本发明涉及一种单链DNA的扩增方法，具体涉及一种基于链霉亲和素包被的纳米微粒单链DNA扩增方法。
背景技术：
DNA的半保留复制是生物遗传和进化的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。而聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术则是在体外通过温度控制实现特定基因的体外复制的一种生物学技术。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。
作为生命科学研究中广泛使用的一种选择性体外扩增DNA片段的方法，PCR反应原理与细胞内 DNA的半保留复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列，与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物，四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。其基本过程是以拟扩增的DNA分子为模板，首先高温变性，将混合物加热到94℃ 维持15到30秒，使模板DNA双链解旋成两条单链，然后逐渐降温退火，温度降到55 ℃，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，最后在引物、DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
随着PCR技术在生命科学领域的广泛应用，在传统PCR技术的基础上，根据人民的需要及各个领域的应用要求，有衍生出很多不同种类的PCR技术：1、常规RT-PCR 由于目前常利用cDNA来研究基因的功能，而cDNA是由mRNA反转录而成。所以采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR)可扩增大量cDNA。 2、巢式PCR(嵌套PCR) 这是一种对PCR的优化模式，不受平台效应的限制，而且比单一的一对引物PCR 扩增灵敏度特异性高1000倍。 3、多重PCR(复合PCR) 这是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术。4、原位PCR：就是直接在组织细胞里进行PCR反应，PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，再通过显微镜观察结果。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理 和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。5、反向PCR(IPCR)：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，是扩增引物外未知序列常用的方法。另外还有多种PCR相关的技术。如MSP甲基化特异PCR，免疫PCR，锚定PCR，RACE-cDNA末端的快速扩增，定量PCR等多种不同的PCR扩增技术。
不对称PCR(asymmetric PCR)作为当前一种最主要的单链DNA扩增技术，在构建单链DNA文库、基因测序或者基因芯片等方面的研究中具有重要的作用。其特点是通过使用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物（低浓度引物）消耗完后，非限制性引物（高浓度引物）引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。但是实际上不对称PCR的产物包含ds-DNA和ss-DNA，不但在实验中需要多次摸索优化两条引物的比例，从而消耗大量的时间。而且后期的电泳分离和胶回收还会导致很多ss-DNA的丢失，因此可能会严重影响了后期的实验，特别是对于ss-DNA文库的构建具有不可忽视的影响。
国内专利200410056866.0提供了一种不对称PCR扩增方法及其专用引物与应用其特征在于每对引物对中的一条引物的5’端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。同时扩增分为两个阶段，第一阶段依然是普通PCR反应，第二阶段则以寡核苷酸尾部延伸获得单链DNA。但是这种方法最大的问题在于扩增的单链DNA中引入了无关DNA，可能会引起核酸序列构象的改变，因此只能作为单链核酸探针应用于基因检测等方面的研究。
1989年Higuchi and Ochman等提出了一种核酸外切酶法（Higuchi and Ochman，Nucleic.Acids Res.,1989，17：5865），由于一条PCR引物被磷酸化，PCR产物再用核酸外切酶消化时，磷酸化的引物扩增链不被切割。但是这种方法生产单链DNA的效率依赖于核酸外切酶的效率。
2000年Dickman and Hornby提出的变性高效液相色谱法（DHPLC）也是一种制备单链DNA的方法，由于一条PCR引物被生物素化，其扩增产物在DHPLC时会与普通引物扩增产物相分离。从而制备出高质量的单链DNA，但是由于DHPLC需要昂贵的实验设备，因此这种方法难以在实验室普及。
CN1475576A公开了一种单链DNA快速制备技术及试剂盒，提出了一种固相化PCR的技术方法，但是在其方法中利用抗体，亲和素、凝集素以及金属螯合物与相应配体的结合均缺乏稳定性。在高温、pH变化等极端条件下可能会引起固相单链DNA的脱落。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于链霉亲和素包被的纳米微粒单链DNA扩增方法，可以在60-120min内完成单链DNA的大量扩增，明显改善现有技术中分离操作时间长、操作繁琐的缺陷，提高单链DNA制备的效率。
本发明所采用的技术方案为：
基于链霉亲和素包被的纳米微粒单链DNA扩增方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
利用链霉亲和素包被的纳米微粒将生物素标记的PCR扩增引物固定在金属纳米微粒表面，之后进行单链DNA扩增反应。
纳米微粒为纳米磁珠或不具有磁性的葡聚糖或琼脂糖微粒，直径不大于100nm。
单链DNA扩增反应后，通过磁力吸附、离心或者过滤的方式将PCR扩增后吸附有单链DNA的纳米微粒分离出来。
对PCR反应中的一条引物做5’端生物素化标记。
将链霉亲和素包被的纳米微粒与生物素标记的引物在室温或者37℃孵育后加入PCR反应体系；
或在PCR反应体系中直接加入链霉亲和素包被的纳米微粒。
所述的基于链霉亲和素包被的纳米微粒单链DNA扩增方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：在室温或者37℃条件下将链霉亲和素包被纳米微粒与生物素标记的引物共同孵育10-60min后通过磁性分离或者离心、过滤等方式分离已结合的纳米微粒；
步骤二：将已结合的纳米微粒与待扩增靶序列、dNTP、Taq酶、10xPCR buffer、未标记引物共同配制单链DNA扩增体系并按照引物Tm值设定PCR反应条件；
步骤三：PCR产物的磁性分离或者离心、过滤分离。
所述的基于链霉亲和素包被的纳米微粒单链DNA扩增方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：将链霉亲和素包被的纳米微粒与待扩增靶序列、dNTP、Taq酶、10xPCR buffer、未标记引物共同配制单链DNA扩增体系37℃孵育10-30min；
步骤二：按照引物Tm值设定PCR反应条件；
步骤三：PCR产物的磁性分离或者离心、过滤分离。
本发明具有以下优点：
1、本发明利用了生物素与链霉亲和素特异性识别并形成不可逆反应的特点，将生物素标记的引物固定到链霉亲和素包被的纳米微粒上，从而使PCR反应可以在固相支持物上进行，然后通过磁力、离心或者过滤等方法固液分离就可以获得目的单链DNA。其作用简单高效，明显改善了以前其他单链DNA扩增的耗时、费力的实验方法。
2、本发明中蛋白的分离和核酸的分离只需要简单的磁性分离器、离心机或者过滤装置，大大减少了对DHPLC等分选设备和电泳设备的依赖，提高了单链DNA扩增方法的经济性。
3、本发明中要求纳米微粒的直径不大于100nm，有助于保证纳米微粒在PCR反应体系中始终以悬浊液的形成存在，防止由于纳米微粒沉淀导致的反应体系中的接触面积减小。从而保证单链DNA扩增反应的高效制备。
附图说明
图1为本发明单链DNA扩增方法示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
现有PCR技术适用于双链DNA的扩增和富集，而单链DNA的扩增则存在扩增产物混杂双链DNA、步骤繁琐等缺陷。本发明涉及一种基于链霉亲和素包被的纳米微粒单链DNA扩增方法，是通过生物素与链霉亲和素包被的纳米微粒形成不可逆结合，从而实现单链DNA扩增的方法，可以选择性的获得样品DNA的正链或者反链DNA，能明显改善单链DNA的扩增效率，在建立单链DNA文库、基因测序或者基因芯片等方面的研究中具有重要的作用。
该方法利用链霉亲和素包被的纳米微粒将生物素标记的PCR扩增引物固定在金属纳米微粒表面，之后进行单链DNA扩增反应。纳米微粒需要包被链霉亲和素，从而形成与生物素标记引物不可逆结合的固相反应基。
纳米微粒为纳米磁珠或不具有磁性的葡聚糖或琼脂糖微粒，直径不大于100nm，保证固相结合物具有较大的表面积，从而保证单链扩增反应产生的单链DNA可以充分结合到纳米微粒表面。在单链DNA扩增体系中，纳米微粒能够在反应中保持悬浊液的形式，从而保证整个反应过程的不因为纳米微粒的沉淀而终止反应。单链DNA扩增反应后，通过磁力吸附、离心或者过滤的方式将PCR扩增后吸附有单链DNA的纳米微粒分离出来。
本方法可以根据需要对PCR反应中的一条引物做5’端生物素化标记，以便于扩增完成后分离单链DNA。
本方法可以将链霉亲和素包被的纳米微粒与生物素标记的引物在室温或者37℃孵育后加入PCR反应体系；或在PCR反应体系中直接加入链霉亲和素包被的纳米微粒。
将链霉亲和素包被的纳米微粒与生物素标记的引物在室温或者37℃孵育后加入PCR反应体系时，本方法具体包括以下步骤：
步骤一：在室温或者37℃条件下将链霉亲和素包被纳米微粒与生物素标记的引物共同孵育10-60min后通过磁性分离或者离心、过滤等方式分离已结合的纳米微粒；
步骤二：将已结合的纳米微粒与待扩增靶序列、dNTP、Taq酶、10xPCR buffer、未标记引物共同配制单链DNA扩增体系并按照引物Tm值设定PCR反应条件；
步骤三：PCR产物的磁性分离或者离心、过滤分离。
在PCR反应体系中直接加入链霉亲和素包被的纳米微粒时，具体包括以下步骤：
步骤一：将链霉亲和素包被的纳米微粒与待扩增靶序列、dNTP、Taq酶、10xPCR buffer、未标记引物共同配制单链DNA扩增体系37℃孵育10-30min；
步骤二：按照引物Tm值设定PCR反应条件；
步骤三：PCR产物的磁性分离或者离心、过滤分离。
实施例1：
1、固相引物的制备；
取100μM的生物素标记的引物5μl与100μl链霉亲和素包被的磁性纳米微粒室温下孵育30min后，在磁力分选器作用下去除液相，去离子水漂洗后，再次利用磁力分选器去除漂洗液。然后加入5μl去离子水悬浮备用。
1、单链DNA扩增体系：
单链DNA扩增反应条件：
根据引物Tm值，按照PCR反应常规条件设置单链DNA扩增反应条件。
3、单链DNA的分离：
扩增反应完成后，使用磁性分离器将反应体系固液分离，吸取液相保存。加入适量去离子水漂洗纳米微粒后，再次使用磁性分离器固液分离吸取漂洗液并入上次液相保存液中。即为扩增的的单链DNA。
实施例2：
1、固相引物的制备；
取100μM的生物素标记的引物5μl与100μl链霉亲和素包被的非磁性纳米微粒室温下孵育30min后，在离心机离心后去除液相，去离子水漂洗后，再次利用离心去除漂洗液。然后加入5μl去离子水悬浮备用。
2、单链DNA扩增体系：
单链DNA扩增反应条件：
根据引物Tm值，按照PCR反应常规条件设置单链DNA扩增反应条件。
3、单链DNA的分离：
扩增反应完成后，使用离心机将反应体系固液分离，吸取液相保存。加入适量去离子水漂洗纳米微粒后，再次使用离心机固液分离吸取漂洗液并入上次液相保存液中。即为扩增的的单链DNA。
实施例3：
1、固相引物的制备；
取100μM的生物素标记的引物5μl与100μl链霉亲和素包被的磁性纳米微粒室温下孵育30min后，在磁力分选器作用下去除液相，去离子水漂洗后，再次利用磁力分选器去除漂洗液。然后加入5μl去离子水悬浮备用。
2、单链DNA扩增体系：
单链DNA扩增反应条件：
根据引物Tm值，按照PCR反应常规条件设置单链DNA扩增反应条件。
3、单链DNA的分离：
扩增反应完成后，使用磁性分离器将反应体系固液分离，吸取液相保存。加入适量去离子水漂洗纳米微粒后，再次使用磁性分离器固液分离吸取漂洗液并入上次液相保存液中。即为扩增的的单链DNA。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。