调节性T细胞体外扩增方法与流程

本发明涉及生物技术中的细胞培养技术领域，具体涉及一种调节性t细胞体外分选扩增方法及其使用。

背景技术：

调节性t细胞(treg)是一类控制体内自身免疫反应性的t细胞亚群，能够抑制免疫反应的细胞群，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要的作用。虽然在外周血细胞所占的比例低，仅占正常人外周血、脾脏组织cd4⁺t细胞的5％～10％，但是与肿瘤、自身免疫病、移植物的接受性等有密切的关系。

近年来，癌症免疫治疗的临床应用取得了显著进展，已经成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗后癌症的另一有效治疗手段。在各种免疫治疗方式中，免疫检查点疗法是近几年获得突出疗效的治疗方法。免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。免疫检查点疗法就是通过共抑制或共刺激信号等一系列途径以调节t细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。许多免疫检查点分子在调节性t细胞上都有表达，例如ctla-4，pd-1等。然而体内存在的调节性t细胞数量很少，仅占正常人外周血淋巴细胞的1-2％，体外获取后数量少，纯度不高，且细胞增殖能力低。因此，探索体外诱导和扩增高纯度调节性t细胞，建立更有效的细胞增殖培养方法，并在短期内获得有功能的调节性t细胞，是顺利开展免疫检查点与共刺激信分子抗体药物体外功能实验的重要前提。

正常人外周血中存在的调节性t细胞数量仅占cd4⁺t细胞的5-10％，并且传统的cd25⁺cd4⁺treg分离方法不但获取细胞数量少，而且纯度低，尤其是体外扩增过程中真正起抑制作用的treg并没有得到有效扩增，以至于最终获得的细胞中treg数量非常少，无法顺利进展后续的体外功能实验。而如何选择合适的分选标志物，加入哪些激活物与细胞因子来促进treg细胞增殖，确保扩增后细胞的纯度和功能，是目前急待解决的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种调节性t细胞体外扩增方法，能够有效促进调节性t细胞的增殖，并确保扩增后调节性t细胞的纯度和功能。

为解决上述技术问题，本发明提供的调节性t细胞体外扩增方法，包括步骤：

第一步：分离，从血液样品中直接分离出cd4⁺cd127^lowt细胞，再从cd4⁺cd127^lowt细胞中分离出cd25⁺t细胞，即获得cd4⁺cd25⁺cd127^lowtreg细胞。

第二步：激活细胞，将分离出的cd4⁺cd25⁺cd127^lowtreg细胞悬浮于培养基rpmi1640+10％fbs中，加入3-8倍细胞数量的cd3/cd28macs磁珠，将细胞按照每孔0.5～1×10⁵放于培养板中，并加入终浓度500u/ml人重组il-2，置于细胞培养箱培养12-20小时。优选培养16小时。

第三步：扩增与培养细胞，在第二步的细胞中加入终浓度500u/ml人重组il-2，混合均匀，继续放入细胞培养箱中培养2-3天；然后按照培养板每孔1×10⁵将细胞传代，继续加入终浓度500u/ml人重组il-2，培养2-3天；收集所有细胞，离心去除培养基，将细胞与混有终浓度500u/ml人重组il-2的细胞培养基prmi1640+10％fbs加入到6孔板中，培养2-3天；之后再次离心去除培养基，将细胞与混有终浓度500u/ml人重组il-2的细胞培养基prmi1640+10％fbs加入到细胞培养瓶中进行培养，每2-3天使用相同组分的细胞培养基换液一次，直至从细胞激活开始总共培养14-22天，之后收集所有细胞。

具体的，所述第一步中，使用磁珠分选试剂盒(stemcell)分离出cd4⁺cd127^lowt细胞以及cd4⁺cd25⁺cd127^lowtreg细胞。步骤1中所述血样样品可以采用传统方法常规采血手段采集血液(edta抗凝剂)，所述血样样品采集自人体。

具体的，所述第二步中，加入5倍于细胞数量的cd3/cd28磁珠，培养板中每孔为1×10⁵个细胞(96孔板)。

具体的，所述第二步中，培养板为u型96孔细胞培养板，细胞培养箱的培养条件为37℃、5％co2培养4-24小时。

具体的，所述第三步中，所述细胞培养瓶为t25细胞培养瓶。

具体的，所述第三步之后，取收集的部分细胞，使用流式细胞术检测细胞表型。所述流式细胞术检测细胞表型的具体方法是，采用流式细胞术，使用anti-cd25、anti-cd127检测细胞表面cd25与cd127分子，使用anti-foxp3检测细胞内foxp3分子表达。

具体的，所述第三步之后，取收集的部分细胞，用于体外混合淋巴反应实验鉴定其调节性t细胞的功能。

所述体外混合淋巴反应实验的一种具体实施方法是，在u型96孔细胞培养板中分别加入1×10⁴dc细胞、1×10⁵cd4⁺cd25^-t细胞以及1×10⁵treg细胞和待检测抗体，设置各种对照组：完全培养基作为空白对照、人igg4同亚型抗体作为同型对照、bmk为阳性对照或者双特异性抗体的单支抗体作为对比参照组、同时设置不含treg细胞和抗体的实验对照组。将细胞培养板放于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养5天后，用3h参入方法检测细胞增殖，用elisa方法检测细胞培养上清中的ifn-γ含量。

所述体外混合淋巴反应实验的另一种具体实施方法是，先将细胞重悬于fbs+10％dmso中，置于液氮中冻存14天；然后进行复苏，使用rpmi1640+10％fbs常规培养36-48小时，再用于体外混合淋巴反应实验鉴定经历了冻存复苏过程后的调节性t细胞的功能。即在u型96孔细胞培养板中分别加入1×10⁴dc细胞、1×10⁵cd4⁺cd25^-t细胞以及1×10⁵treg细胞和待检测抗体，设置各种对照组：完全培养基作为空白对照、人igg4同亚型抗体作为同型对照、bmk为阳性对照或者双特异性抗体的单支抗体作为对比参照组、同时设置不含treg细胞和抗体的实验对照组。将细胞培养板放于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养5天后，用3h参入方法检测细胞增殖，用elisa方法检测细胞培养上清中的ifn-γ含量。

所述体外混合淋巴反应实验的一种具体实施方法是，在u型96孔细胞培养板中分别加入1×10⁴dc细胞、1×10⁵cd4⁺cd25^-t细胞以及1×10⁵treg细胞和待检测抗体，设置各种对照组：完全培养基作为空白对照、人igg4同亚型抗体作为同型对照、bmk为阳性对照或者双特异性抗体的单支抗体作为对比参照组、同时设置不含treg细胞和抗体的实验对照组。将细胞培养板放于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养5天后，用3h参入方法检测细胞增殖，用elisa方法检测细胞培养上清中的ifn-γ含量。

研究发现，treg细胞表达cd4分子和cd25分子，还高表达foxp3，因此，cd127也可作为该群细胞的一个特异性标志，foxp3高表达和cd127低表达之间有很好的相关性。foxp3是叉状头转录因子家族中的一个成员，其基因突变能引起严重的自身免疫性疾病，因此被认为是调节性t细胞的标志性分子。foxp3作为转录调控因子，通过直接调控多种基因来调节treg的活性，对treg的细胞发育过程和功能起着关键的作用。在mrna与蛋白水平上，foxp3均高表达于cd4⁺cd25⁺treg细胞，并且cd4⁺cd25⁺treg经刺激活化后，细胞可进一步上调foxp3的表达。cd127是白介素-7受α链，其表达对于t淋巴细胞的成熟、维持及免疫应答发挥着重要作用。由于foxp不仅在cd25⁺t细胞上表达，在cd25^-t细胞活化后也可短暂表达，但cd127与foxp3表达呈负相关，cd4⁺t细胞活化后高表达cd127，即cd4⁺cd25⁺cd127^high，而调节性t细胞仅低表达cd127，即cd4⁺cd25⁺cd127^low。

本发明提供的调节性t细胞体外扩增方法，是从外周血中分离得到的naturaltreg，经过一个周期(14-22天)的激活与扩增培养，即可获得足够体外功能实验的细胞量，经过14天的扩增，treg细胞数量达到起始量的160倍，经过22天的扩增，细胞数量更是可达到起始量的430倍，其数量远远多于初始分离量，节约了非常大量的初始血源供应量，并且此扩增过的细胞经过冻存复苏过程后，依旧能保留其生物学功能。

本发明扩增的调节性t细胞表型与功能稳定，在体外扩增的过程中保留其原有的生物学功能，大大降低其应用于免疫检查点与共刺激分子抗体药物体外功能实验的难度，为药物筛选与功能鉴定搭建了便捷的平台，其成本较低，操作简单，极大程度上缓解了起始细胞严重不足的问题，也缓解了传统分选与扩增方法得到的是功能近乎丧失的细胞的窘境。

附图说明

图1为本发明的方法中treg细胞增殖数量与倍数的数据图。

图2为本发明的方法中treg细胞增长速率的数据图。

图3为本发明的方法中treg增殖过程中与结束后使用流式细胞术鉴定其细胞表型的数据图。

图4-图5为本发明的方法扩增之后的treg细胞用于免疫检查点抗体药物anti-pd-1的体外混合淋巴反应的鉴定结果数据图。

图6为本发明的方法扩增之后的treg细胞用于免疫检查点双特异性抗体药物anti-pd-1/anti-ctla4的体外混合淋巴反应的鉴定结果数据图。

图7-图8为本发明的方法扩增的treg细胞经历冻存复苏过程后，再用于免疫检查点抗体药物anti-pd-1的体外混合淋巴反应的鉴定结果数据图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

采用传统方法常规采血手段采集血液(edta抗凝剂)，以50μl/ml加入humancd4⁺cd127^lowregulatorytcellpre-enrichmentcocktail至全血中，混匀并常温25℃孵育20分钟后，使用pbs+2％fbs等比稀释样品并混匀，之后将ficoll分层液轻轻加入稀释后的样品液面下。常温400×g离心30分钟，将刹车关闭，自然停止。从分层液与血浆交界面中收集所需的细胞，并用pbs+2％fbs清洗一遍之后200×g离心，弃上清，重复一遍。用250μlmacsbuffer重悬收集到的细胞，并将其转移至14ml离心管中。以50μl/ml加入positiveselectioncocktail(cd25⁺t)，混匀，常温孵育15分钟。以50μl/ml加入nanoparticles，再次混匀，常温孵育10分钟。用macsbuffer补足总体积至5ml，轻轻混匀，将14ml离心管置于磁铁silvermagnet中放置5分钟。之后拿起磁铁，倒出液体，被标记的细胞依旧留在14ml离心管中。将离心管从磁铁中拿出2-3秒，再次加入5mlmacsbuffer，混匀，将14ml离心管放回磁铁中5分钟。重复以上步骤，总共重复4次“5分钟分离步骤”。最后将收集到的细胞培养在rpmi1640+10％fbs中。

取少量细胞进行细胞膜anti-cd25，anti-cd127染色，之后进行胞内foxp3染色，使用流式细胞术分析。如图3所示，第零天时32.4％的细胞表达foxp3⁺，76.6％的细胞表达cd25⁺，而双染细胞中，foxp3⁺/cd127^low为12.8％，foxp3⁺/cd25⁺为52.5％。用以上方法提取的细胞，高表达foxp3与cd25，cd127表达量低，初步认为此方法提取的treg是我们所需要的高纯度调节性t细胞。

将cd3/cd28macsbeadparticles(美天旎)充分混匀并取出200μl，加入300～600μlrpmi1640+10％fbs，300×g离心5分钟，弃上清，将cd3/cd28macsbeadparticles重悬于200μlrpmi1640+10％fbs中，为工作液。1×10⁵treg/孔treg(100μl)接种于u型96孔细胞培养板中，并加入500u/ml重组人il-2和准备好的25μl/孔cd3/cd28macsbeadparticles工作液(第零天)。第一天，每孔加入100μl500u/mlril-2。2-3天之后按照每孔1×10⁵将细胞传代，继续加入500u/ml人重组il-2，培养2-3天。这样培养4-6天后，收集所有细胞，离心去除培养基，加入混有500u/ml人重组il-2的新细胞培养基于6孔板中，培养2-3天。之后再次离心去除培养基，加入混有500u/ml人重组il-2的新细胞培养基于t25细胞培养瓶中，2-3天换液(rpmi1640+10％fbs，500u/ml人重组il-2)一次，直至从细胞激活开始总共培养14-22天。

treg细胞扩增第七天与第十四天时，取少量细胞进行细胞膜anti-cd25，anti-cd127染色，之后进行胞内foxp3染色，使用流式细胞术分析。如图3所示，第七天和第十四天时，无论单染foxp3、cd25还是双染foxp3⁺/cd127^low、foxp3⁺/cd25⁺，他们的比例都有所上升，尤其是foxp3的表达比例，从32.4％上升至60.7％(7天)与72.9％(14天)。从流式细胞术检测的细胞表型结果来看，我们用此种扩增方法得到了表型没有丧失的调节性t细胞。

treg扩增第五、七、九、十二、十四、十六、十九和二十二天，分别进行细胞计数。从图1与图2可以看到，经过14天的扩增，treg细胞数量达到起始量的160倍，经过22天的扩增，细胞数量更是可达到起始量的430倍。在treg细胞体外扩增过程中，从第五天开始，细胞进入快速增长期，之后进入稳定增长期。treg细胞的增长速度，可以为体外功能实验时所需要的细胞总量提供体外扩增总时间的预测与参考。从以上结果来看，我们用此种扩增方法得到了数量丰富的调节性t细胞。

使用扩增后14天的treg进行体外混合淋巴反应实验鉴定其调节性t细胞的功能。在u型96孔细胞培养板中分别加入1×10⁴dc细胞、1×10⁵cd4⁺cd25^-t细胞以及1×10⁵treg细胞和pd-1抗体(工作浓度为166.75nm)。完全培养基作为空白对照，人igg4同亚型抗体作为同型对照，bmk1作为阳性对照，同时设置不含treg细胞和抗体的实验对照组。将细胞培养板放于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养5天后，3h参入法检测细胞的增殖，elisa检测上清中的ifn-γ含量。

如图4与图5所示，使用体外扩增14天的treg进行异体mlr,teff细胞分泌的ifnγ减少了86.4％，并且teff细胞的增殖减少了73.4％。这与调节性t细胞本身应发挥的抑制teff生长的生物学功能是吻合的。从mlr结果我们可以看到，用以上方法分选并扩增的treg依旧保持其特有的生物学功能。

实施例二：

treg来源于实施例一中扩增21天的调节性t细胞。在u型96孔细胞培养板中分别加入1×10⁴dc细胞、1×10⁵cd4⁺cd25^-t细胞以及1×10⁵treg细胞和双特异性抗体(工作浓度为335nm)。完全培养基作为空白对照，人igg4同亚型抗体作为同型对照，双特异性抗体的单支抗体作为对比参照组，同时设置不含treg细胞和抗体的实验对照组。将细胞培养板放于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养5天后，检测细胞培养上清中的ifn-γ含量。

如图6所示，使用体外扩增21天的treg进行异体mlr,teff细胞分泌的ifnγ减少了96.6％，这与调节性t细胞本身应发挥的抑制teff生长的生物学功能是吻合的。从mlr结果我们可以看到，用以上方法分选并扩增的treg依旧保持其特有的生物学功能。

实施例三：

将实施例一与实施例二中剩余的treg细胞重悬于fbs+10％dmso中，置于液氮中冻存14天。之后复苏，使用rpmi1640+10％fbs常规培养36-48小时，用于体外混合淋巴反应实验鉴定其调节性t细胞的功能。在u型96孔细胞培养板中分别加入1×10⁴dc细胞、1×10⁵cd4⁺cd25^-t细胞以及1×10⁵treg细胞和pd-1抗体(工作浓度为166.75nm)。完全培养基作为空白对照，人igg4同亚型抗体作为同型对照，bmk1作为阳性对照，同时设置不含treg细胞和抗体的实验对照组。将细胞培养板放于37℃，5％co2浓度的细胞培养箱中培养5天后，3h参入法检测细胞的增殖，elisa检测上清中的ifn-γ含量。

使用体外扩增22天后冻存14天，复苏后培养36-48小时的treg进行异体mlr,teff细胞分泌的ifnγ减少了53.3％，并且teff细胞的增殖减少了50.5％。这与调节性t细胞本身应发挥的抑制teff生长的生物学功能是吻合的。从mlr结果我们可以看到，用以上方法分选并扩增的treg，在经历了冻存复苏过程后，依旧保持其抑制性的生物学功能。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。