溶液中搅拌混合，通过交联剂使透明质酸钠高分子链间化学键和来制备。所用的交联剂，当凝胶在生物体内分解后，残留的交联剂成分对生物体来说被识别为异物，引发炎症等不良影响。因此，为确保生物体适合性，需要制备低的交联度的凝胶。但是，常规的交联方法，如果减少交联剂的添加量，所得的凝胶粘弹性降低，不柔软。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种交联透明质酸钠生物膜的制备方法，交联后的透明质酸钠生物膜具有比较稳定的网状结构，能有效的提高透明质酸的抗降解性、延长体内存留时间。
本发明提供的技术方案是交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将透明质酸钠干粉溶解于氢氧化钠溶液中，加入透明质酸钠干粉重量0.01～0.05％的聚乙二醇，在35～50℃下保温5～8h,得到凝胶x；
2)将凝胶x在500～1000mpa下压制1～3min；
3)调节压制后的凝胶x的ph值至中性，加入磷酸盐缓冲液溶胀18～36h；
4)将溶胀后的凝胶x降温至-4℃，并保温处理1～3h,冷冻干燥，压制成膜，得到透明质酸钠生物膜。
步骤1)中，氢氧化钠溶液的质量浓度为10～20％。氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的质量百分比为10～20％。聚乙二醇的用量为透明质酸钠重量的0.02％。
步骤2)中，凝胶x尚未经过平衡和溶胀阶段，还处于不稳定阶段，而且本申请中交联剂的添加量较少，透明质酸钠和交联剂之间的交联度还不充分，此时对凝胶x进行高压处理，可以促进高分子链段沿着压力方向取向形成更加杂乱排列，导致高分子链段互相缠结相互穿透，进一步形成搭接紧密的三维网状结构。
步骤3)中，溶胀温度为40～50℃。溶胀时间为24h。
步骤4)中，由于步骤2)的高压作用，促进高分子链互相缠结形成稳定的三维网状结构，与此同时，交联剂的少量添加，导致高分子链交联十分紧密，高分子链的自由链端也发生了互相缠结，这会导致凝胶网络产生缺陷而降低弹性。因此，本申请将凝胶x降温至-4℃，并保温处理1～3h,可以使大分子链进行构象调整，链的局部运动平行地排起来，促使高分子链的自由端解缠结，使得成品生物膜柔软。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明交联后的透明质酸钠生物膜具有比较稳定的网状结构，能有效的提高透明质酸的抗降解性、延长体内存留时间。
2)本发明添加少量交联剂即可得到十分稳定的网状结构，而且凝胶柔软性好。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)将透明质酸钠干粉溶解于质量浓度为10％的氢氧化钠溶液中，加入透明质酸钠干粉重量0.01％的聚乙二醇，在35℃下保温5h,得到凝胶x；
2)将凝胶x在500mpa下压制1min；
3)调节压制后的凝胶x的ph值至中性，加入磷酸盐缓冲液，在40℃下溶胀18h；
4)将溶胀后的凝胶x降温至-4℃，并保温处理1h,冷冻干燥，压制成膜，得到透明质酸钠生物膜。
1、耐酶性测试方法：精密称取上述凝胶，加入到0.1mogl/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)5ml和透明质酸酶液(100u/ml)5ml，混合均匀，置于37℃水浴中酶解24h，然后在100℃煮沸10min灭活。0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液1.0ml，加水定容至10ml。采用改良咔唑显色法测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为加入酶液的样品中交联透明质酸钠的含量a；未加酶样品中的交联透明质酸钠含量为b，计算酶降解率＝a/b×100％。酶降解率越低，表明凝胶的耐酶性越好，凝胶在体内填充的维持时间越长。
2、动力黏度测定：采用旋转式黏度计测定法，按照《中华人民共和国药典》(2010版)二部附录vig第二法测定，在剪切速率不小于0.25hz,(25±0.1)℃条件下，根据在旋转过程中作用于液体介质中的切应力大小完成测定，并以下式计算凝胶的动力黏度：
η＝k·(t/ω)
式中：k为用已知黏度的标准液测得的旋转式黏度计常数；
t为扭力矩；
ω为角速度。
3、特性黏数测定：采用乌氏粘度计测定特性黏数，根据《中华人民共和国药典》(2010版)二部附录vig第三法测定。
经检测，透明质酸钠生物膜的酶降解率为3.5％，动力黏度为50.8×104mpa·s，特性黏数为4661.8cm3/g。
对照例1
1)将透明质酸钠干粉溶解于质量浓度为10％的氢氧化钠溶液中，加入透明质酸钠干粉重量0.01％的聚乙二醇，在35℃下保温5h,得到凝胶x；
2)调节凝胶x的ph值至中性，加入磷酸盐缓冲液，在40℃下溶胀18h,冷冻干燥，压制成膜，得到透明质酸钠生物膜。
按照实施例1的方法进行检测，透明质酸钠生物膜的酶降解率为13.2％,动力黏度为25.1×104mpa·s，特性黏数为2682.6cm3/g。
实施例2
1)将透明质酸钠干粉溶解于质量浓度为20％的氢氧化钠溶液中，加入透明质酸钠干粉重量0.05％的聚乙二醇，在50℃下保温8h,得到凝胶x；
2)将凝胶x在1000mpa下压制3min；
3)调节压制后的凝胶x的ph值至中性，加入磷酸盐缓冲液，在50℃下溶胀36h；
4)将溶胀后的凝胶x降温至-4℃，并保温处理3h,冷冻干燥，压制成膜，得到透明质酸钠生物膜。
按照实施例1的方法进行检测，透明质酸钠生物膜的酶降解率为3.8％,动力黏度为56.1×104mpa·s，特性黏数为4589.7cm3/g。
实施例3
1)将透明质酸钠干粉溶解于质量浓度为15％的氢氧化钠溶液中，加入透明质酸钠干粉重量0.02％的聚乙二醇，在45℃下保温6h,得到凝胶x；
2)将凝胶x在800mpa下压制2min；
3)调节压制后的凝胶x的ph值至中性，加入磷酸盐缓冲液，在45℃下溶胀24h；
4)将溶胀后的凝胶x降温至-4℃，并保温处理2h,冷冻干燥，压制成膜，得到透明质酸钠生物膜。
按照实施例1的方法进行检测，透明质酸钠生物膜的酶降解率为3.3％,动力黏度为58.9×104mpa·s，特性黏数为4739.4cm3/g。
实施例4
1)将透明质酸钠干粉溶解于质量浓度为10％的氢氧化钠溶液中，加入透明质酸钠干粉重量0.05％的聚乙二醇，在35℃下保温8h,得到凝胶x；
2)将凝胶x在500mpa下压制3min；
3)调节压制后的凝胶x的ph值至中性，加入磷酸盐缓冲液，在40℃下溶胀36h；
4)将溶胀后的凝胶x降温至-4℃，并保温处理1h,冷冻干燥，压制成膜，得到透明质酸钠生物膜。
按照实施例1的方法进行检测，透明质酸钠生物膜的酶降解率为3.4％,动力黏度为55.6×104mpa·s，特性黏数为4553.1cm3/g。