人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种获取参与细胞生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人脐带血间充质干细胞(msc)分离并获取外泌体(exosome，或记作exosomes)的方法，以及其在细胞修复中的应用。特别地，本发明涉及人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法，此外，本发明还涉及使用的试剂。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，现已证实mscs除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明mscs通过分泌多种免疫调节因子，如ifn-γ、pge2等(可参见：polchertd,sobinskyj,douglasg,kiddm,moadsiria,reinae,etal.ifn-gammaactivationofmesenchymalstemcellsfortreatmentandpreventionofgraftversushostdisease.europeanjournalofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及spaggiarigm,abdelrazikh,becchettif,morettal.mscsinhibitmonocyte-deriveddcmaturationandfunctionbyselectivelyinterferingwiththegenerationofimmaturedcs:centralroleofmsc-derivedprostaglandine2.blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如t细胞、b细胞、nk细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：corcionea,benvenutof,ferrettie,giuntid,cappiellov,cazzantif,etal.humanmesenchymalstemcellsmodulateb-cellfunctions.blood.2006；107(1):367-72.以及dinicolam,carlostellac,magnim,milanesim,longonipd,matteuccip,etal.humanbonemarrowstromalcellssuppresst-lymphocyteproliferationinducedbycellularornonspecificmitogenicstimuli.blood.2002；99(10):3838-43.)。

外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～100nm，密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mrna、mirna，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：yanez-mom,siljanderpr,andreuz,zavecab,borrasfe,buzasei,etal.biologicalpropertiesofextracellularvesiclesandtheirphysiologicalfunctions.journalofextracellularvesicles.2015；4:27066.)。lai等发现mscs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的mirna可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：lairc,arslanf,leemm,szens,chooa,chents,etal.exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellresearch.2010；4(3):214-22.)。xin等发现mscs来源的外泌体通过转移mir-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：xinh,liy,bullerb,katakowskim,zhangy,wangx,etal.exosomemediatedtransferofmir-133bfrommultipotentmesenchymalstromalcellstoneuralcellscontributestoneuriteoutgrowth.stemcells.2012；30(7):1556-64.)。filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过nk细胞激活型受体nkg2d(naturalkillergroup2,memberd)抑制t细胞和nk细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可参见：filipazzip,burdekm,villaa,rivoltinil,huberv.recentadvancesontheroleoftumorexosomesinimmunosuppressionanddiseaseprogression.seminarsincancerbiology.2012；22(4):342-9.)。

外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有mhcii类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。目前研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rrna和microrna，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。

目前研究发现，脐带血间充质干细胞来源的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、mhci/ii分子以及ccr5趋化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。

目前进行外泌体提取的方式和途径也多种多样，如：骨髓中提取、外周血中提取等，这些外泌体获取的途径均需要有创伤性的细胞或组织来源。外泌体提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的外泌体质量不均一、不能保证外泌体所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的外泌体获取，并且成本昂贵。

现有技术已有一些关于外泌体的分离提取方法的报道。例如，cn106282107a(中国专利申请号201610779165.2)公开了一种人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，p2～p3胎盘间充质干细胞汇合率达85％～90％时，收集培养基，获取细胞培养上清液，并进行膜过滤后，收集滤液；再将滤液离心，收集离心上清液，按离心上清液体积1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培养基上清液溶液，并充分混匀后第二次离心，最后所得沉淀即为外泌体。据信该发明的方法，取材方便，易于富集扩增培养，将p2～p3代胎盘间充质干细胞培养基上清再利用获取外泌体，不涉及医学伦理问题。外泌体分离过程中采用膜过滤、离心和加入聚乙二醇溶液等手段有效增加外泌体富集，耗时短，成本低。

cn105708861a(中国专利申请号201610149852.6)公开了间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，其中外泌体的提取方法为：培养足量的骨髓间充质干细胞，在提取干细胞外泌体前48h，用pbs清洗细胞，更换无血清培养基，继续培养48h；收集无血清培养基，300×g离心10min，取上清；2000×g离心10min，取上清；10000×g离心30min，取上清；100000×g离心70min，取沉淀；pbs重悬沉淀，100000×g离心70min，收集沉淀即得所述外泌体。

cn105267240a(中国专利申请号201410781765.3)公开了间充质干细胞来源的外泌体的用途，其中由包括如下步骤的方法制备得到：(1)间充质干细胞的分离培养：根据间充质干细胞来源不同，采用不同的分离培养方式，具体如下：①人脐带间充质干细胞的分离培养：取无菌新生儿新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液(pbs)反复冲洗后，剪成直径约1-2mm的组织块；经2型胶原酶和胰酶消化依次后，将上清液离心，取细胞沉淀放入培养瓶，使用含10％胎牛血清dmem/f12培养基，5％co2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，在贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养；②人胎盘间充质干细胞的分离培养：剪取胎盘绒毛膜面1-2cm厚的组织，剪成1-2mm的碎块，用磷酸盐缓冲液漂洗至无色，用dispaseii型酶和4型胶原酶37℃水浴消化1小时，振荡后静置，液体自然分为三层，吸取中间层悬液于离心管中，加入磷酸盐缓冲液混匀后离心，弃上清，取细胞沉淀放入培养瓶，使用含10％胎牛血清dmem培养基，5％co2、37℃饱和湿度培养；去除非贴壁细胞，在贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养；③人脂肪间充质干细胞的分离培养：无菌吸取脂肪抽提液，用磷酸盐缓冲液冲洗数次。去除吸脂手术中所用药物及血细胞，用1型胶原酶37℃消化1小时，间或搅拌；离心后弃去上层脂肪，混匀，用200目筛网过滤，将所获得的细胞悬液离心，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，用10％胎牛血清的α-mem培养液悬浮，转移至培养瓶中，5％co2、37℃饱和湿度培养；在贴壁细胞80％融合后0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。(2)间充质干细胞条件培养基的收集：取3-5代的间充质干细胞无血清培养48h；收集培养上清液；0.22μm无菌膜过滤得到间充质干细胞条件培养基。(3)外泌体分离纯化包括：收集过滤的间充质干细胞条件培养基4℃，1000g离心10min，收集上清；收集的上清液4℃，2000g离心20min，收集上清；收集的上清液4℃，10000g离心30min，收集上清；收集的上清液，110000g离心70min，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再次110000g离心70min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，0.22μm滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞来源外泌体。

cn104382827a(中国专利申请号201410705462.3)公开了人羊膜间充质干细胞外泌体的用途，其中的外泌体制备方法如下：1、人羊膜间充质干细胞的培养：取生长良好的人羊膜间充质干细胞，用无血清培养基培养，0.25％胰酶消化传代，传至p2代，待其生长至融合度80％，弃培养上清，用pbs洗三遍，加入1640基础培养基，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3到5天后收集培养上清用于外泌体的提取。2、外泌体的提取(提取全过程除特别说明外，均在4℃下进行)：将收集的所有培养上清300g离心10min，保留上清液，弃沉淀，去除培养液中的细胞；上清液2000g～3000g离心20min～30min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；上清液10000g离心60min～100min，保留上清液，弃沉淀，再次去除细胞碎片；上清液100000g离心60min～120min，弃上清，保留沉淀；沉淀加入pbs重悬后，100000g离心60min～120min弃上清，保留沉淀，去除培养基中蛋白质，所获即为纯化后的人羊膜间充质干细胞的外泌体，用pbs缓冲液重悬，用bca试剂盒测蛋白浓度。

cn103767985a(中国专利申请号201210402915.6)公开了人源血液或间充质干细胞分泌外泌体的制备与应用，其中外泌体通过以下方法制得：1)采集血液→差速离心分离→低温超速纯化→获得高纯度血清含有的外泌体；2)提取间充质干细胞→体外培养、扩增→收集细胞培养上清液→融化培养上清液并混合→差速离心分离→低温超速纯化→获得高纯度干细胞分泌的外泌体；3)提取间充质干细胞→体外培养、扩增→收集细胞培养上清液→融化培养上清液并混合→低温离心、免疫吸附法纯化→获得高纯度间充质干细胞分泌的外泌体。

cn105861430a(中国专利申请号201610279473.9)公开的外泌体由以下方法制备：(1)分离培养人脐带间充质干细胞；(2)用il-1β优化处理人脐带间充质干细胞；(3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体即得到il-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。

然而，现有技术中从胎盘、脐带血、骨髓、脂肪培养间充质干细胞时，均采用这些msc的培养基上清来提取外泌体，这些方面均存在产量偏低且所得外泌体纯度偏低的不足。因此，本领域仍然期待有新的方法来分离提取外泌体，特别是以高产量和高纯度从人脐带血间充质干细胞分泌提取外泌体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的方法来分离提取外泌体，特别是这种方法能够以高产量和高纯度从人脐带血间充质干细胞分泌提取外泌体。已经出人意料的发现通过本发明方法能够有益的实现上述目的。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种从人脐带血间充质干细胞中分离提取外泌体的方法，该方法包括：

1、脐带血间充质干细胞的培养，和

2、脐带血msc外泌体的提取；其中

所述脐带血间充质干细胞的培养是使脐带血间充质干细胞培养至p3代；

所述脐带血msc外泌体的提取包括如下步骤：

2.1、外泌体悬液预处理

2.1.1、外泌体来源一：待p3代脐带血msc汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用；

2.1.2、外泌体来源二：用pbs铺满已去除培养基的培养瓶，将装有pbs的脐带血msc的p3代细胞培养瓶放入体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血msc细胞24h，之后收集培养瓶中的pbs；

2.1.3、外泌体来源三：

2.1.3.1、pbs饥饿后的p3代脐带血msc，通过加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新离心管内，用pbs稀释定容，取500μl细胞悬液血球仪计数；

2.1.3.2、取脐带血msc的p3细胞，转移至新的离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7；

2.1.3.3、去除上清液，用pbs重悬细胞，离心并且重复加入pbs洗涤；

2.1.3.4、洗涤后去除pbs，向细胞沉淀加入具有缓冲作用的细胞裂解液，并且在低温冰袋上孵育30min，期间每隔5min，在旋窝振荡器上混匀1min，共振荡4次；

2.1.3.5、孵育结束，再次离心20000*g，30min，升速度9，降速度7，提取全部上清液转移至新的离心管内，用pbs稀释，放入-80℃冰箱低温保存至少24h；

2.1.4、将2.1.3.5中的悬液复苏并与前面2.1.1步骤中的培养基、前面2.1.2从培养瓶中收集的pbs进行混合，作为外泌体来源混合液，用于共同提取外泌体；

2.2、外泌体提取

2.2.1、用pbs对外泌体来源混合液进行体积比1:1稀释，配平，进行离心，转速350*g，15min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余msc细胞；

2.2.2、小心将离心后的上清收集到新的离心管中，去除沉淀，离心，转速2500*g，20min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余死细胞；

2.2.3、再次将上清收集到新的离心管中，弃沉淀，并再次离心13000*g，30min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余细胞碎片；

2.2.4、轻轻将离心后的上清收集到新的离心管内，并进行超高速离心，转速110000*g，2h，升速度9，降速度7，4℃，所得沉淀物为外泌体中间产物；

2.2.5、弃上清，用pbs稀释沉淀物，作为外泌体中间产物，通过0.22μm过滤器过滤悬液；

2.2.6、在一个新的50ml离心管底部加入配置好的的tris/蔗糖/d2o溶液，形成缓冲垫；以5～6倍缓冲垫体积将悬液轻轻加在缓冲垫上方，避免冲破液面；再次进行超高速离心，转速100000*g，80min，升速度9，降速度9，4℃；

2.2.7、弃上清，用18g针头的5ml注射器收集含有外泌体的缓冲垫，将缓冲垫用pbs稀释10倍，进行高速离心100000*g，60min，升速度9，将速度7，4℃；离心后尽量去除上清液，沉淀即为外泌体，用pbs重悬外泌体进行清洗，并进行高速离心100000*g，20min，去除上清液，再用pbs重复清洗外泌体、如上高速离心2-3次；最终用pbs稀释并混匀，得到最终外泌体，任选的将其放入-80℃冰箱低温保存。

根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带血间充质干细胞的培养过程使用本领域一般的方法进行。例如这些方法是本领域技术人员公知的。

根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带血间充质干细胞的培养包括如下步骤：

1.1、脐带血的采集：

选取足月新生儿的脐带，将其中的脐带血采集到一次性无菌塑料采血袋中，低温保鲜贮运；

1.2、脐带血预处理：将采集到的脐带血，通过100μm孔径的过滤器转移至新的离心管中，以去除多余血块；

1.3、脐带血单个核细胞提取：

1.3.1、将过滤后的脐带血与pbs按1:1比例混匀得到细胞悬液，再取细胞悬液加入装有ficoll分离液的离心管内，细胞悬液与ficoll分离液体积比为5：3，进行离心2000rpm/min，30min，4℃，升速度1，降速度0；

ficoll分离液离心后，液面分为四层，依次是：红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐带血单个核细胞层、血浆层；

1.3.2、用移液管尽量吸尽脐带血单个核细胞层，转移至装有脐带血msc培养基1的离心管内并混匀，得悬液；另外将血浆层提取到另一个离心管中备用，用于msc培养基配置；

1.3.3、用0.22μm孔径的过滤器将悬液进行过滤，以除去多余淋巴细胞及杂质，得到细胞悬液；

1.4、脐带血msc的p0代培养

1.4.1、将细胞悬液接种于t25培养瓶内，再加入10ml脐带血msc培养基1，将t25培养瓶置于体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中进行培养；

1.4.2、待原代细胞接种48h左右，向t25培养瓶中加入3ml脐带血msc培养基1，之后每隔2-3天，加一次液，总共加3-4次培养基；之后每隔3天，去除原来的培养基，加入15ml脐带血msc培养基1，对细胞进行换液处理，总共换液2-3次；

1.5、脐带血msc的p1-p3代培养

1.5.1、待脐带血msc原代细胞汇合率达到40％-50％时，做p0代传p1代处理，吸弃t25瓶中原有的培养基，吸取10ml的pbs缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，洗涤完毕去除pbs缓冲液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液1ml，浸漫覆盖t25培养瓶底部，再将培养瓶放置于co2培养箱中孵育30-60s，轻轻拍打培养瓶侧面，倒置显微镜下观察，待msc细胞皱缩成圆形，成流沙状漂浮时，加入5ml脐带血msc培养基1进行终止消化，用5ml移液管充分吹打培养瓶底部并收集细胞于15ml离心管内；进行离心1400rpm/min，5min，4℃，升速度9，降速度7；

1.5.2、离心后，弃去上清，用5ml的imdm基础培养基重悬细胞，吸取200μl细胞悬液并用adam计数仪计数，按照3500-5000细胞/cm²密度接种于t75培养瓶中，并加入新的脐带血msc培养基2，置于体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，记为脐带血msc的p1代细胞；

1.5.3、待细胞汇合率达到80-90％时，重复上述操作，将脐带血msc进行p2、p3代细胞扩增。

根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：

1、脐带血间充质干细胞的培养，其包括如下步骤：

1.1、脐带血的采集：

选取足月新生儿的脐带，将其中的脐带血采集到一次性无菌塑料采血袋中，低温保鲜贮运；

1.2、脐带血预处理：将采集到的脐带血，通过100μm孔径的过滤器转移至新的离心管中，以去除多余血块；

1.3、脐带血单个核细胞提取：

1.3.1、将过滤后的脐带血与pbs按1:1比例混匀得到细胞悬液，再取细胞悬液加入装有ficoll分离液的离心管内，细胞悬液与ficoll分离液体积比为5：3，进行离心2000rpm/min，30min，4℃，升速度1，降速度0；

ficoll分离液离心后，液面分为四层，依次是：红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐带血单个核细胞层、血浆层；

1.3.2、用移液管尽量吸尽脐带血单个核细胞层，转移至装有脐带血msc培养基1的离心管内并混匀，得悬液；另外将血浆层提取到另一个离心管中备用，用于msc培养基配置；

1.3.3、用0.22μm孔径的过滤器将悬液进行过滤，以除去多余淋巴细胞及杂质，得到细胞悬液；

1.4、脐带血msc的p0代培养

1.4.1、将细胞悬液接种于t25培养瓶内，再加入10ml脐带血msc培养基1，将t25培养瓶置于体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中进行培养；

1.4.2、待原代细胞接种48h左右，向t25培养瓶中加入3ml脐带血msc培养基1，之后每隔2-3天，加一次液，总共加3-4次培养基；之后每隔3天，去除原来的培养基，加入15ml脐带血msc培养基1，对细胞进行换液处理，总共换液2-3次；

1.5、脐带血msc的p1-p3代培养

1.5.1、待脐带血msc原代细胞汇合率达到40％-50％时，做p0代传p1代处理，吸弃t25瓶中原有的培养基，吸取10ml的pbs缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，洗涤完毕去除pbs缓冲液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液1ml，浸漫覆盖t25培养瓶底部，再将培养瓶放置于co2培养箱中孵育30-60s，轻轻拍打培养瓶侧面，倒置显微镜下观察，待msc细胞皱缩成圆形，成流沙状漂浮时，加入5ml脐带血msc培养基1进行终止消化，用5ml移液管充分吹打培养瓶底部并收集细胞于15ml离心管内；进行离心1400rpm/min，5min，4℃，升速度9，降速度7；

1.5.2、离心后，弃去上清，用5ml的imdm基础培养基重悬细胞，吸取200μl细胞悬液并用adam计数仪计数，按照3500-5000细胞/cm²密度接种于t75培养瓶中，并加入新的脐带血msc培养基2，置于体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，记为脐带血msc的p1代细胞；

1.5.3、待细胞汇合率达到80-90％时，重复上述操作，将脐带血msc进行p2、p3代细胞扩增；

2、脐带血msc外泌体的提取，其包括如下步骤：

2.1、外泌体悬液预处理

2.1.1、外泌体来源一：待p3代脐带血msc汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用；

2.1.2、外泌体来源二：用pbs铺满已去除培养基的培养瓶，将装有pbs的脐带血msc的p3代细胞培养瓶放入体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血msc细胞24h，之后收集培养瓶中的pbs；

2.1.3、外泌体来源三：

2.1.3.1、pbs饥饿后的p3代脐带血msc，通过加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新离心管内，用pbs稀释定容，取500μl细胞悬液血球仪计数；

2.1.3.2、取脐带血msc的p3细胞，转移至新的离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7；

2.1.3.3、去除上清液，用pbs重悬细胞，离心并且重复加入pbs洗涤；

2.1.3.4、洗涤后去除pbs，向细胞沉淀加入具有缓冲作用的细胞裂解液，并且在低温冰袋上孵育30min，期间每隔5min，在旋窝振荡器上混匀1min，共振荡4次；

2.1.3.5、孵育结束，再次离心20000*g，30min，升速度9，降速度7，提取全部上清液转移至新的离心管内，用pbs稀释，放入-80℃冰箱低温保存至少24h；

2.1.4、将2.1.3.5中的悬液复苏并与前面2.1.1步骤中的培养基、前面2.1.2从培养瓶中收集的pbs进行混合，作为外泌体来源混合液，用于共同提取外泌体；

2.2、外泌体提取

2.2.1、用pbs对外泌体来源混合液进行体积比1:1稀释，配平，进行离心，转速350*g，15min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余msc细胞；

2.2.2、小心将离心后的上清收集到新的离心管中，去除沉淀，离心，转速2500*g，20min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余死细胞；

2.2.3、再次将上清收集到新的离心管中，弃沉淀，并再次离心13000*g，30min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余细胞碎片；

2.2.4、轻轻将离心后的上清收集到新的离心管内，并进行超高速离心，转速110000*g，2h，升速度9，降速度7，4℃，所得沉淀物为外泌体中间产物；

2.2.5、弃上清，用pbs稀释沉淀物，作为外泌体中间产物，通过0.22μm过滤器过滤悬液；

2.2.6、在一个新的50ml离心管底部加入配置好的的tris/蔗糖/d2o溶液，形成缓冲垫；以5～6倍缓冲垫体积将悬液轻轻加在缓冲垫上方，避免冲破液面；再次进行超高速离心，转速100000*g，80min，升速度9，降速度9，4℃；

2.2.7、弃上清，用18g针头的5ml注射器收集含有外泌体的缓冲垫，将缓冲垫用pbs稀释10倍，进行高速离心100000*g，60min，升速度9，降速度7，4℃；离心后尽量去除上清液，沉淀即为外泌体，用pbs重悬外泌体进行清洗，并进行高速离心100000*g，20min，去除上清液，再用pbs重复清洗外泌体、如上高速离心2-3次；最终用pbs稀释并混匀，得到最终外泌体，任选的将其放入-80℃冰箱低温保存。

根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：

1、脐带血间充质干细胞的培养，其包括如下步骤：

1.1、脐带血的采集：

选取足月新生儿的脐带，将其中的脐带血采集到一次性无菌塑料采血袋中，运输全程低温保鲜；

1.2、脐带血预处理：

将采集到的脐带血，通过100μm孔径的过滤器转移至新的离心管中，以去除多余血块；

1.3、脐带血单个核细胞提取：

1.3.1、将过滤后的脐带血(例如取50ml)与pbs按1:1比例混匀(总体积为100ml)得到细胞悬液，再取细胞悬液15ml加入装有ficoll分离液的50ml离心管内，细胞悬液与ficoll分离液体积比为5：3，进行离心2000rpm/min，30min，4℃，升速度1，降速度0；

ficoll分离液离心后，液面分为四层，依次是：红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐带血单个核细胞层、血浆层；

1.3.2、用移液管尽量吸尽脐带血单个核细胞层，转移至装有5ml脐带血msc培养基1的50ml离心管内并混匀，得悬液；另外将血浆层提取到另一个50ml离心管中备用，用于msc培养基配置；

1.3.3、用0.22μm孔径的过滤器将悬液进行过滤，以除去多余淋巴细胞及杂质，得到细胞悬液；

1.4、脐带血msc的p0代培养

1.4.1、将细胞悬液接种于t25培养瓶内，再加入10ml脐带血msc培养基1，将t25培养瓶置于体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中进行培养；

1.4.2、待原代细胞接种48h左右，向t25培养瓶中加入3ml脐带血msc培养基1，之后每隔2-3天，加一次液，总共加3-4次培养基；之后每隔3天，去除原来的培养基，加入15ml脐带血msc培养基1，对细胞进行换液处理，总共换液2-3次；

1.5、脐带血msc的p1-p3代培养

1.5.1、待脐带血msc原代细胞汇合率达到40％-50％时，做p0代传p1代处理，吸弃t25瓶中原有的培养基，吸取10ml的pbs缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，洗涤完毕去除pbs缓冲液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液1ml，浸漫覆盖t25培养瓶底部，再将培养瓶放置于co2培养箱中孵育30-60s，轻轻拍打培养瓶侧面，倒置显微镜下观察，待msc细胞皱缩成圆形，成流沙状漂浮时，加入5ml脐带血msc培养基1进行终止消化，用5ml移液管充分吹打培养瓶底部并收集细胞于15ml离心管内；进行离心1400rpm/min，5min，4℃，升速度9，降速度7；

1.5.2、离心后，弃去上清，用5ml的imdm基础培养基重悬细胞，吸取200μl细胞悬液并用adam计数仪计数，按照3500-5000细胞/cm²密度接种于t75培养瓶中，并加入新的脐带血msc培养基2，置于体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，记为脐带血msc的p1代细胞；

1.5.3、待细胞汇合率达到80-90％时，重复上述操作，将脐带血msc进行p2、p3代细胞扩增；

2、脐带血msc外泌体的提取，其包括如下步骤：

2.1、外泌体悬液预处理

2.1.1、外泌体来源一：待p3代脐带血msc汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用；

2.1.2、外泌体来源二：用50ml的pbs铺满已去除培养基的培养瓶，将装有pbs的脐带血msc的p3代细胞培养瓶放入体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血msc细胞24h，之后收集培养瓶中的pbs；

2.1.3、外泌体来源三

2.1.3.1、pbs饥饿后的p3代脐带血msc，通过加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新的50ml离心管内，用pbs定容到20ml，取500μl细胞悬液血球仪计数；

2.1.3.2、计算得到脐带血msc细胞数，取6*10⁷脐带血msc的p3细胞，转移至新的15ml离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7；

2.1.3.3、去除上清液，用3ml的pbs重悬细胞，离心并且重复加入pbs洗涤；

2.1.3.4、洗涤后去除pbs，向细胞沉淀加入1.5ml具有缓冲作用的细胞裂解液，并且在低温冰袋上孵育30min，期间每隔5min，在旋窝振荡器上混匀1min，共振荡4次；

2.1.3.5、孵育结束，再次离心20000*g，30min，升速度9，降速度7，提取全部上清液转移至新的15ml离心管内，用pbs稀释至10ml，放入-80℃冰箱低温保存至少24h；

2.1.4、将2.1.3.5中的悬液复苏并与前面2.1.1步骤中的培养基、前面2.1.2从培养瓶中收集的pbs进行混合，作为外泌体来源混合液，用于共同提取外泌体；

2.2、外泌体提取

2.2.1、用pbs对外泌体来源混合液进行稀释(1:1)，配平，进行离心，转速350*g，15min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余msc细胞；

2.2.2、小心将离心后的上清收集到新的离心管中，去除沉淀，离心，转速2500*g，20min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余死细胞；

2.2.3、再次将上清收集到新的离心管中，弃沉淀，并再次离心13000*g，30min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余细胞碎片；

2.2.4、轻轻将离心后的上清收集到新的离心管内，并进行超高速离心，转速110000*g，2h，升速度9，降速度7，4℃，所得沉淀物为外泌体中间产物；

2.2.5、弃上清，用pbs稀释沉淀物，作为外泌体中间产物，通过0.22μm过滤器过滤悬液，将悬液定容到一个50ml离心管内，体积控制在25ml；

2.2.6、在一个新的50ml离心管底部加入配置好的4.5ml的tris/蔗糖/d2o溶液，形成缓冲垫；将25ml悬液轻轻加在缓冲垫上方，避免冲破液面；再次进行超高速离心，转速100000*g，80min，升速度9，降速度9，4℃；

2.2.7、弃上清，用18g针头的5ml注射器收集含有外泌体的缓冲垫，将缓冲垫用pbs稀释到50ml，进行高速离心100000*g，60min，升速度9，将速度7，4℃；离心后尽量去除上清液，沉淀即为外泌体，用100ml的pbs重悬外泌体进行清洗，并进行高速离心100000*g，20min，去除上清液，再用100ml的pbs重复清洗外泌体、如上高速离心2-3次；最终用5ml的pbs稀释并混匀，得到最终外泌体，任选的将其放入-80℃冰箱低温保存。

根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带血msc培养基1的组成包括：体积浓度为10％的脐带血血浆、15ng/ml的gm-csf、体积浓度2％hepes、体积浓度1％青-链霉素、体积浓度1％l-谷氨酰胺、余量imdm基础培养基。

根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带血msc培养基2的组成包括：体积浓度为10％的脐带血血浆、10ng/ml的il-1β、体积浓度2％hepes、体积浓度1％青链霉素、体积浓度1％l-谷氨酰胺、余量imdm基础培养基。

根据本发明第一方面的方法，其中所述细胞裂解液的配方组成包括：300mmol/l的nacl，50mmol/l的tris(ph7.4)，3mmol/l焦磷酸钠，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.1％十二烷基硫酸钠(sds)，1.5mmol/l的edta，30mmol/l的β-甘油磷酸钠，用水配制。在一个实施方案中，所述细胞裂解液各组分用经过高温高压的纯化水按比例稀释并溶解制备而成。

根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲垫的配制方法为：取30g无蛋白酶蔗糖、2.4g的tris碱、50ml的d2o，将其充分混匀，再用10mol/l的hcl滴定调节ph至7.4，用d2o将体积调制成100ml，通过0.22μm过滤器过滤并高压灭菌，在4℃冰箱储存，备用。

根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带血msc培养基2中还包括体积浓度0.2％甘氨酸。根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲垫中还包括0.05w/v％氯化钙。根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带血msc培养基2中还包括体积浓度0.2％甘氨酸，所述缓冲垫中还包括0.05w/v％氯化钙。已经出人意料的发现，在脐带血msc培养基2和缓冲垫分别增加上述两种物质后(二者可分别称为改良脐带血msc培养基2和改良缓冲垫)，能够显著提高外泌体的得率。例如，参照实施例1和实施例2进行试验，但是在试验时分别使用改良脐带血msc培养基2和改良缓冲垫，所得产物在相应地进行实施例3～5测试时，除了图2结果有差异外，其余结果均与实施例1～2所得样品的测定结果一致；例如外泌体的直径为50至120nm，分离所得的细胞表达间充质干细胞表面抗原cd73，cd90，cd105均在99％以上，而不表达hla-dr，cd-34，cd-45，cd19，cd11b(均低于0.5％)；而在使用改良脐带血msc培养基2和改良缓冲垫的试验中，a、b、c、d四组试验的外泌体得率(ug/10⁶细胞)分别达到3.13、3.28、2.93、2.27，显著的高于两种溶液中不添加此两种试剂时0.66～0.82ug/10⁶细胞的外泌体得率。令人遗憾的是，已经发现，如果仅使用上述改良脐带血msc培养基2和改良缓冲垫之一的试验(即仅使用改良脐带血msc培养基2，或者仅使用改良缓冲垫)中，尽管实施例3～5方法所得其余结果基本与实施例1～2样品测试结果基本相同，但是两种情况下四组试验的外泌体得率(ug/10⁶细胞)分别在0.74～0.91范围内和0.64～0.86范围内，均无法有效的提高外泌体得率。

进一步的，本发明第二方面提供了一种脐带血msc培养基，其组成包括：体积浓度为10％的脐带血血浆、15ng/ml的gm-csf、体积浓度2％hepes、体积浓度1％青-链霉素、体积浓度1％l-谷氨酰胺、余量imdm基础培养基。

进一步的，本发明第二方面提供了一种脐带血msc培养基，其组成包括：体积浓度为10％的脐带血血浆、10ng/ml的il-1β、体积浓度2％hepes、体积浓度1％青链霉素、体积浓度1％l-谷氨酰胺、余量imdm基础培养基。例如，其中还包括体积浓度0.2％甘氨酸

进一步的，本发明第二方面提供了一种细胞裂解液，其组成包括：300mmol/l的nacl，50mmol/l的tris(ph7.4)，3mmol/l焦磷酸钠，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.1％十二烷基硫酸钠(sds)，1.5mmol/l的edta，30mmol/l的β-甘油磷酸钠，用水配制。在一个实施方案中，所述细胞裂解液各组分用经过高温高压的纯化水按比例稀释并溶解制备而成。

进一步的，本发明第二方面提供了一种缓冲垫，其配制方法为：取30g无蛋白酶蔗糖、2.4g的tris碱、50ml的d2o，将其充分混匀，再用10mol/l的hcl滴定调节ph至7.4，用d2o将体积调制成100ml，通过0.22μm过滤器过滤并高压灭菌，在4℃冰箱储存，备用。例如，其中还包括0.05w/v％氯化钙。

下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。

在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。

在本发明中，术语“脐带血间充质干细胞”是指来源于脐带血的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脐带血间充质干细胞”可以与“脐带血干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。

附图说明

图1、人脐带血间充质干细胞形态变化，图中：a为人脐带血间充质干细胞培养7d，呈梭形(倒置显微镜，×100)；b为人脐带血间充质干细胞培养14d，排列呈网状、辐射状(倒置显微镜，×200)；c为第3代人脐带血间充质干细胞，细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态(倒置显微镜，×200)。

图2、一般水溶液与d2o外泌体得率对比图，图中：分别选取4组脐带血msc进行提取外泌体，分别采用一般水溶液和重水作为基础缓冲液制备缓冲垫。从图中可以看出，相同细胞数采用不同的基础缓冲液直接影响到外泌体得率，d2o基础缓冲液明显高于一般水溶液。图中，对于a、b、c、d四个组，其各自左侧较短柱是一般水溶液作为基础缓冲液制备的缓冲垫，右侧较长柱是重水作为基础缓冲液制备的缓冲垫。

图3、人脐带血间充质干细胞表面抗原分子的流式细胞仪鉴定图，图中：表达表面抗原cd73，cd90，cd105≥99％，不表达表面抗原hla-dr，cd-34，cd-45，cd19，cd11b≤0.5％。

图4、扫描电镜下观察外泌体，可见外泌体直径约为50～120nm，有完整的脂质膜，小体中心呈低电子密度成分，圆形或椭圆形的膜性囊泡结构。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

实施例1、脐带血msc培养

1.1、脐带血的采集：

选取足月新生儿的脐带(要求直系亲属过往无重大疾病史，采集过程需严格无菌采集，血量至少采集50ml)，将其中的脐带血采集到一次性无菌塑料采血袋中，运输全程低温保鲜。

1.2、脐带血预处理：

将采集到的脐带血，通过100μm孔径的过滤器转移至新的离心管中，以去除多余血块。

1.3、脐带血单个核细胞提取：

1.3.1、将过滤后的脐带血(例如取50ml)与pbs按1:1比例混匀(总体积为100ml)得到细胞悬液，再取细胞悬液15ml加入装有ficoll分离液的50ml离心管内，细胞悬液与ficoll分离液体积比为5：3，进行离心2000rpm/min，30min，4℃，升速度1，降速度0；

[pbs是本领域技术人员熟知的，在本发明中，如未另外说明，使用的pbs是磷酸盐缓冲液(ph6.8)，其由如下方法配制：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。]

ficoll分离液离心后，液面分为四层，依次是：红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐带血单个核细胞层、血浆层。

1.3.2、用移液管尽量吸尽脐带血单个核细胞层，转移至装有5ml脐带血msc培养基1的50ml离心管内并混匀，得悬液；另外将血浆层提取到另一个50ml离心管中备用，用于msc培养基配置。

1.3.3、用0.22μm孔径的过滤器将悬液进行过滤，以除去多余淋巴细胞及杂质，得到细胞悬液。

1.4、脐带血msc的p0代培养

1.4.1、将细胞悬液接种于t25培养瓶内，再加入10ml脐带血msc培养基1，将t25培养瓶置于体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中进行培养。

1.4.2、待原代细胞接种48h左右，向t25培养瓶中加入3ml脐带血msc培养基1，之后每隔2-3天，加一次液，总共加3-4次培养基；之后每隔3天，去除原来的培养基，加入15ml脐带血msc培养基1，对细胞进行换液处理，总共换液2-3次。

[本发明采用的脐带血msc培养基1组分：imdm基础培养基(gibco)、体积浓度为10％的脐带血血浆、15ng/ml的gm-csf、体积浓度2％hepes、体积浓度1％青-链霉素、体积浓度1％l-谷氨酰胺。脐带血msc培养基1优点在于，能够快速有效的促使脐带血msc原代细胞快速生长，细胞得率较高。]

1.5、脐带血msc的p1-p3代培养

1.5.1、待脐带血msc原代细胞汇合率达到40％-50％时，做p0代传p1代处理，吸弃t25瓶中原有的培养基，吸取10ml的pbs缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，洗涤完毕去除pbs缓冲液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液1ml，浸漫覆盖t25培养瓶底部，再将培养瓶放置于co2培养箱中孵育30-60s，轻轻拍打培养瓶侧面，倒置显微镜下观察，待msc细胞皱缩成圆形，成流沙状漂浮时，加入5ml脐带血msc培养基1进行终止消化，用5ml移液管充分吹打培养瓶底部并收集细胞于15ml离心管内。进行离心1400rpm/min，5min，4℃，升速度9，降速度7。

1.5.2、离心后，弃去上清，用5ml的imdm基础培养基重悬细胞，吸取200μl细胞悬液并用adam计数仪计数，按照3500-5000细胞/cm²密度接种于t75培养瓶中，并加入新的脐带血msc培养基2，置于体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，记为脐带血msc的p1代细胞。

1.5.3、待细胞汇合率达到80-90％时，重复上述操作，将脐带血msc进行p2、p3代细胞扩增。

[细胞形态可见图1。

本发明采用的脐带血msc培养基2组分：imdm基础培养基(gibco)、体积浓度为10％的脐带血血浆、10ng/ml的il-1β、体积浓度2％hepes、体积浓度1％青链霉素、体积浓度1％l-谷氨酰胺；本发明在这里去加入的新的培养基，目的在于，新的培养基可以刺激msc细胞分泌更多的外泌体]。

实施例2、脐带血msc外泌体的提取

接续实施例1进行本实施例2。

2.1、外泌体悬液预处理

2.1.1、外泌体来源一

待p3代脐带血msc汇合率达到75％～85％时，尽量收集培养瓶中的培养基，放入4℃冰箱待用。

2.1.2、外泌体来源二

用50ml的pbs铺满已去除培养基的培养瓶，将装有pbs的脐带血msc的p3代细胞培养瓶放入体积分数为5％co2饱和湿度培养箱中进行培养，饥饿脐带血msc细胞24h，之后收集培养瓶中的pbs。

2.1.3、外泌体来源三

2.1.3.1、pbs饥饿后的p3代脐带血msc，通过加入0.25％胰蛋白酶-0.01％edta消化液，将培养瓶中的细胞消化下来并收集到新的50ml离心管内，用pbs定容到20ml，取500μl细胞悬液血球仪计数。

2.1.3.2、计算得到脐带血msc细胞数，取6*10⁷脐带血msc的p3细胞，转移至新的15ml离心管内，进行离心300*g，10min，升速度9，降速度7。

2.1.3.3、去除上清液，用3ml的pbs重悬细胞，离心并且重复加入pbs洗涤。

2.1.3.4、洗涤后去除pbs，向细胞沉淀加入1.5ml具有缓冲作用的细胞裂解液，并且在低温冰袋上孵育30min，期间每隔5min，在旋窝振荡器上混匀1min，共振荡4次。

[本专利提供细胞裂解液配方组分：300mmol/l的nacl，50mmol/l的tris(ph7.4)，3mmol/l焦磷酸钠，1％聚乙二醇辛基苯基醚，0.1％十二烷基硫酸钠(sds)，1.5mmol/l的edta，30mmol/l的β-甘油磷酸钠。用经过高温高压的纯化水按比例稀释并溶解，室温储存3个月再进行使用。]

2.1.3.5、孵育结束，再次离心20000*g，30min，升速度9，降速度7，提取全部上清液转移至新的15ml离心管内，用pbs稀释至10ml，放入-80℃冰箱低温保存至少24h。

2.1.4、将2.1.3.5中的悬液复苏并与前面2.1.1步骤中的培养基、前面2.1.2从培养瓶中收集的pbs进行混合，作为外泌体来源混合液，用于共同提取外泌体。

2.2、外泌体提取

2.2.1、用pbs对外泌体来源混合液进行稀释(1:1)，配平，进行离心，转速350*g，15min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余msc细胞。

2.2.2、小心将离心后的上清收集到新的离心管中，去除沉淀，离心，转速2500*g，20min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余死细胞。

2.2.3、再次将上清收集到新的离心管中，弃沉淀，并再次离心13000*g，30min，升速度9，降速度7，4℃，以去除多余细胞碎片。

2.2.4、轻轻将离心后的上清收集到新的离心管内，并进行超高速离心，转速110000*g，2h，升速度9，降速度7，4℃，所得沉淀物为外泌体中间产物。

2.2.5、弃上清，用pbs稀释沉淀物(外泌体中间产物)，通过0.22μm过滤器过滤悬液，将悬液定容到一个50ml离心管内，体积控制在25ml。

2.2.6、在一个新的50ml离心管底部加入配置好的4.5ml的tris/蔗糖/d2o溶液，形成缓冲垫。将25ml悬液轻轻加在缓冲垫上方，避免冲破液面。再次进行超高速离心，转速100000*g，80min，升速度9，降速度9，4℃；

2.2.7、弃上清，用18g针头的5ml注射器收集含有外泌体的缓冲垫，将缓冲垫用pbs稀释到50ml，进行高速离心100000*g，60min，升速度9，将速度7，4℃。离心后尽量去除上清液，沉淀即为外泌体，用100ml的pbs重悬外泌体进行清洗，并进行高速离心100000*g，20min，去除上清液，再用100ml的pbs重复清洗外泌体、如上高速离心2-3次。最终用5ml的pbs稀释并混匀，得到最终外泌体，任选的将其放入-80℃冰箱低温保存。

[本发明提供缓冲垫配置方法，配置方法如下：事先准备30g无蛋白酶蔗糖、2.4g的tris碱、50ml的d2o，将其充分混匀，再用10mol/l的hcl滴定调节ph至7.4，用d2o将体积调制成100ml，通过0.22μm过滤器过滤并高压灭菌，在4℃冰箱储存，2个月内使用。

运用缓冲垫提取外泌体的目的在于利用外泌体悬液与缓冲垫形成的密度差，再辅以超高速离心，较大程度提高了外泌体的纯度。本专利采用d2o为基础缓冲溶液提取效果明显优于一般水溶液，在此分别选取4组脐带血msc进行提取外泌体，分别采用一般水溶液(h2o)和d2o作为基础缓冲液制备缓冲垫，对比数据如图2。可见本发明采用d2o作为基础缓冲液，外泌体得率明显较高。

用pbs多次重复清洗最终外泌体沉淀，可以完全除去d2o残留及其它杂质。]

对上述实施例1和实施例2所得脐带血msc和外泌体进行下面实施例3～5的试验，并且其结果记载于实施例3～5中。

实施例3、脐带血msc流式检测

3.1、待脐带血间充质p3代细胞生长至75％～85％汇合时，去除培养瓶中原有的培养基，每瓶用50ml的pbs清洗一遍，在用0.25％胰蛋白酶常规消化细胞并且离心，离心1400rpm/min，升速度9，降速度9，10min。

3.2、用pbs将p3代细胞重悬至1*10⁷细胞/ml，分别加入鼠抗人单克隆标记抗体

cd90-pc5，cd105-pc7，cd73-fitc，hla-dr/cd-34/cd-45/cd19/cd11b-pe，以鼠抗人的igg1-fitc，igg1-pe，igg1-pc5，igg1-pc7作为同型对照。

3.3、室温避光孵育20min，利用流式细胞仪检测。结果显示分离所得的细胞表达间充质干细胞表面抗原cd73，cd90，cd105均在99％以上，而不表达hla-dr，cd-34，cd-45，cd19，cd11b均低于0.5％，结果见图3。由图3可见，制备的脐带血msc纯度很高。

实施例4、外泌体形态学鉴定

4.1、取50μl含有外泌体的pbs悬液，将其重悬于100μl的2％多聚甲醛中。

4.2、从上述悬液中，取20μl外泌体悬液加到碳膜载样铜网上。盖上盖子，在干燥环境中让碳膜吸收20min。

4.3、将300μl的pbs滴入一片石蜡膜上。用干净的镊子将铜网(碳膜侧向下)转移到pbs液滴下以进行洗涤。

4.4、pbs洗涤过后，将碳膜载样铜网转移到50μl的1％戊二醛中孵育5min。

4.5、孵育后再转移到300μl蒸馏水中，让铜网放置2分钟。重复七次，共八次水洗。

4.6、将铜网转移到100μl的ph7的草酸二铀酸盐溶液中孵育5min。

4.7、再将铜网转移到150μl甲基纤维素-ua(乙酸铀酰)20min，在冰上进行操作。(甲基纤维素-ua：2％甲基纤维素和4％乙酸铀酰混合)

4.8、用不锈钢环去除铜网，并通过轻轻地将环路横向移动到whatmanno.1滤纸，让滤纸轻轻吸取多余液体，留下一薄层甲基纤维素膜。(不锈钢环，略大于铜网)

4.9、在电子显微镜下观察。

阴性染色的外泌体会在电子显微镜显示为直径50至120nm的杯状膜囊泡，有完整的脂质膜，小体中心呈低电子密度成分，圆形或椭圆形的膜性囊泡结构(图4)，符合外泌体的形态特征。

实施例5、流式检测外泌体表面标志

5.1、取500μl外泌体悬液，用pbs稀释重悬至2ml，分装于两个流式管内(每管1ml)。

5.2、分别加入鼠抗人单克隆标记抗体cd63-pe，cd9-pe，室温避光孵育20min，用pbs清洗一遍。

5.3、用1％多聚甲醛进行再次重悬，利用流式细胞仪检测，结果显示脐带血msc来源外泌体表达cd63和cd9。