用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法与流程

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法。
背景技术：
：肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)于1881年首次由巴斯德分离出，是大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎的主要致病源之一，它也能引起中耳炎、鼻窦炎和菌血症等。肺炎链球菌感染是在全球范围内引起死亡的重要原因之一。美国有资料显示，估计每年有40～50万人患肺炎球菌性肺炎，病死率为5％～10％。在用疫苗可预防儿童死亡的疾病中，肺炎链球菌引起的疾病排名第一。随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，医学界再次关注疫苗的研发。肺炎球菌目前已发现90多种血清型。其细菌表面荚膜具有抗原性，再将肺炎球菌多糖共价连接到载体蛋白使之成为胸腺依赖性(td)抗原，能够对婴幼儿和老人产生抗体，免疫效果有效提高。现有疫苗均是提取其荚膜多糖为原料制得。自肺炎疫苗研发以来，由于其荚膜多糖产量较低，只有通过尽量扩大生产规模，以达到提高多糖产量的目的，因此生产成本较高。提高多糖产量可从筛选优质菌种、优化发酵工艺、优化纯化工艺等关键工序着手。筛选荚膜较厚的菌种，即是关键工艺之一，从源头上解决这一问题。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是培养基培养肺炎链球菌获得的荚膜多糖产量较低，目的在于提供用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，提供了一种组简化的培养基用于菌种的培养，以及适宜的培养方法，通过本发明提供的方式筛选出荚膜较厚的菌种，在以前的基础上提高了约80％的荚膜多糖产量，并且多糖经检验符合欧洲药典标准，大大提高了多糖产量，提高了生产效率、降低了成本。本发明通过下述技术方案实现：用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，包括以下步骤：步骤1，配制液体培养基：称取以下原料，采用注射用水对上述原料依次进行溶解，将采用注射用水溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节ph值，除菌后获得液体培养基：溶剂为注射用水的相对用量为1000ml：含氮源为：胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中的任意三种组合物；碳源为：葡萄糖：5.0～50g；盐类为：k2hpo4：0～12.0g，kcl：0～7.0g，na2hco3：0～5.0g，nacl：3.0～10.0g，mgso4·7h2o：0.4～5.0g，cacl2：0～0.14g；微量元素为：l-半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，feso4：2.5～6.5mg；步骤2，配制固体培养基：称取琼脂10～15g，加注射用水溶解后定容到所需体积的90％，溶解后的溶液进行湿热灭菌，冷却后备用；称取以下原料，采用注射用水进行溶解，将溶解后的混合溶液进行定容到所需体积，并调节ph值、除菌处理，最后加入琼脂培养基中，倒入平皿，制得固体培养基溶剂；为水的相对用量为1000ml：含氮源为胰酪胨：15～80g，胰胨：20～70g，精选大豆胨：10～80g，大豆胨：10～80g，酸水解酪蛋白：10～70g，酵母提取物：15～40g，酵母浸粉：5～40g中任意三种；碳源为葡萄糖：5.0～50g；盐类为k2hpo4：0～12.0g，kcl：0～7.0g，na2hco3：0～5.0g，nacl：3.0～10.0g，mgso4·7h2o：0.4～5.0g，cacl2：0～0.14g；微量元素为l-半胱氨酸盐酸盐：0.12～1.80g，烟酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，feso4：2.5～6.5mg；步骤3，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用所述步骤1制备的液体培养基溶解菌块后，接种步骤1制备的液体培养基2～20ml，35℃～37℃、co2通气量为60％～100％，静置培养4～10h，获得一代菌种；步骤4，二代培养：将一代菌液转接于步骤2制备的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，35℃～37℃、co2通气量为60％～100％，静置培养36～48h，获得二代菌种；步骤5，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落15～20颗，分别接种于步骤1制备的液体培养2～5ml中，编号、培养，培养温度为35℃～37℃、co2通气量为60％～100％，培养时间为8～17h，培养至菌液明显浑浊时停止培养，获得三代菌种；步骤6，荚膜染色、革兰氏染色：取各编号对应培养后菌液，用墨汁染色法、龙胆紫或沙黄染液染色后镜检，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留1～5组，其余荚膜薄的菌种对应编号的菌液废弃；重复步骤3、步骤4和步骤5，再次分离筛选，则筛选出的纯菌种；步骤7，四代培养：将荚膜厚的菌液按10％接种量转步骤1制备的液体培养基，进行四代扩增培养，培养温度为35℃～37℃、co2通气量为60％～100％，培养时间为2～5h，待菌液明显浑浊、od600≥0.5时收获；步骤8，菌种收获、保存：将菌液离心，收集菌体沉淀保存于10％～30％甘油中，分装，置于液氮中保存。优选地，所述步骤1中，将所述原料均加入同一容器内，然后向盛由原料混合物的容器中在不断搅拌条件下加入注射用水；在添加完注射用水后，进行加热溶解，加热溶解步骤为：先以1℃/min的升温速率由25℃升温至30℃，在30℃温度条件下保持10min，然后以1℃/min的升温速率由38℃升温至35℃，在38℃温度条件下保持5min。优选地，所述步骤1和步骤2中，均采用质量浓度为10％的naoh溶液调节ph值至7.0～7.8。优选地，所述步骤1中，在无菌操作条件下经0.1μm的过滤减压过滤除菌。优选地，所述步骤2中，向琼脂中加入注射用水并升温至95℃进行溶解；所述步骤2中将琼脂溶液冷却至55～60℃备用。优选地，所述步骤2中，湿热灭菌具体操作为：湿热灭菌温度为117～122℃，压强为0.09～0.12mpa，灭菌时间为15～30min。优选地，所述步骤2中，用注射用水溶解原理的除菌处理为：在无菌操作条件下经0.2μm的过滤减压过滤除菌。优选地，所述菌种采用于肺炎链球菌1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f共24个血清型。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果本发明用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，本发明提供了一种用于肺炎荚膜多糖规模化生产的菌种筛选方法，既能在菌种传代时进行良好的扩增培养，用于发酵培养后，其产糖量也较高；本发明提供的利用此液体和固体培养基筛选肺炎链球菌菌种的方法能明显缩短筛选培养的代次，筛选后的菌种活性好、荚膜较厚，菌液浓度和多糖产量都明显提高。具有操作简单、快速、取材容易、降低染菌风险的优点。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为筛选前显微镜油镜图；图2为本发明筛选后显微镜油镜图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例1～3本发明提供了一种用于肺炎链球菌的液体培养基配方，如表1所示：表1实施例1～3肺炎链球菌的液体培养基配方物料名称实施例1实施例2实施例3氮源1胰酪胨15g胰胨25g酸水解酪蛋白35g氮源2大豆胨20g精选大豆胨40g精选大豆胨45g氮源3酵母提取物30g酸水解酪蛋白10g酵母浸粉5g葡萄糖10g22g31gk2hpo410.0g4.3g7.5gkcl3.4g5.2g1.8gna2hco32.0g5.0g4.1gnacl4.0g6.5g9.0gmgso4·7h2o0.5g2.5g3.4gcacl20.02g0.09g0.12gl-半胱氨酸盐酸盐0.18g1.2g0.8g烟酸0.6mg1.0mg0.8mg腺嘌呤6.0mg8.5mg10.0mgfeso43.6mg4.5mg5.7mgph7.27.57.7实施例4～6本发明提供了一种用于肺炎链球菌的固体培养基配方，如表2所示：表2实施例4～6肺炎链球菌的液体培养基配方实施例7本发明提供了一种筛选肺炎链球菌的方法，具体步骤为：步骤1，菌种开启于液体，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用实施例1提供的液体培养基溶解菌块后，接种于实施例1提供的液体培养基20ml，35℃、co2通气量为60％，静置培养9h，获得一代菌种；步骤2，固体划线分离，二代培养：将一代菌液转接于实施例4体用的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，37℃、co2通气量为70％，静置培养41h，获得二代菌种；步骤3，传液体，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落，接种于实施例1提供了2ml液体培养中；同法挑取单菌落20颗分别接种液体培养基中，编号、培养，培养温度为35℃、co2通气量为90％，培养时间为13h，培养至菌液明显浑浊时停止培养，获得三代菌种；4.荚膜染色、革兰氏染色：取各编号培养后菌液，用墨汁染色法(沙黄染液)染色后镜检，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留2组，其余荚膜薄的菌种对应编号的菌液废弃；5.传液体扩增，四代培养：将荚膜厚的菌液按10％接种量转实施例1液体培养基，进行四代扩增培养，培养温度为37℃、co2通气量为100％，培养时间为2.5h，收获时菌液明显浑浊、od600为0.73；6.菌种收获、保存：将菌液离心，收集菌体沉淀保存于30％甘油中，分装，置于液氮中保存。实施例8：本发明提供了一种筛选肺炎链球菌的方法，具体步骤为：步骤1，菌种开启于液体，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用实施例2液体培养基溶解菌块后，接种于本发明液体培养基10ml，36℃、co2通气量为80％，静置培养8h，获得一代菌种；步骤2，固体划线分离，二代培养：将一代菌液转接于实施例5体用的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，36℃、co2通气量为60％，静置培养38h，获得二代菌种；步骤3，传液体，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落，接种于实施例2提供的5ml液体培养中；同法挑取单菌落15颗分别接种液体培养基中，编号、培养，培养温度为36℃、co2通气量为80％，培养时间为11h，培养至菌液明显浑浊时停止培养，获得三代菌种；步骤4，荚膜染色、革兰氏染色：取各编号培养后菌液，用墨汁染色法(龙胆紫染液)染色后镜检，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留1组，其余荚膜薄的菌种对应编号的菌液废弃；步骤5，传液体扩增，四代培养：将荚膜厚的菌液按10％接种量转实施例2停的液体培养基，进行四代扩增培养，培养温度为36℃、co2通气量为80％，培养时间为3h，收获时菌液明显浑浊、od600为0.53；步骤6，菌种收获、保存：将菌液离心，收集菌体沉淀保存于20％甘油中，分装，置于液氮中保存。实施例9本发明提供了一种筛选肺炎链球菌的方法，具体步骤为：步骤1，菌种开启于液体，一代培养：启开肺炎链球菌工作种子批菌种，用实施例3体用的液体培养基溶解菌块后，接种于本发明液体培养基8ml，37℃、co2通气量为100％，静置培养5h，此为一代菌种；步骤2，固体划线分离，二代培养：将一代菌液转接于实施例6提供的固体培养基平皿中，用划线分离法接种，37℃、co2通气量为80％，静置培养36h，此为二代菌种；步骤3，传液体，三代培养：挑取固体培养基上长出的单颗菌落，接种于实施例3提供的3ml液体培养中；同法挑取单菌落18颗分别接种液体培养基中，编号、培养，培养温度为37℃、co2通气量为70％，培养时间为8h，培养至菌液明显浑浊时停止培养，此为三代菌种；步骤4，荚膜染色、革兰氏染色：取各编号培养后菌液，用墨汁染色法(龙胆紫染液)染色后镜检，将荚膜厚的菌种对应编号的菌液保留3组，其余荚膜薄的菌种对应编号的菌液废弃；步骤5，传液体扩增，四代培养：将荚膜厚的菌液按10％接种量转实施例3体用的液体培养基，进行四代扩增培养，培养温度为35℃、co2通气量为60％，培养时间为4.5h，收获时菌液明显浑浊、od600为0.60；步骤6，菌种收获、保存：将菌液离心，收集菌体沉淀保存于15％甘油中，分装，置于液氮中保存。实施例10性能测试：(1)菌种：肺炎链球菌血清型1型，筛选前和筛选后的菌种，分别为生产用菌种。(2)培养：基于实施例8的方法用液体培养基开启、扩增三代，四代传种于50l发酵罐，相同培养基20l发酵、36℃培养，co2通气量为60％，100rpm搅拌，控制ph7.0，5h后收获。测定细菌od值，并做荚膜染色、镜检。菌液收获后纯化，收集产物多糖，并检测欧洲药典各项目。(3)实验结果：od值及多糖含量、指标合格情况如表3所示；培养后菌体荚膜染色、在显微镜油镜(1000×)下观察，如图1～2所示：表3od值及多糖含量、指标合格情况由表3和图1～2可知，采用本发明筛选的菌种进行培养，发酵液菌浓度显著高于筛选前的菌种，纯化后荚膜多糖产量也显著提高，并全部符合欧洲药典各项指标。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12