用于合成和检测核酸的组合物、方法和试剂盒与流程

本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2016年4月6日提交的美国临时专利申请第62/319,151号的优先权的利益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。

本教导属于分子生物学和遗传分析的领域。本发明涉及可用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地说，提供了用于扩增、检测和/或定量核酸分子的组合物、方法和试剂盒，所述核酸分子尤其是那些具有低拷贝数(copynumber)和/或如在粗裂解物中存在抑制物的情况下的核酸分子。

背景技术

在其最简单的形式下，聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是用于使用两个寡核苷酸引物来酶促合成特异性dna序列的体外方法，所述两个寡核苷酸引物与相对链杂交并位于靶dna中的靶标区域的侧面。包括模板变性(templatedenaturation)、引物退火和dna聚合酶延伸退火引物的一系列重复的反应步骤引起特异性片段的指数积累，所述特异性片段的末端由引物的5'端限定。pcr能够产生10⁹倍选择性富集的特异性dna序列。参见例如美国专利第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159和第4,965,188，和saiki等人，1985，《科学(science)》230:1350。

市售pcr主混合物提高了效率并减小了与高通量分析所需的大量pcr反应的组装相关的误差。这些主混合物含有所有pcr反应共用的试剂的组合。举例来说，主混合物可以含有缓冲剂、盐如mgcl2、脱氧核苷三磷酸(dntp)和热稳定dna聚合酶。主混合物通常作为浓缩溶液或冻干粉末来制造和分配，随后在组装最终反应时稀释或溶解。

对于准确的核酸分析，pcr主混合物应提供可靠的稳健的并且可重复的pcr结果。此外，pcr主混合物应允许检测低拷贝数靶核酸。举例来说，许多医学、诊断和法医应用依赖于样品中的特定dna序列的扩增，在所述样品中序列以非常低的量存在。另外，许多这类应用依赖于从粗制或未纯化样品如细胞或组织粗裂解物的核酸序列的扩增。

因此，需要利用所有类型的核酸样品来可靠地发挥作用的pcr组合物，所述样品包括粗制样品制剂和/或那些具有少量靶标的样品。

技术实现要素：

本文提供了用于通过聚合酶依赖性核酸合成(包括例如使用聚合酶链式反应(pcr))来合成、检测和/或定量核酸的组合物、试剂盒和方法。在一些实施例中，本文提供了包含dna聚合酶、盐、消泡剂和dntp与dntp衍生物的组合的组合物。

在某些实施例中，本教导提供了包含热稳定dna聚合酶的组合物。在一些实施例中，热稳定dna聚合酶选自以下：taqdna聚合酶；tnedna聚合酶；tmadna聚合酶；pfudna聚合酶；koddna聚合酶；tfldna聚合酶；tthdna聚合酶；stoffel片段dna聚合酶；vent^tmdna聚合酶；deepvent^tmdna聚合酶；和其突变体、变异体或衍生物。在一些实施例中，热稳定dna聚合酶是taq衍生的dna聚合酶。

在某些实施例中，本教导提供了包含钾盐、镁盐和/或钠盐的组合物。在一些实施例中，盐浓度是约5mm到约200mm。

在一些实施例中，所述组合物包含硅酮基消泡剂。在一些实施例中，硅酮基消泡剂选自以下：afe-1010、afe-1430、afe-1510、afe-1520、afe-2210、消泡剂a、消泡剂b、消泡剂c、消泡剂h-10、消泡剂se-15、消泡剂se-35、消泡剂so-25、消泡剂y-30和消泡剂289。在一些实施例中，所述组合物包含非硅酮基消泡剂。在一些实施例中，非硅酮基消泡剂选自以下：有机磺酸酯、聚醚、有机磷酸酯、炔二醇、碳氟化合物、聚烯烃多胺和聚亚烷基亚胺化合物，包括但不限于消泡剂204和消泡剂o-30。在一些实施例中，消泡剂的浓度是约0.001％到0.1％。

在一些实施例中，dntp选自dgtp、dctp、datp和dttp。在一些实施例中，dntp是dgtp。在一些实施例中，dgtp的浓度是0.05mm到1.0mm

在一些实施例中，dntp衍生物选自以下：7-脱氮-2-脱氧-gtp、7-脱氮-datp、α-硫代datp、α-硫代dttp、α-硫代dgtp和α-硫代dctp。在一些实施例中，dntp衍生物是7-脱氮-2-脱氧-gtp。在一些实施例中，dntp衍生物是7-脱氮-2-脱氧-dgtp。在一些实施例中，7-脱氮-2-脱氧-dgtp的浓度是0.05mm到1.0mm。

在一些实施例中，所述组合物包含呈约1:2到约2:1比率的dgtp和7-脱氮-2-脱氧-dgtp。在一些实施例中，所述组合物包含呈约1:2到约1:10比率的dgtp和7-脱氮-2-脱氧-dgtp。在一些实施例中，所述组合物包含呈约2:1到约10:1比率的dgtp和7-脱氮-2-脱氧-dgtp。在一些实施例中，所述组合物包含呈约1:1比率的dgtp和7-脱氮-2-脱氧-dgtp。

在某些实施例中，所提供的组合物进一步包含pcr抑制物阻断剂。在一些实施例中，pcr抑制物阻断剂是蛋白质。在一些实施例中，pcr抑制物阻断蛋白质选自白蛋白、明胶和其组合。在一些实施例中，所述组合物包含明胶和血清白蛋白。在某些实施例中，明胶选自牛明胶、鱼明胶和其组合。在某些实施例中，牛明胶的浓度是0.01％到1.0％且/或所述鱼明胶的浓度是0.01％到1.0％。在一些实施例中，血清白蛋白是牛血清白蛋白。在某些实施例中，牛血清白蛋白的浓度是0.05mg/ml到5mg/ml。

在某些实施例中，所提供的组合物进一步包含清洁剂。在一些实施例中，清洁剂是非离子型清洁剂。在一些实施例中，非离子型清洁剂选自以下组成的组：曲拉通(triton)x-诺纳德p-40(nonidetp-40)、吐温80(tween80)、brij30、brij35和brij58。在一些实施例中，非离子型清洁剂是除吐温-20之外的清洁剂。在一些实施例中，非离子型清洁剂以0.005％到0.1％的浓度存在于所述组合物中。在某些实施例中，所提供的组合物进一步包含被动参考对照染料(passivereferencecontroldye)。在一些实施例中，被动参考对照染料是荧光染料。在一些实施例中，被动荧光被动参考染料是rox染料或mustangpurple染料。在一些实施例中，被动参考染料的浓度是约25nm到约500nm。

在某一个实施例中，本教导提供了包含以下的组合物：热稳定dna聚合酶、氯化钾、包含硅的消泡剂、dgtp和7-脱氮-2-脱氧-dgtp(其中7-脱氮-2-脱氧-dgtp的浓度是约0.05mm到1.0mm)、除吐温-20之外的非离子型清洁剂、呈0.01％到1.0％浓度的牛明胶、呈0.01％到1.0％浓度的鱼明胶和呈0.05mg/ml到5.0mg/ml浓度的牛血清白蛋白。

在某些实施例中，本教导提供了用于进行核酸合成的方法，其包含使本文所提供的组合物与包含靶多核苷酸的生物样品以及靶特异性引物以任何顺序或组分的组合形式接触以形成反应混合物，并在反应混合物中进行核酸合成反应以形成扩增产物。在一些实施例中，核酸合成反应是聚合酶链式反应(pcr)。在一些实施例中，核酸合成反应是扩增反应。在一些实施例中，核酸合成反应是引物延伸反应。

在一些实施例中，所提供的方法进一步包含使用扩增产物确定靶多核苷酸的基因型。在一些实施例中，所提供的方法进一步包含使用扩增产物确定靶多核苷酸的拷贝数。

在所提供的方法的一些实施例中，与利用标准pcr反应混合物进行的同等pcr相比，使用如本文所描述的组合物或反应混合物进行的pcr的运作时间缩短。在一些实施例中，与利用标准pcr反应混合物进行的同等pcr相比，使用如本文所描述的组合物或反应混合物进行的pcr在更短的时间内产生扩增产物。

在一些实施例中，pcr是单重pcr。在一些实施例中，pcr是多重pcr。如本文所使用的术语“单重”或“单重pcr”是指为在反应容器内扩增单一产物而提供的测定。使用不同的引物对来引发产物。单重反应可以进一步包括对扩增产物具有特异性的标记探针，其中探针可以用可检测部分如荧光染料来检测性地标记。如本文所使用的术语“多重”或“多重pcr”是指为在同一反应容器内同时扩增两种或更多种产物而提供的测定。使用不同的引物对来引发每种产物。多重反应可以进一步包括对每种产物具有特异性的标记探针，其中探针可以用不同的可检测部分来检测性地标记。在一些实施例中，多重pcr包括那些其中具有以下情况的pcr：(i)在单一样品中扩增多个靶标；在一个样品中扩增两个或更多个靶标，或(ii)同时扩增多个样品；在单一反应中在基本上同一时间在两个不同样品中扩增两个靶标。

在所提供的方法的一些实施例中，生物样品是裂解物，如血液裂解物或包含口腔衍生的细胞的裂解物。在一些实施例中，生物样品来自唾液、尿液或血清。在一些实施例中，裂解物是粗裂解物。在一些实施例中，生物样品包含一种或多种pcr抑制物，其包括包括但不限于igg、血红素、肝素、edta、柠檬酸钠或其任何组合。

在某些实施例中，本教导提供了包含本文所提供的组合物的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒进一步包含对核酸合成(例如pcr扩增)产物和/或dna靶标的检测具有特异性的引物对和/或标记探针。

在某些实施例中，本教导提供了包含以下的试剂盒：本文所提供的组合物、对照核酸样品和对核酸合成(例如pcr扩增)产物和/或对照核酸样品中的dna靶标的检测具有特异性的引物对和/或标记探针。

通过以下图示和具体实施方式来举例说明上述特性和其它特性。

附图说明

图1a-图1g显示用于两微升口腔粘膜粗裂解物样品的作为pcr循环的函数的δrn的图表，所述样品在使用本文所公开的组合物(左上组)和市售pcr主混合物(右上组)的实施例进行的两次重复运作的rnaseptaqman^tm拷贝数测定中扩增。下组显示在各体积的所添加裂解溶液中的两种主混合物的结果的单独图表。

图2a-图2g显示用于改变原始唾液样品量的作为pcr循环的函数的δrn的图表，所述样品在使用本文所公开的组合物(左上组)和市售pcr主混合物(右上组)的实施例进行的两次重复运作的rnaseptaqman^tm拷贝数测定中扩增。下组显示在各体积的原始唾液中的两种主混合物的结果的单独图表。

图3显示使用本文所公开的组合物的实施例进行的血液粗裂解物测定的基因分型曲线。

图4a-图4b是用血液粗裂解物(左侧柱)和相应的纯化dna样品(右侧柱)进行的拷贝数变化测定的结果图表。用本文所公开的组合物的实施例来进行测定。

图5a-图5d显示用于包含不同量的浓度范围是0％到0.1％的消泡剂(消泡剂204)的反应混合物的作为pcr循环的函数的green荧光信号的图表。使用viia7实时pcr系统在384孔微量滴定板上重复96次进行反应(10ul)。

图6a-图6d显示用于包含不同量的浓度范围是0％到0.1％的消泡剂(se-15)的反应混合物的作为pcr循环的函数的green荧光信号的图表。使用viia7实时pcr系统在384孔微量滴定板上重复96次进行反应(10ul)。

具体实施方式

在一些实施例中，本文提供了用于合成、检测和/或定量核酸的组合物、方法和试剂盒。在一些实施例中，本文提供了用于通过聚合酶介导的核酸合成(包括但不限于引物延伸或聚合酶链式反应(pcr))来合成、检测和/或定量核酸的组合物、方法和试剂盒。在一些实施例中，本文所提供的组合物特别地有效并且对粗制或未纯化核酸样品如粗裂解物或粗提取物展现出优异的性能。

在一些实施例中，本文所公开的组合物可用于广泛的包括检测、定量和/或表征靶核酸的测定。举例来说，所述组合物可用于包括但不限于单核苷酸多态性(snp)、微卫星分析和其它突变基因分型的基因分型、拷贝数测定和变异分析、检测基因表达和检测小rna表达(例如微rna表达)的测定。

还公开了包含所述组合物的试剂盒以及使用所述组合物和试剂盒的方法。

在一个方面中，本文提供了组装pcr主混合物组合物，当在标准pcr仪器上运作时，与标准pcr试剂混合物相比，其显示出优异的性能灵敏度、准确度和特异性。在一些实施例中，与使用标准pcr组合物相比，使用本文所提供的组装pcr主混合物引起粗制或未纯化样品制剂中存在的核酸靶分子的优异扩增、检测和/或定量。在一些实施例中，与使用标准pcr主混合物组合物相比，使用本文所提供的组装pcr主混合物引起以低拷贝数存在于样品制剂中的核酸靶分子的优异扩增、检测和/或定量。

在一些实施例中，与使用标准pcr组合物相比，使用本文所提供的组装pcr组合物进行基因分型引起提高的灵敏度和特异性。在一些实施例中，与使用标准pcr组合物相比，使用本文所提供的组装pcr组合物进行基因表达分析引起提高的灵敏度值。在一些实施例中，用于使用粗裂解物或未纯化核酸样品进行基因分型或基因表达分析的这类组装pcr组合物产生的结果与用相应的纯化核酸样品获得的结果相当。

在一些实施例中，与使用标准pcr组合物相比，使用本文所提供的组装pcr组合物进行拷贝数测定和/或拷贝数变化分析引起提高的灵敏度、准确度和特异性。在一些实施例中，与使用标准pcr组合物相比，使用本文所提供的组装pcr组合物进行拷贝数测定和/或拷贝数变化分析引起更高的拷贝数检出率(copynumbercallrate)和一致性。在一些实施例中，与使用标准pcr组合物相比，使用本文所提供的组装pcr组合物进行拷贝数测定和/或分析提高了较低的拷贝数范围(最大值到最小值)和空值。当使用粗制核酸样品如粗裂解物或纯化核酸样品时，在拷贝数变化分析中发现这类提高。在一些实施例中，使用本文所提供的组装pcr组合物以进行使用粗裂解物作为核酸样品的拷贝数变化分析产生的结果与用相应的纯化核酸样品获得的结果相当。

在一些实施例中，与本文所公开的组合物组装的pcr的优异灵敏度允许缩短fast或标准pcr仪器上的pcr运作时间。在一些实施例中，pcr组合物用于单重pcr和检测反应。在一些实施例中，pcr组合物用于多重pcr和检测反应。多重pcr通常通过从单一反应中同时检测多重靶标来降低运作成本和样品使用。

在一些实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、盐、消泡剂和dntp的组装组合物。在一些实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、盐、消泡剂和至少一种dntp和至少一种dntp衍生物的组合的组装组合物。

在一些方面中，本教导的组合物包含一种或多种聚合酶。这类聚合酶可以是能够复制dna分子的任何酶。在一些实施例中，所述组合物可以包含dna依赖性dna聚合酶、用于逆转录的酶(rna依赖性dna聚合酶)和/或两种类型的酶的组合。在一些实施例中，dna依赖性dna聚合酶的组合和/或rna依赖性dna聚合酶的组合可以存在于本文所公开的组合物中。

在一些实施例中，如本文所使用的聚合酶是热稳定dna聚合酶。在一些实施例中，当如本文所使用的热稳定dna聚合酶经受高温持续一段在核酸合成或pcr扩增期间实现单链核酸不稳定或双链核酸变性所需的时间时，其并不会不可逆地失活。酶的不可逆变性是指酶活性的显著丧失。热稳定dna聚合酶优选在如pcr扩增通常需要的条件下在约90℃-100℃下不会不可逆地变性。

本教导的dna聚合酶可以通过所属领域熟知的技术从天然源或重组源中分离(参见例如pct公开第wo92/06200号；第wo96/10640号；美国专利第5,455,170号；第5,912,155号；和第5,466,591号；所述案的公开内容以全文引用的方式全部并入本文中)，从各种市售嗜热细菌(例如来自马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,rockville,md.))中分离或可以通过重组dna技术(参见例如pct公开第wo96/10640号和美国专利第5,912,155号)来获得。适用作热稳定聚合酶或其用于在重组系统中进行表达的基因的源的物质是例如嗜热细菌、嗜热栖热菌、海滨嗜热球菌、激烈热火球菌、伍氏热火球菌和火球菌属的其它物种、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜酸热硫化叶菌、嗜酸热原体、黄栖热菌、红色栖热菌、布氏栖热菌、新阿波罗栖热袍菌、海栖热袍菌和栖热孢菌属的其它物种以及嗜热自养甲烷杆菌和其突变体、变异体或衍生物。在一些实施例中，本文所提供的组合物、方法和试剂盒包含选自以下组成的组的热稳定dna聚合酶：taqdna聚合酶、tnedna聚合酶、tmadna聚合酶、tfidna聚合酶、pfudna聚合酶、pwodna聚合酶、vent^tmdna聚合酶、deepvent^tmdna聚合酶、其具有dna聚合酶活性的突变体或衍生物以及前述dna聚合酶的任何组合。taqdna聚合酶和其突变体形式可以从例如加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技(lifetechnologies,carlsbad,ca)商购获得或可以从其天然源中分离(例如从用于taq聚合酶的嗜热细菌水生栖热菌中分离)，如前所述(参见例如美国专利第4,889,818号和第4,965,188号，所述案的公开内容以全文引用的方式并入本文中。dna聚合酶可以从其天然源即嗜热细菌新阿波罗栖热袍菌中分离(参见例如pct公开第wo96/10640号和美国专利第5,912,155号)并且tmadna聚合酶可以从其天然源即嗜热细菌海栖热袍菌中分离(参见例如美国专利第5,374,553号中，所述案的公开内容以全文引用的方式并入本文中。示例性热稳定聚合酶包括但不限于扩增taqdna聚合酶和扩增taqgolddna聚合酶(赛默飞费舍尔科技(thermofisherscientific))。

然而，应理解，在不脱离范围或其优选实施例的情况下来自其它生物体的dna聚合酶也可用于本文中。作为分离的替代方案，dna聚合酶可以从例如加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技、马萨诸塞州贝弗利的纽英伦生物技术(newenglandbiolabs,beverly,ma)、芬兰埃斯波(espoo,finland)的finnzymesoy、加利福尼亚州拉霍亚(lajolla,ca)的stratagene、印第安纳州印第安纳波利斯(indianapolis,in)的boehringermannheimbiochemicals和康涅狄格州诺瓦克(norwalkct)的perkinelmercetus。应理解，在不脱离范围或其优选实施例的情况下各种dna聚合酶可以用于本发明组合物、方法和试剂盒，包括本文中未具体公开的聚合酶。

在某些实施例中，本文所公开的组合物和反应混合物中的热稳定dna聚合酶的浓度是约0.01到约500单位/微升、约0.01到约50单位/微升、约0.01到约25单位/微升、约0.01到约10单位/微升、约0.1到约5单位/微升、约0.1到约2单位/微升、约0.1到约1单位/微升或约0.1到约0.5单位/微升(单位/微升＝u/μl)，所述浓度包括在前述浓度中的任一个内的所有浓度和浓度范围。

在一些实施例中，本文所提供的组合物包含消泡剂。如本文所使用的消泡剂是表面作用化学品，其起到促进气体释放和抵消例如通过混合反应引起的起泡的作用。消泡剂可以防止、消除和/或减少泡沫。消泡剂可以另外赋予积极的辅助表面特性，如润湿、分散、乳化和溶解。在一些实施例中，所提供的组合物的消泡剂不是清洁剂。在一些实施例中，不同消泡剂的组合可存在于本文所描述的组合物中。在一些实施例中，一种或多种消泡剂以有效增强pcr反应的灵敏度的量存在。

许多化合物可用作消泡剂，其包括但不限于烷基聚氧化烯二醇醚；酯；醇；硅氧烷；硅；亚硫酸盐；磺酸酯；脂肪酸和其衍生物。已知各种这类试剂并且可以从包括以下的来源商购获得：j.t.baker、斯百全化学(spectrumchemicals)、道康宁公司(dowcorningcorporation)和西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrichcompany)。消泡剂组合物可以包含单一组分或多种组分，其可以通过简单混合在一起来组合。在一些实施例中，用于所提供的组合物的消泡剂包括但不限于硅氧烷聚合物、有机非硅酮聚丙烯基聚醚分散液、硅酮乳液、非离子型二甲硅油乳液的混合物、有机脂肪酸酯型消泡剂。举例来说，有机硅氧烷是熟知类别的硅酮基消泡剂，其包括纯硅油如二甲基聚硅氧烷以及聚硅氧烷/聚氧化烯嵌段共聚物如二甲基聚硅氧烷。在一些实施例中，消泡剂是硅基消泡剂并且选自以下：afe-1010、afe-1430、afe-1510、afe-1520、afe-2210、消泡剂a、消泡剂b、消泡剂c、消泡剂h-10、消泡剂se-15、消泡剂se-35、消泡剂so-25、消泡剂y-30和消泡剂289。

在一些实施例中，消泡剂是非硅基消泡剂。非硅基消泡剂的实例包括但不限于有机磺酸酯、聚醚、有机磷酸酯、炔二醇、碳氟化合物、聚烯烃多胺和聚亚烷基亚胺化合物，包括但不限于消泡剂204和消泡剂o-30。

在某些实施例中，一种或多种消泡剂在本文所公开的组合物或反应混合物中的存在浓度是约0.0005％到约0.5％、约0.001％到约0.1％、0.002％到约0.05％或0.005％到约0.02％或约0.01％到约0.05％，所述浓度包括在前述浓度中的任一个内的所有浓度和浓度范围。

在一些实施例中，本文所提供的组合物包含至少一种脱氧核苷三磷酸(dntp)。在某些实施例中，所述组合物可以进一步包含一种或多种脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)和一种或多种dntp衍生物的组合。在一些实施例中，所述组合物包含两到八种不同的dntp和/或dntp衍生物。在一些实施例中，所述组合物包含两种、三种、四种、五种或六种不同的dntp和/或dntp衍生物。可以包括在本文所提供的组合物、反应混合物或试剂盒中的dntp的实例包括但不限于datp、dctp、dgtp、dttp、dutp和/或ditp。可能性dntp衍生物的实例包括但不限于7-脱氮-dgtp(如7-脱氮-2-脱氧-dgtp)、7-脱氮-datp、α-硫代datp、α-硫代dttp、α-硫代dgtp和/或α-硫代dctp。在某些实施例中，所述组合物可以进一步包含一种或多种脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)和一种或多种dntp衍生物的组合。在某些实施例中，所述组合物可以进一步包含一种或多种双脱氧核糖核苷三磷酸(ddntp)和/或一种或多种ddntp衍生物。dntp、ddntp和其各自的衍生物可以从包括赛默飞费舍尔科技、纽英伦生物技术和西格玛奥德里奇公司的来源商购获得。这类dntp、ddntp和其各自的衍生物可以未经标记，或其可以通过所属领域已知的方法与放射性同位素(例如³h、¹⁴c、³²p或³⁵s)、维生素(例如生物素)、荧光部分(例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红或藻红蛋白)、化学发光标记物、地高辛(dig)等偶合来进行可检测地标记。标记的dntp、ddntp和其各自的衍生物也可以例如从加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技或密苏里州圣路易斯(saintlouis,mo)的西格玛奥德里奇公司商购获得。

所述组合物中的单独dntp、ddntp和/或其各自的衍生物的浓度不必相同。在本发明组合物的一些实施例中，可以添加dntp和/或ddntp以使每种dntp和/或ddntp的浓度是约.001mm到约100mm、约0.01mm到约10mm、约0.1mm到约1mm或优选约0.2mm到约0.8mm，所述浓度包括前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。在某些实施例中，所述组合物中的每种dntp和/或ddntp的浓度是使得其在组装pcr中的最终浓度是约0.015mm到约5mm、约0.05到约2mm、约0.1mm到约1mm、约0.1mm到约0.5mm、约0.15mm到约0.65mm、约0.15mm到约0.35mm或约0.35mm到约0.65mm的浓度，所述浓度包括前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。在本发明组合物的一些实施例中，可以添加dntp衍生物和/或ddntp衍生物以使每种dntp衍生物和/或ddntp衍生物的浓度是约.001mm到约100mm、约0.01mm到约10mm、约0.1mm到约1mm或优选约0.2mm到约0.8mm，所述浓度包括前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。在某些实施例中，所述组合物中的每种dntp和/或ddntp的浓度是使得其在组装pcr中的最终浓度是约0.015mm到约5mm、约0.05到约2mm、约0.1mm到约1mm、约0.1mm到约0.5mm、约0.15mm到约0.65mm、约0.15mm到约0.35mm或约0.35mm到约0.65mm的浓度，所述浓度包括前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。

在某些实施例中，所述组合物包含dntp和其相同核苷酸的相应衍生物的组合，如dntp和相同核苷酸的相应α-硫代dntp衍生物的组合或dntp和相同核苷酸的相应脱氮-dntp衍生物的组合。举例来说，在一个实施例中，所提供的组合物包含dgtp和α-硫代dgtp。在另一个实施例中，所提供的组合物包含dgtp和7-脱氮dgtp。在又另一个实施例中，所述组合物包含datp和7-脱氮datp的组合。

当dntp和其衍生物都存在于所述组合物中时，dntp与衍生物的相对浓度或浓度比可以变化。举例来说，在一些实施例中，dntp:dntp衍生物的相对浓度是1:1。在一些实施例中，dntp浓度:dntp衍生物浓度是约100:1到约1:1、约50:1到约1.2:1、约25:1到约1.5:1、约10:1到约2:1。在其它实施例中，dntp浓度:dntp衍生物浓度是约1:1到约1:100、约1:1.2到约1:50、约1:25到约1:1.5、约1:110到约1:2。在一些实施例中，dntp浓度:dntp衍生物浓度是约2:1到约1:2。在一些实施例中，dntp浓度:dntp衍生物浓度是约10:1到约2:1。在一些实施例中，dntp浓度:dntp衍生物浓度是约1:2到约1:10。举例来说，在某些实施例中，dgtp浓度:α-硫代dgtp浓度是约100:1到约1.5:1或约50:1到约12:1。在其它实施例中，dgtp浓度:α-硫代dgtp浓度是约1:1.5到约1:100或约1:12到约1:50。在一些实施例中，dgtp浓度:α-硫代dgtp浓度是约2:1到约1:2。在一些实施例中，dgtp浓度:α-硫代dgtp浓度是约10:1到约2:1。在一些实施例中，dgtp浓度:α-硫代dgtp浓度是约1:2到约1:10。在某些实施例中，dgtp浓度:7-脱氮-dgtp浓度是约100:1到约1.5:1或约50:1到约12:1。在其它实施例中，dgtp浓度:7-脱氮-dgtp浓度是约1:1.5到约1:100或约1:12到约1:50。在一些实施例中，dgtp浓度:7-脱氮-dgtp浓度是约2:1到约1:2。在一些实施例中，dgtp浓度:7-脱氮-dgtp浓度是约10:1到约2:1。在一些实施例中，dgtp浓度:7-脱氮-dgtp浓度是约1:2到约1:10。

在一些实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、镁盐、消泡剂以及datp、dctp、dutp和7-脱氮-dgtp的组合的组装pcr组合物。在一个实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、镁盐、消泡剂以及dctp、dgtp、dutp和7-脱氮-datp的组合的组装pcr组合物。在一个实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、钾盐、消泡剂以及dgtp和7-脱氮-dgtp的组合的组装pcr组合物。在一个实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、钾盐、消泡剂以及datp和7-脱氮-datp的组合的组装pcr组合物。在一个实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、镁盐、消泡剂以及dgtp和7-脱氮-dgtp的组合的组装pcr组合物。在一个实施例中，本文提供了包含热稳定dna聚合酶、镁盐、消泡剂以及datp和7-脱氮-datp的组合的组装pcr组合物。在某些实施例中，消泡剂是硅酮基消泡剂。在一个实施例中、硅酮基消泡剂选自afe-1010、afe-1430、afe-1510、afe-1520、afe-2210、消泡剂a、消泡剂b、消泡剂c、消泡剂h-10、消泡剂se-15、消泡剂se-35、消泡剂so-25、消泡剂y-30和消泡剂289。在其它实施例中，消泡剂是非硅酮基消泡剂。在一个实施例中，非硅酮基消泡剂选自有机磺酸酯、聚醚、有机磷酸酯、炔二醇、碳氟化合物、聚烯烃多胺和聚亚烷基亚胺化合物，其包括但不限于消泡剂204和消泡剂o-30。

所提供的组合物还可以包含一种或多种pcr抑制物阻断剂。可将这类pcr抑制物阻断剂添加到本文所公开的组合物或反应混合物中以帮助克服在用于核酸制备、分离或纯化的生物样品中常见的各种化合物对pcr反应的抑制。在一些实施例中，与在不存在这类pcr抑制物阻断剂的情况下观察到的抑制水平相比，一种或多种pcr抑制物阻断剂可以将一种或多种pcr抑制物的pcr抑制量从高于零的某个百分比降低到100％。举例来说，抑制可以减少至少约0.5％、约1％、约2％、约5％、约10％、约20％、约50％、约75％、约90％、约95％或约100％或其间的任何百分比。

在一些实施例中，如本文所描述的pcr抑制物阻断剂是蛋白质。在一些实施例中，这类蛋白质可以包括但不限于白蛋白、明胶和dna结合蛋白或其肽或多肽变异体、片段或衍生物。在一些实施例中，用于本教导的其它非蛋白质基pcr抑制物阻断剂可以包括例如甲磺酸去铁胺。在一些实施例中，所述组合物可以包含pcr抑制物阻断剂和/或蛋白质的组合。举例来说，在一些实施例中，所述组合物包含白蛋白、明胶或白蛋白和明胶的组合。在一些实施例中，白蛋白或明胶可以选自血清白蛋白、鱼明胶或血清白蛋白和鱼明胶的组合。血清白蛋白可以来自任何动物，例如牛血清白蛋白(bsa)、人类血清白蛋白(hsa)。在一些实施例中，白蛋白衍生自所属领域的技术人员熟知的其它动物物种。在一些实施例中，白蛋白是重组白蛋白，如重组bsa(rbsa)。明胶可以来自任何动物，例如鱼明胶、牛明胶。在一些实施例中，明胶衍生自所属领域的技术人员熟知的其它动物物种。在一些实施例中，明胶是重组明胶，如重组人类明胶。在一些实施例中，dna结合蛋白可以包括但不限于t4基因32蛋白(t4gp32)。

可以将特定pcr抑制物阻断化合物或试剂添加到本发明组合物中以使所述组合物中的浓度是约.0001mg/ml到约10mg/ml、约0.001mg/ml到约8mg/ml、约0.01mg/ml到约6mg/ml、约0.05mg/ml到约4mg/ml、约0.1mg/ml到约3mg/ml或约0.5mg/ml到约2mg/ml，所述浓度包括在前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。特定pcr抑制物阻断剂也可以以所述组合物的最终浓度百分比添加，例如约0.001％到约15％、约0.05％到约10％、约0.01％到约5％或约0.1％到约1％，所述浓度包括在前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，如本文所描述的组合物包含pcr抑制物阻断蛋白，如白蛋白，其浓度是使得其在组装pcr中的浓度是约0.001mg/ml到约10.0mg/ml、0.005mg/ml到约5.0mg/ml、约0.01mg/ml到约4.0mg/ml、约0.05mg/ml到约3.0mg/ml或约0.1mg/ml到约2.0mg/ml的浓度，所述浓度包括在前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。在另一个实施例中，如本文所描述的组合物包含pcr抑制物阻断蛋白，如明胶，其浓度是使得其在组装pcr中的浓度是约0.005％(w/v)到约2％(w/v)、约0.01％(w/v)到约1.0％(w/v)和更具体地约0.05％(w/v)到约0.5％(w/v)的浓度，所述浓度包括在前述浓度中的任一个内的任何浓度或浓度范围。在又另一个实施例中，如本文所描述的组合物包含呈前述浓度中的任一个的白蛋白和明胶的组合。在一些优选实施例中，白蛋白是约0.05mg/ml到5mg/ml并且明胶的浓度是约0.01％(w/v)到约1％(w/v)。在一些实施例中，白蛋白是牛血清白蛋白(bsa)并且明胶是鱼明胶和/或牛明胶。

在一些实施例中，所述组合物可以包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同的pcr抑制物阻断蛋白质和/或试剂。举例来说，在一些实施例中，所述组合物包含白蛋白、鱼明胶和牛明胶。在一些实施例中，每种pcr抑制物阻断蛋白和/或试剂的浓度是相同的。在一些实施例中，每种pcr抑制物阻断蛋白和/或试剂的浓度是不同的。在一些实施例中，将一种或多种pcr抑制物阻断剂添加到所述组合物或反应混合物中以帮助克服在生物样品中常见的各种抑制物对pcr的抑制。这类抑制物包括例如肝素(血液)；血红素(血液)；edta(血液)；柠檬酸盐(血液)；免疫球蛋白g(血液、血清)；腐殖酸(土壤、粪便)；乳铁蛋白(牛奶、唾液、其它分泌液)；尿素(尿液)；植物多糖(植物)；黑色素(皮肤、头发)；肌红蛋白(组织)；和靛蓝染料(纺织品)。以单独和组合形式添加pcr抑制物阻断剂可以增加对这类pcr抑制物污染物的耐受性。因此，本发明组合物可以进一步包含以单独或组合形式起作用来增加对各种pcr抑制物(包括例如腐殖酸、血红素和肝素)的耐受性的试剂。在一些实施例中，所述组合物或反应混合物中的每种pcr抑制物阻断剂或蛋白质可以阻断与所述组合物或反应混合物中的其它pcr抑制物阻断剂或蛋白质不同的抑制物或抑制物组。在一些实施例中，所述组合物或反应混合物中的不同pcr抑制物阻断剂或蛋白质可以阻断相同的抑制物或抑制物组。在一些实施例中，所述组合物或反应混合物中的不同pcr抑制物阻断剂或蛋白质可以阻断一组抑制物的重叠数量的抑制物。举例来说，在一些实施例中，明胶至少可以通过腐殖酸和肝素有效地减少pcr抑制，并且白蛋白至少可以通过腐殖酸和血红素有效地减少pcr抑制。

根据本教导，本文所提供的组合物可以包含促进与全部或部分核酸模板(rna或dna)互补的dna分子(例如单链cdna分子或双链cdna分子)的合成的一种或多种引物。另外，根据本教导，这些引物可用于扩增核酸分子。寡核苷酸引物可以是长度为两个或更多个(例如2、3、4、5、8、10、15、20、25个等)核苷酸的任何寡核苷酸。这类引物包括但不限于靶特异性引物(优选基因特异性引物)、寡(dt)引物、随机引物或任意引物。可用于根据本文所公开的方法扩增dna分子的额外的引物将对于所属领域的普通技术人员而言是显而易见的。应理解，在不脱离范围或其优选实施例的情况下，大量引物可用于本发明的组合物、方法和试剂盒，包括那些本文未具体公开的引物。

在一些实施例中，引物的终浓度范围可以是约25nm到约2000nm，如约50nm到约1700nm、约75nm到约1500nm、约100nm到约1200nm、约200nm到约1000nm或其间的任何范围。在一些示例性实施例中，每种引物的浓度是约400nm到约900nm，包括其间的所有量或范围。

根据本教导，所述组合物可以进一步包含用于检测靶核酸的探针。所属领域已知各种探针，例如(taqman^tm探针(参见例如美国专利第5,538,848号)、各种茎环分子信标(stem-loopmolecularbeacon)(参见例如美国专利第6,103,476号和第5,925,517号以及tyagi和kramer，1996，《自然－生物技术(naturebiotechnology)》14:303-308)，无茎或线性信标(参见例如wo99/21881)、pnamolecularbeacons^tm(参见例如美国专利第6,355,421号和第6,593,091号)、线性pna信标(参见例如kubista等人，2001，国际光电工程学会(spie)4264:53-58)、非fret探针(参见例如美国专利第6,150,097号)、sunrise^tm/amplifluor^tm探针(美国专利第6,548,250号)、茎环和双工scorpion^tm探针(参见例如solinas等人，2001，《核酸研究(nucleicacidsresearch)》29:e96和美国专利第6,589,743号)、凸环探针(参见例如美国专利第6,590,091号)、假结探针(pseudoknotprobe)(参见例如美国专利第6,589,250号)、环状体(参见例如美国专利第6,383,752号)、mgbeclipse^tm探针(epochbiosciences)，发夹探针(参见例如美国专利第6,596,490号)、肽核酸(pna)照明探针、自组装纳米粒子探针和二茂铁修饰的探针，其描述于例如美国专利第6,485,901号；mhlanga等人，2001，《方法(methods)》25:463-471；whitcombe等人，1999，《自然－生物技术》17:804-807；isacsson等人，2000，《分子细胞探针(molecularcellprobes)》14:321-328；svanvik等人，2000，《分析生物化学(analbiochem.)》281:26-35；wolffs等人，2001，《生物技术(biotechniques)》766:769-771；tsourkas等人，2002，《核酸研究》30:4208-4215；riccelli等人，2002，《核酸研究》30:4088-4093；张等人，2002，《上海(shanghai)》34:329-332；maxwell等人，2002，《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》124:9606-9612；broude等人，2002，《生物技术趋势(trendsbiotechnol.)》20:249-56；huang等人，2002，《毒物学化学研究(chemres.toxicol)》15:118-126；和yu等人，2001，《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》14:11155-11161中。探针可以包含报道染料，例如6-羧基荧光素(6-fam)或四氯荧光素(tet)。检测探针还可以包含猝灭剂部分，如四甲基罗丹明(tamra)、黑洞猝灭剂(biosearch)、iowablack(idt)、qsy猝灭剂(赛默飞费舍尔科技)和dabsyl和dabcel磺酸酯/羧酸酯猝灭剂(epoch)。探针还可以包含两个探针，其中例如荧光体位于一个探针上并且猝灭剂位于另一个探针上，其中两个探针在靶标上的一起杂交猝灭信号，或其中在靶标上的杂交通过改变荧光度改变了信号特征。

示例性可检测标记物包括例如荧光染料或荧光团(例如可以通过光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够猝灭来自荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”等。合适的可检测标记物可以包括例如荧光素(例如5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-fam)；5-hat(羟基色胺)；6-hat；6-joe；6-羧基荧光素(6-fam)；fitc)；alexa荧光体(例如350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；荧光团(例如492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-x、650/665-x、665/676、fl、flatp、fi-神经酰胺、r6gse、tmr、tmr-x缀合物、tmr-x、se、tr、tratp、tr-xse)、香豆素(例如7-氨基-4-甲基香豆素、amc、amca、amca-s、amca-x、abq、cpm甲基香豆素、香豆素鬼笔环肽、羟基香豆素、cmfda、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素am、钙黄绿素蓝、钙染料(例如钙深红、钙绿、钙橙、钙荧光白)、层叠蓝、层叠黄；cy^tm染料(例如3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色gfp、环状amp荧光传感剂(ficrhr)、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(例如gfp.egfp)、蓝色荧光蛋白(例如bfp、ebfp、ebfp2、蓝铜矿、mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、天蓝色、cypet)、黄色荧光蛋白(例如yfp、柠檬黄、venus、ypet)、fret供体/受体对(例如荧光素/四甲基罗丹明、iaedans/荧光素、edans/dabcyl、荧光素/荧光素、fl/fl、荧光素/qsy7和qsy9)、溶酶体示踪剂和溶酶体传感剂(例如溶酶体示踪剂蓝dnd-22、溶酶体示踪剂蓝白dpx、溶酶体示踪剂黄hck-123、溶酶体示踪剂绿dnd-26、溶酶体示踪剂红dnd-99、溶酶体传感剂蓝dnd-167、溶酶体传感剂绿dnd-189、溶酶体传感剂绿dnd-153、溶酶体传感剂黄/蓝dnd-160、溶酶体传感剂黄/蓝10,000mw葡聚糖)、奥勒冈绿(例如488、488-x、500、514)；罗丹明(例如110、123、b、b200、bb、bg、bextra、5-羧基四甲基罗丹明(5-tamra)、5gld、6-羧基罗丹明6g、丽丝胺、丽丝胺罗丹明b、鬼笔环肽、鬼笔环肽，红、rhod-2、5-rox(羧基-x-罗丹明)、磺酰罗丹明bcanc、磺酰罗丹明gextra、四甲基罗丹明(tritc)、wt)、德克萨斯红、德克萨斯红-x、vic和其它标记物，其描述于例如美国公开第2009/0197254号中)，尤其是如所属领域的技术人员已知的标记物。

在一些实施例中，探针是根据描述于例如美国专利第6,727,356号(所述案的公开内容以全文引用的方式并入本文中)中的方法和原理来设计的。一些探针可以是基于序列的，例如5'核酸酶探针，并且一些探针如绿可以是非序列特异性dna结合染料。在一些优选实施例中，检测探针是taqman^tm探针(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统(appliedbiosystems,fostercity,ca)。应理解，所属领域已知可用于本发明的组合物、方法和试剂盒的多种探针，包括那些本文未具体公开的探针。

在一些实施例中，工作溶液中的探针浓度范围可以是约5nm到约750nm，如约10nm到约600nm、约25nm到约500nm、约50nm到约400nm、约75nm到约300nm或其间的任何数值。在一些示例性实施例中，每种探针的浓度在约100nm到约250nm之间，包括其间的所有量或范围。

根据本教导，一种或多种额外的组分和/或添加剂可以并入本发明组合物、方法和试剂盒中以由核酸模板优化核酸的合成。在一些实施例中，所述组合物可以包含能够促进或增强核酸合成反应的额外的组分和/或添加剂(例如用于促进或增强pcr的试剂)。增强核酸合成的组分和/或添加剂可以是有机化合物或无机化合物。可用于本发明组合物、方法和试剂盒的一些组分和/或添加剂包括多肽以及非多肽组分。这类组分和/或添加剂可以包括但不限于例如(仅列举几例)单链结合dna结合(ssb)蛋白、含硫化合物、含乙酸盐的化合物、二甲亚砜(dmso)、甘油、甲酰胺、甜菜碱、四甲基氯化铵(tmac)、外蛋白、叠氮化钠、卡松、多元醇、nan3、缓冲剂、表面活性剂、清洁剂(例如吐温20、np-40、tritinx-100、和chaps)、用于热启动pcr的组分或化合物、使定量实时dna检测测定中的样品间和/或孔间变化最少化的被动参考对照物和/或尿嘧啶dna糖基化酶。所述组合物可以进一步包含拥挤剂，如ficoll70、糖原和聚乙二醇(peg)。所属领域的普通技术人员将能够识别根据本发明组合物、方法和试剂盒使用的额外的试剂和/或添加剂。

在一些方面中，本文所提供的组合物或试剂盒可以包含甘油。在一些实施例中，甘油以使得其浓度是约5到约50％(w/v)或约10％(w/v)到约30％(w/v)的浓度存在于所述组合物中，所述浓度包括在前述量中的任一个之间的所有浓度或浓度范围。

在一些方面中，本文所提供的组合物或试剂盒可以包含nan3。在一些实施例中，nan3以使得其浓度是约0.005％(w/v)到约0.05％(w/v)或约0.01％(w/v)到约0.1％(w/v)的浓度存在于所述组合物中。

在一些方面中，本文所提供的组合物或试剂盒可以包含清洁剂或清洁剂的组合。在一些实施例中，一种或多种清洁剂以有效增强pcr反应的灵敏度的量存在。一种或多种清洁剂可以是阴离子型清洁剂、阳离子型清洁剂、两性离子型清洁剂和/或非离子型清洁剂。在一些实施例中，一种或多种非离子型清洁剂可以是但不限于曲拉通x-诺纳德p-40(np-40)、吐温20、吐温80、brij30、brij35和/或brij58。在一些实施例中，所述组合物包含任何非离子型清洁剂，如吐温-20。在一些实施例中，所述组合物包含除吐温20之外的非离子型清洁剂。在一些实施例中，所述组合物不含和可检测的吐温-20。在一些实施例中，本文所提供的组合物包含除吐温20之外的非离子型清洁剂，其以有效增强pcr反应的灵敏度的量存在。在一些实施例中，所述组合物包含曲拉通x-在一些实施例中，所述组合物包含np-40。在一些实施例中，所述组合物包含brij30、brij35或brij58。在一些实施例中，所述组合物包含前述清洁剂的任何组合。清洁剂可以以约0.001％(w/v)到约0.50％(w/v)、约0.005％(w/v)到约0.1％(w/v)或约0.01％(w/v)到约0.05％(w/v)的浓度存在于所述组合物中，所述浓度包括在前述量中的任一个之间的所有浓度或浓度范围。

在一些方面中，本文所提供的组合物、反应混合物或试剂盒可以包含缓冲剂组分，如缓冲盐溶液。在一些实施例中，缓冲剂提供适当的ph条件以维持dna聚合酶的稳定性。本文所使用的术语“稳定”和“稳定性”一般是指组合物如酶组合物在酶或含酶组合物在约室温(例如约20℃到约25℃)的温度下储存约3天、在约4℃的温度下储存约一到八周、在约-20℃的温度下储存约两到六个月并且在约-80℃的温度下储存约六个月或更长之后保留原始酶活性(单位)至少70％、优选至少80％并且最优选至少90％。这类缓冲剂的实例可以包括例如tris、tricine、bis-tricine、hepes、mops、testaps、pipes和caps。在一些实施例中，如本文所公开的组合物和/或反应混合物的缓冲剂浓度在约1mm与约500mm之间、在约5mm与约250mm之间、在约10mm与约200mm之间、在约25mm与约150mm之间并且在约50mm与约100mm之间，所述浓度包括落入前述量内的任何浓度或范围。应理解，所属领域已知广泛多种的缓冲剂(或缓冲盐)，包括那些可以根据本发明的组合物、方法和试剂盒使用的本文中未具体公开的缓冲剂。

适合于包括在本文所提供的组合物中的盐的实例包括但不限于氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂和乙酸锂。在某些实施例中，所述组合物包含超过一种(例如两种、三种、四种、五种、六种等)盐组分。举例来说，本文所描述的组合物可以包含两种不同的盐。在其它实施例中，所述组合物包含三种不同的盐。在其它实施例中，所述组合物包含四种不同的盐。在一个实施例中，所述组合物包含浓度是约0.5mm到约1000mm、约1mm到约500mm、约5mm到约250mm、约10mm到约100mm、约5mm到约50mm和约2mm到约10mm的特定盐，所述浓度包括落入前述范围内的任何浓度或范围。在没有限制的情况下，在所述组合物包含盐如氯化钾、乙酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵和/或乙酸铵的某些实施例中，所述组合物包含呈使得在组装pcr中浓度是约5mm到约250mm、5mm到约150mm、约10mm到约120mm、约20mm到约100mm、约30mm到约90mm或约40mm到约80mm的浓度的盐，所述浓度包括落入前述范围内的任何浓度。在没有限制的情况下，在所述组合物包含盐如乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰或硫酸锰的某些实施例中，所述组合物包含呈使得在组装pcr中浓度是约0.5mm到约100mm、约1mm到约75mm、约1.5mm到约50mm、约2mm到约30mm、约3mm到约15mm、约4mm到约10mm或约1mm到约5mm的浓度的盐，所述浓度包括落入前述范围内的任何浓度。应理解，所属领域已知广泛多种的可以根据本发明的组合物、方法和试剂盒使用的盐或盐溶液，包括那些未在本文中具体公开的盐或盐溶液。

在一些方面中，本文所提供的组合物或试剂盒可以包含被动参考对照组分。在一些实施例中，被动参考对照物使定量实时核酸检测测定中的样品间和/或孔间变化最少化和/或可以以允许其用作可检测对照物的浓度包括在内。在一个实施例中，包括参考发色团(具体地说荧光团)作为被动参考对照物。在一个实施例中，参考发色团是荧光染料。在一些实施例中，荧光染料是rox染料(赛默飞费舍尔科技)。在一些实施例中，荧光染料是mustangpurple染料(赛默飞费舍尔科技)。被动参考物可以以使得其在组装pcr中的浓度是约10nm到约750nm或约20nm到约500nm或约50nm到约200nm的浓度包括在所述组合物中，所述浓度包括落入前述范围内的任何浓度。

在一些方面中，尿嘧啶dna糖基化酶(ung或udg)可以包括在本文所提供的组合物或试剂盒中。所述酶可以从许多商业来源商购获得，例如赛默飞费舍尔科技、酶科技(enzymatics)、纽英伦生物技术、金斯瑞(genscript)或usb。在一些实施例中，ung是不耐热的。在其它实施例中，ung是热稳定的。不耐热或热稳定ung可以以使得其在最终组装pcr中的浓度是约0.0001u/μl到约50u/μl、约0.0005u/μl到约10u/μl、约0.001u/μl到约5u/μl、0.005u/μl到约1.0u/μl或0.01u/μl到约0.5u/μl(u/μl＝单位/微升)的浓度包括在所述组合物中，所述浓度包括落入前述范围内的任何浓度或范围。

在pcr过程期间可能发生的不希望的扩增反应通常在反应混合物组装期间启动或在将热循环仪加热到初始变性温度时启动。通过进行“热启动”扩增可以使这些寄生反应最少化。热启动技术通常限制了基本反应组分的可用性直到达到通常>60℃的高温。

本教导的组合物、试剂盒和方法可以包括“热启动”机制、组分或步骤作为进一步防止、减少或消除非特异性核酸合成的手段。存在几种用于进行热启动反应的方法，包括手动技术、屏障、可逆聚合酶失活和特别设计的发夹引物。在一些实施例中，用于热启动反应如用于pcr中的组分或化合物可以是那些通过在较低温度下如在退火阶段期间使聚合酶活性失活来防止dna的非特异性扩增同时允许在较高温度下如在延伸阶段时间再激活或激活聚合酶活性的组分或化合物中的任一种。热启动组分的这类实例可以包括但不限于例如抗体、化学修饰物(例如聚合酶的化学修饰物)、寡核苷酸、适配体、特别设计的引物、结合蛋白和/或隔离蜡珠。用于热启动pcr的蜡珠是可商购的，例如hotstart^tm储存反应管(赛默飞费舍尔科技)。可以通过所属领域已知的方法或可以使用市售的热启动适配体来选择合适的热启动适配体。类似地，可以通过所属领域已知的方法或可以使用市售的热启动引物来选择合适的热启动发夹引物。可以通过所属领域已知的各种方法来产生或选择用于热启动pcr的抗体。可替代地，可以使用市售抗体，例如对任何taq衍生的dna聚合酶有效的taqstart抗体(clontech)，包括天然、重组和n-末端缺失突变体。在一些情况下，合适的热启动引物可以是特别设计成具有防止引物退火直到循环温度使其变性和展开的二级结构(如发夹引物)的引物。用于组装反应混合物中的热启动pcr的化合物或试剂的适当浓度可以通过所属领域已知的许多方法来确定，或对于商业产品，其适当浓度可以由制造商建议。下面更详细地描述一些热启动机制、组分或步骤。

一般来说，手动热启动方法通常(但并非总是如此)要求研究人员保留关键组分(通常是镁或聚合酶)直到加热反应。然后添加保留的组分以引发反应。第二种方法使用物理屏障(例如蜡)来将关键组分与模板和引物分离。美国专利第5,565,339号描述了使用蜡屏障来在试管中将各种pcr试剂彼此分离。美国专利第5,413,924号描述了使用石蜡珠来隔离dna聚合酶。

热启动扩增的可替代方法是可逆聚合酶失活。使聚合酶与抗体或寡核苷酸适配体反应，所述抗体或寡核苷酸适配体结合到聚合酶的核苷酸结合结构域，使聚合酶失活。举例来说，将针对taq聚合酶的单克隆抗体如可以获自西格玛的抗taqdna聚合酶抗体引入反应混合物中。加热后，将化合物与聚合酶解离，恢复酶活性。在另一个实例中，美国专利第5,677,152号描述了其中对dna聚合酶进行化学修饰以确保其仅在高温下变得具有活性的方法。

实现热启动扩增的另一种方法是设计能够自行退火以形成特异性发夹结构的引物。在发夹构象中时，发夹引物将不能退火到靶核酸上。发夹引物将保持发夹构象直到加热到变性温度。然而，如果发夹结构包括单链延伸，则然后发夹结构本身类似于退火到模板上的引物并且可能导致链延伸。

除了上述那些热启动组分或机制之外的各种其它热启动组分或机制也是为所属领域的普通技术人员所熟知的，并且将可以基于其根据本教导进行工作的能力来容易地选择。在某些实施例中，提供了组合物、反应混合物、试剂盒和方法，其包含用于在第一种条件下(如在较低温度下)抑制或基本上抑制核酸聚合酶的聚合酶活性并在第二种条件下(如在较高温度下)使聚合酶激活的至少两种不同的热启动机制、组分或步骤。这类热启动机制包括但不限于下文所描述的那些热启动机制，其包括：在较低温下阻断聚合酶活性的抗体或抗体组合、在较低温度下阻断聚合酶活性的寡核苷酸、在高温下解离的dna聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度下提供降低活性的dna聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定dna结合域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制dna聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度下隔离引物的单链结合蛋白、修饰引物或修饰dntp。

在一些实施例中，所述组合物包含热稳定dna聚合酶、盐、消泡剂、dntp、pcr抑制物阻断剂、缓冲剂、热启动组分、甘油、非离子型清洁剂和被动参考染料的组合。在其它实施例中，所述组合物包含热稳定dna聚合酶、钾盐、镁盐、硅基消泡剂、包括dntp/dntp衍生物组合的dntp、白蛋白、鱼明胶、缓冲剂、热启动组分、甘油、除吐温20以外的非离子型清洁剂和被动参考染料。如所属领域的技术人员所确定，可以取代或修饰组分。应理解，所属领域已知的广泛多种的额外组分可用于本发明的组合物、方法和试剂盒，包括那些本文未具体公开的组分。所属领域的技术人员还将理解确定用于本教导的每种组分的最佳使用的特定条件或浓度所需的方法。

在一个方面中，所述组合物可以作为浓缩原液或混合物提供。如本文所使用的术语“浓缩原料”是指呈需要进一步稀释以实现用于溶液中来执行特定功能(如pcr扩增)的最佳浓度的浓度。举例来说、组合物可以是约2×、约3×、约4×、约5×、约6×、约10×等的原液，所述量包括在前述量中的任一个之间的任何量。在一些实施例中，所述组合物可能需要大于2×、大于3×、大于4×、大于5×、大于6×、大于10×等的待呈例如用于核酸合成或扩增方法的工作浓度或最佳浓度的稀释，所述量包括在前述量中的任一个之间的任何量。在一些实施例中，本文所描述的组合物还可以以工作浓度或作为“工作溶液或混合物”来提供。如本文所使用的“工作浓度”或“工作溶液或混合物”用于指呈或接近用于执行特定功能或反应(如扩增或pcr)的最佳浓度的溶液或混合物。在一些实施例中，呈工作浓度的组合物在使用之前不需要或需要最低程度的稀释。举例来说，在一些实施例中，呈工作浓度的组合物是呈组装反应混合物中的最终浓度的约1×、约1.25×、约1.5×、约1.8×、约2×或约2.2×浓度。

在一些实施例中，本教导的组合物可以配制成主混合物。主混合物可以提高效率并减少与高通量分析所需的大量反应的组装相关的错误。在一些实施例中，主混合物可以含有所有反应共有的试剂的组合。举例来说，在一些实施例中，主混合物可以含有缓冲剂、盐如mgcl2、脱氧核苷三磷酸(dntp)、热稳定dna聚合酶、清洁剂和pcr抑制物阻断剂。为了在某些测定中使用，然后每个反应将含有等分试样的共用主混合物和特异性靶核酸模板和至少一种引物。在一些实施例中，主混合物可以制造和分配成浓缩原液或混合物。然后在组装最终反应时稀释主混合物。在其它实施例中，主混合物可以制造和分配成工作溶液或混合物。

在某些方面中，本发明还涉及作为反应混合物的组合物。如本文所使用的“反应混合物”是指两种或更多种物质的混合物，其可以一起引起反应；或其中两种或多种物质的混合物可以引起化学转化或变化。在一些实施例中，反应混合物包含：(a)至少一种聚合酶；(b)至少一种pcr抑制物阻断剂；(c)至少一种清洁剂；(d)至少一种消泡剂；(e)至少一种盐；(f)缓冲剂；(g)至少一种dntp和/或dntp衍生物；(h)至少一种引物；(i)和核酸样品。在一些实施例中，反应混合物可以进一步包含标记探针(例如taqman^tm探针)。在一些实施例中，反应混合物的聚合酶是热稳定dna聚合酶。在一些实施例中，反应混合物的热稳定dna聚合酶是taqdna聚合酶。在一些实施例中，反应混合物的pcr抑制物阻断剂是蛋白质。在一些实施例中，反应混合物的pcr抑制物阻断蛋白选自白蛋白、明胶或白蛋白和明胶的组合。在一些实施例中，反应混合物的清洁剂是非离子型清洁剂。在一些实施例中，反应混合物的非离子型清洁剂是除吐温-20之外的非离子型清洁剂。在一些实施例中，反应混合物的消泡剂是硅酮基试剂。在一些实施例中，反应混合物的硅酮基试剂选自afe-1010、afe-1430、afe-1510、afe-1520、afe-2210、消泡剂a、消泡剂b、消泡剂c、消泡剂h-10、消泡剂se-15、消泡剂se-35、消泡剂so-25、消泡剂y-30和消泡剂289。在一些其它实施例中，反应混合物的消泡剂是非硅酮基试剂。在一些实施例中，反应混合物的非硅酮基试剂选自有机磺酸酯、聚醚、有机磷酸酯、炔二醇、碳氟化合物、聚烯烃多胺和聚亚烷基亚胺化合物，包括但不限于消泡剂204和消泡剂o-30。

在一些实施例中，反应混合物的dntp选自dgtp、dctp、datp和dttp。在一些实施例中，反应混合物的dntp衍生物选自7-脱氮-dgtp(如7-脱氮-2-脱氧-dgtp)、7-脱氮-datp、α-硫代datp、α-硫代dttp、α-硫代dgtp和α-硫代dctp。在一些实施例中，反应混合物包含dntp/dntp衍生物共混物，其包含前述dntp和dntp衍生物的一些组合。在一些实施例中，反应混合物的核酸模板是dna。在一些实施例中，反应混合物中的dna是基因组dna(gdna)或互补dna(cdna)。

在一些实施例中，本文所描述的组合物可以包装在能够保持所述组合物并且不会与所述组合物的组分显著地相互作用的合适容器中。容器可以是设计成允许个人或液体处理仪器容易地分配剂型的容器。具有组合物的容器可以进一步包装成多包装单元。在一些实施例中，多包装单元可以进一步包含额外的容器，其包含在用于反应混合物如用于pcr中之前添加到所述组合物中的添加剂或其它试剂。

在一些实施例中，本文所描述的组合物可以呈液体形式，如呈水合溶液。在其它实施例中，本文所描述的组合物可以呈凝胶形式。如本文所使用的“凝胶”是在-20℃下不是固体或不会冷冻的组合物。在又其它实施例中，本文所描述的组合物可以呈脱水或干燥形式，如呈冻干组合物。

本文还公开了包含所述组合物的试剂盒或包含所述组合物的包装容器。在一些实施例中，可将所述组合物组装成试剂盒以用于核酸合成或扩增反应。试剂盒可以进一步包含在用于合成、检测或定量核酸的一种或多种测定中使用的额外试剂。在一个实施例中，所述组合物可以存在于试剂盒中以用于扩增核酸分子，如用于pcr。

在一些实施例中，试剂盒包括载体(如其中具有封闭限制的盒子、纸盒、管子等)、容器(如小瓶、管、安瓿盒、板、瓶等)。当试剂盒中包括超过一种酶(例如dna聚合酶和逆转录酶或dna聚合酶和ung)时，酶可以作为两种或更多种(例如2、3、4、5种等)酶的混合物处于单个容器中或单独容器中。本发明的试剂盒还可以包含(在相同或单独的容器中)盐溶液、消泡剂、合适的缓冲剂、dntp和/或dntp衍生物混合物或共混物、探针和/或引物。在一些实施例中，将dna聚合酶、盐、消泡剂、dntp和/或dntp衍生物混合物或共混物和缓冲剂在单个管或容器中组合。

在另一个方面中，试剂盒可以包含用于核酸合成或扩增反应的主混合物组合物。这类组合物可以配制成浓缩原料(例如2×、3×、4×、5×、6×等)。在一些实施例中，所述组合物可以在单个管或容器中配制成浓缩原料，其包含dna聚合酶、盐、消泡剂和dntp。在一些实施例中，这类浓缩原料组合物可以进一步包含pcr抑制物阻断剂、除吐温20之外的非离子型清洁剂、热启动组分和/或缓冲溶液中的被动参考染料的组合。在一些额外实施例中，这类缓冲溶液可以包含甘油、dmso和/或第二盐。

在一个实施例中，除了所述组合物或主混合物之外，试剂盒可以进一步包含对pcr扩增核酸靶标具有特异性的至少一种引物对和/或对扩增核酸靶标具有特异性的至少一种探针。举例来说，探针可以是taqman^tm探针、hydroleasy^tm探针、小沟结合(mgb)探针、锁定核酸(lna)探针、sybrgreen或sybrgreener^tm探针或循环探针技术(cpt)探针。

在另一个实施例中，试剂盒可以进一步包含对照核酸样品和对pcr扩增对照核酸样品中的核酸靶标具有特异性的至少一种引物对和/或对扩增对照核酸样品中的核酸靶标具有特异性的至少一种探针。用于检测扩增的探针也可以包括在试剂盒中。

除了所述组合物之外，试剂盒的组分可以适当地在单独容器中或在单个容器中提供。在一些实施例中，可以提供用于有利地使用试剂盒的指令、手册和/或协议。许多测定适用于使用所公开的组合物和反应混合物来合成靶核酸，并且如所属领域的技术人员所理解，本文考虑了所述测定。

本文还公开了使用所描述的组合物和试剂盒的方法。本文所提供的组合物、反应混合物和试剂盒可用于多种基于核酸合成的测定以检测、定量和/或表征一个或多个核酸靶标。在一些实施例中，这类测定包含将本文所提供的组合物中的任一种与核酸样品和一种或多种引物混合并进行所述测定。在某些实施例中，所述方法包括核酸扩增，如通过聚合酶链式反应(pcr)。

在某些方面中，本文所提供的方法还可以采用水解探针来检测核酸。水解探针利用一些聚合酶的5'核酸外切酶活性。在pcr反应的延伸或伸长阶段期间，聚合酶如taq聚合酶使用上游引物作为结合位点，然后延伸。然后在聚合酶延伸期间，水解探针在其5'端处通过聚合酶的5'-外切核酸酶活性进行裂解。

如本文所使用的术语“上游”和“下游”涉及由靶特异性引物引发的新生链的合成。因此，举例来说，与位于引物杂交的靶核酸区域的“下游”的靶核酸区域杂交的靶特异性探针位于引物的3'，并且位于沿5'到3'方向延伸引物的聚合酶的路径中。

测定(参见例如美国专利5,210,015(以全文引用的方式并入本文中)是基于水解探针的测定的实例。在测定中，水解探针通常用5'端上的报道子和3'端上的猝灭剂来标记。当将报道子和猝灭剂固定在同一探针上时，强制其保持紧密靠近。即使在探针与靶序列杂交时，这种靠近也有效地猝灭了报道信号。水解探针在其5'端处进行聚合酶延伸期间通过taq的5'-外切核酸酶活性进行裂解。当这种情况发生时，报道荧光团从探针释放，随后不再与猝灭剂紧密靠近。随着pcr反应继续循环，这种情况在每个延伸阶段情况下产生报道信号的永续增加。为了在每个循环情况下获得最大信号，水解探针通常设计成具有比反应中的引物高约10℃的tm。实时水解探针反应的使用也描述于美国专利第5,538,848号、第6,653,473号、第7,485,442号和第7,205,105号中，所有所述案的公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所公开的方法包括使用taqman测定进行核酸分析和/或检测。举例来说，本公开的组合物可用于包括taqman探针和/或测定的方法中。这类测定可以包括但不限于基因表达测定(例如taqman^tm基因表达测定)、拷贝数变化测定(例如taqman^tm拷贝数测定)、基因分型测定(例如taqman^tm药物代谢基因分型测定或taqman^tmsnp基因分型测定)、mirna测定(例如taqman^tmmicrorna测定)或rna定量测定(例如两步逆转录聚合酶链式反应测定)和taqman^tm低密度阵列测定。

如本文所使用的术语“反应器”一般是指其中可以根据本传导发生反应的任何容器。在一些实施例中，反应器可以是微管，例如但不限于0.2ml或0.5ml反应管，如microamp^tm光管(赛默飞费舍尔科技的appliedbiosystems^tm)或微型离心管或在分子生物学实验室中的通常实践中的那类其它容器。在一些实施例中，反应容器可以是微量滴定板(例如96孔板、384孔板)中的孔(如taqman^tm阵列板(赛默飞费舍尔科技的appliedbiosystems^tm))、玻璃载片上的斑点、appliedbiosystems^tmtaqman^tm阵列卡或板(赛默飞费舍尔科技)中的孔或appliedbiosystems^tmtaqman^tmopenarray^tm板(赛默飞费舍尔科技)的通孔。举例来说，多个反应容器可以驻留在同一支撑物上。在一些实施例中，可以提供例如可以获自caliper和富鲁达(fluidigm)的芯片实验室器件以用于反应容器。在一些实施例中，可以采用各种微流体方法。应认识到，各种反应容器可以在所属领域中获得并且落入本教导的范围内。

如本文所使用的术语“扩增子”和“扩增产物”或“已扩增产物”一般是指扩增反应的产物。扩增子可以是双链或单链的，并且可以包括通过使双链扩增产物变性获得的单独的组分链。在某些实施例中，一个扩增循环的扩增子可以充当后一扩增循环中的模板。

如本文所使用的术语“扩增”是指通过其再生产靶多核苷酸、靶多核苷酸替代物或其组合中的至少一部分的任何手段，通常是以模板依赖性方式，其包括但不限于广泛的用于线性地或指数地扩增核酸序列的技术。几种方法中的任一种都可用于扩增靶多核苷酸。可以利用用于使核酸的靶序列的拷贝倍增的任何体外手段。这些手段包括线性、对数和/或任何其它扩增方法。示例性方法包括聚合酶链式反应(pcr)、引物分子的部分破坏(参见例如pct申请公开wo2006/087574)、连接酶链式反应(参见例如wu等人《基因组学(genomics)》4:560-569(1990)和barany等人《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》88:189-193(1991)、qβrna复制酶系统(参见例如wo1994/016108)、基于rna转录的系统(例如tas、3sr)、滚环扩增(rca)(参见例如美国专利第5,854,033号；lizardi等人《自然-遗传学(nat.genet.)》19:225-232(1998)；和banér等人《核酸研究》26:5073-5078(1998))和链置换扩增(sda)(little等人《临床化学(clin.chem.)》45:777-784(1999))等。许多系统适用于扩增靶核酸，并且如所属领域的技术人员所理解，本文考虑了所述系统。在本发明方法的一些实施例中，核酸扩增反应可以通过pcr来进行。在一些实施例中，pcr可以是定量pcr(qpcr)。在某些实施例中，qpcr可以通过实时pcr来进行。在其它实施例中，pcr可以是端点pcr。在其它实施例中，pcr可以是数字pcr。在又其它实施例中，pcr可以包含热循环。在一些实施例中，可以优化热循环以用于快速热循环。

在一些实施例中，用于通过pcr扩增核酸的方法包含将本文所提供的包含热稳定dna聚合酶、盐、消泡剂和dntp和/或dntp衍生物的组合物添加到反应容器中；向反应容器中添加核酸样品和引物以形成反应混合物；并对核酸样品进行pcr。在一些实施例中，在将所述组合物、核酸样品和引物添加到反应容器中之后，pcr继续发生长达72小时(例如长达4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时)。

在一些实施例中，用于扩增靶核酸的方法可以是多重pcr扩增，其中同时扩增多个靶标。扩增的靶标数量可以多达2个靶标、5个靶标、10个靶标、25个靶标、50个靶标、100个靶标、1000个靶标、5000个靶标等，所述数量包括其间的所有数字。在一些实施例中，多重靶标其中之一是用于扩增的内源或外源内部阳性对照物。在一些实施例中，用于检测靶核酸的方法可以是多重pcr和/或其中同时检测多个靶标的检测测定。在某些实施例中，扩增和/或检测的靶标的数量可以多达25个靶标、10个靶标、8个靶标、6个靶标、5个靶标、4个靶标、3个靶标或2个靶标。在一个实施例中，多重靶标其中之一是用于扩增和/或检测的内源或外源内部阳性对照物。在一些实施例中，同时扩增和检测多个靶标。在一些实施例中，在同一反应容器中扩增和检测多个靶标。在一些实施例中，可以组合各种taqman^tm探针报道染料和被动染料选项以用于多重pcr。举例来说，与含有rox被动参考染料的pcr组合物组合的具有fam^tm、vic^tm和aby^tm报道染料的taqman^tm探针可用于3重多重pcr扩增和检测测定。又举例来说，与含有mustangpurple^tm被动参考染料的pcr组合物组合的具有fam^tm、vic^tm、aby^tm和jun^tm报道染料的taqman^tm探针可用于4重多重pcr扩增和检测测定。在一些实施例中，核酸合成(如核酸扩增反应或pcr)和核酸检测(例如扩增子)可以同时发生。因此，在一些实施例中，核酸合成和核酸检测发生在同一反应容器中。

一般来说，pcr热循环包括在高温下的初始变性步骤，接着是设计成允许通过聚合酶进行模板变性、引物退火和延伸退火引物的一系列重复温度循环。通常在约95℃的温度下将样品初始加热约2到10分钟以使双链dna样品变性。然后，在每个循环的开始，取决于样品和所用仪器的类型，将样品变性约10到60秒。变性后，使引物在较低温度下通常在约40℃到约60℃下退火到靶dna上持续约20至60秒。由聚合酶进行引物的延伸通常在约60℃到约72℃范围内的温度下进行。用于延伸的时间量取决于扩增子的大小和用于扩增的酶的类型，并且可以通过常规实验来容易地确定。另外，退火步骤可以与延伸步骤组合，产生两步循环。热循环还可以包括pcr测定中的额外温度变化。测定中使用的循环数取决于许多因素，包括所用引物、存在的样品dna的量和热循环条件。所属领域的技术人员使用常规实验可以容易地确定在任何测定中使用的循环数。任选地，可以在完成热循环后添加最终延伸步骤以确保所有扩增产物的合成。

在一个实施例中，用于使用本文所公开的组合物和反应混合物进行pcr扩增的示例性热循环条件如下：

ung步骤(任选的)：50℃，2分钟(例如以保护扩增子/携带污染物远离先前pcr)

激活：95℃，20秒

变性：95-97℃/1-3秒

延伸：60-62℃/20-30秒(×40次循环)

在一个实施例中，当将本文所公开的组合物用于低密度阵列(tlda)平台时，建议在92℃下激活10分钟。

所提供的组合物和反应混合物也可用于其中如在预扩增反应中发生有限数量的循环的扩增反应(例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次循环的扩增)。在某些实施例中，使用所提供的组合物和反应混合物进行预扩增步骤(参见例如美国专利第9,206,475号，所述案的公开内容以全文引用的方式并入)。在一些实施例中，用一对通用正向和反向引物进行预扩增。在一些实施例中，进行预扩增少于20次循环，例如2-18次循环。在一些实施例中，预扩增步骤在到达扩增反应平台期之前中断。在一些实施例中，本文所公开的方法可以包括预扩增步骤，其在扩增前使用本文所提供的组合物和反应混合物进行。

利用所公开组合物进行的pcr可以在“标准”pcr仪器上进行，例如appliedbiosystems^tm7900ht、7500和7300标准pcr系统，或在“快速”pcr仪器上进行，例如appliedbiosystems^tmstepone、steponeplus、7500和7900ht快速实时pcr系统。在一些实施例中，利用所公开组合物进行的pcr包含使用如但不限于以下的仪器进行热循环：pcr系统9700、9600、2700或2400热循环仪、appliedviia^tm7实时pcr系统、quantstudio^tm12kflex实时pcr系统、quantstudio^tmdx实时pcr系统、quantstudio^tm6flex实时pcr系统、quantstudio^tm7flex实时pcr系统、quantstudio^tm3实时pcr系统、quantstudio^tm5实时pcr系统等(均来自赛默飞费舍尔科技)。用于所述方法的分光光度热循环仪的其它实例包括但不限于bio-radicycleriq^tm、cepheidsmartcycler^tmii、corbettresearchrotor-gene3000、idahotechnologiesr.a.p.i.d.^tm、mjresearchchromo4^tm、rocheappliedsciencelightcycler^tm、rocheappliedscience2.0、stratagenemx3000p^tm和stratagenemx4000^tm。

在一些方面中，本文所提供的组合物、试剂盒和方法提供优于用于核酸合成和/或检测的标准或传统组合物、试剂盒和方法(如其它市售主混合物或试剂盒)的优点。在一些实施例中，这类优点包括但不限于以下中的任一个：

a)可用于扩增直接来自未加工样品中的核酸(例如通过实时qpcr)(例如可扩增直接来自唾液和全血中的靶标)

b)提高拷贝数变化结果的准确性；

c)提高对各种pcr抑制物的耐受性；

e)提供更高的特异性和灵敏度；

f)可与快速热循环协议一起使用以便更快地读出；和/或

g)允许在单一反应中基本上同时进行多重(例如(i)可以使用单个样品扩增多个靶标；一个样品中的两个或更多个靶标或(ii)可以扩增多个样品；两个不同样品中的两个靶标)的能力。

在一些实施例中，与在使用标准或传统组合物、试剂盒和方法的pcr中观察到的拷贝数变化相比，当使用本文所提供的组合物，试剂盒和方法时，pcr中的拷贝数变化的准确度提高了至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％。在一些实施例中，与在使用标准或传统的组合物、试剂盒和方法的pcr中观察到的输入检测灵敏度相比，当使用本文所提供的组合物、试剂盒和方法与时，pcr中的输入检测灵敏度增加了至少10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，当使用本文所提供的组合物、试剂盒和方法时，pcr中的特异性和灵敏度的对于基因分型的准确度是至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，上文列出的优点(a)到(g)中的任一种至少与使用用于核酸合成和/或检测的标准或传统组合物、试剂盒和方法观察到的那些优点相当。

如本文所使用的“核苷酸”是指碱-糖-磷酸酯组合。“核苷”是指碱-糖组合。核苷酸是核酸序列(例如dna和rna)的单体单元。术语核苷酸包括脱氧核糖核苷和核糖核苷以及其衍生物的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯形式。dntp可以未经标记，或其可以通过所属领域已知的方法与放射性同位素(例如h³、c¹⁴、p³²或s³⁵)、维生素(例如生物素)、荧光部分(例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红或藻红蛋白)、化学发光标记物、地高辛等偶合来可检测地标记。标记dntp可以从例如赛默飞费舍尔科技或西格玛奥德里奇公司商购获得。

如本文所使用的“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指包含共价连接的核苷酸序列的合成或生物学生成的分子，所述序列可以通过一个核苷酸的戊糖的3'位置与相邻核苷酸的戊糖的5'位置之间的磷酸二酯键连接。另外，多核苷酸或寡核苷酸可以含有修饰的或非天然存在的糖残基(例如阿拉伯糖)和/或修饰的碱基残基。多核苷酸或寡核苷酸还可以包含防止分子与特定蛋白质、酶或基质的相互作用的阻断基团。

如本文所使用的“核酸”包括具有多个天然核苷酸和/或非天然(或“衍生”)核苷酸单元的化合物。“核酸”可以进一步包含非核苷酸单元，例如肽。因此，“核酸”涵盖如dna、rna、肽核酸、含硫代磷酸酯的核酸、含膦酸酯的核酸等化合物。对核酸中的单元数没有特别限制，其条件是核酸含有2个以上的核苷酸、核苷酸衍生物或其组合，具体地说5、10、15、25、50、100或更多个。核酸可以涵盖单链和双链形式以及完全或部分双链体杂交体(例如rna-dna、rna-pna或dna-pna)。

如本文所使用的术语“引物”可以指超过一种引物并且是指寡核苷酸，无论是天然存在的(如在纯化限制性消化中)还是合成生成的，其在置于其中催化合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时能够充当沿着互补链的合成起始点。这类条件包括在合适的缓冲剂(“缓冲剂”包括作为辅因子或影响ph、离子强度等的取代基)中存在四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂如dna聚合酶或逆转录酶和在合适的温度下。引物优选是单链引物以达到最大效率的扩增。引物通常是11个碱基或更长；最具体地说，引物是17个碱基或更长，但是视需要而定，可以使用更短或更长的引物。如所属领域的技术人员应了解，寡核苷酸可以用作各种延伸、合成或扩增反应中的一种或多种引物。

本文所使用的核酸序列的互补物是指寡核苷酸或多核苷酸，其在与核酸序列比对以使得一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时是“反向平行缔合”。天然核酸中不常见的某些碱基可以包括在本发明的核酸中，并且包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补性不一定是完美的；稳定的双链体可能含有错配的碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以考虑许多变量凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。

通过解链温度(“tm”)测量核酸双链体的稳定性。特定条件下的特定核酸双链体的tm是一半碱基对解离的温度。

当提及热稳定dna聚合酶时，一个活性单位是在标准引发dna合成条件下在30分钟内将10纳摩尔dntp并入酸不溶性物质(即dna或rna)中的酶量。

如本文所使用的术语“靶标”、“靶序列”、“靶模板”或“靶核酸序列”是指经扩增、经检测或两种都经历的核酸序列或核酸区域。通常，在pcr中，靶序列位于用于扩增的两个引物序列之间。

如本文所使用的术语“或其组合”是指在所述术语前面所列术语的所有排列和组合。举例来说，“a、b、c或其组合”意在包括以下中的至少一个：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果在特定情况下顺序是重要的，那么还有ba、ca、cb、acb、cba、bca、bac或cab。继续在这个实例情况下，明确地包括含有重复的一个或多个项目或术语的组合，如bb、aaa、aab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。熟练的技术人员应了解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不限制任何组合中的项目或术语的数量。

示例性核酸样品包括dna和/或rna。在一个实施例中，核酸是分离的和/或纯化的核酸。分离的或纯化的核酸基本上不含其它组分，如蛋白质、多糖或其它细胞、细菌或病毒组分。在另一个实施例中，核酸不是分离的或纯化的。在一些实施例中，核酸样品在生物样品内。举例来说，核酸可以存在于复合混合物如粗裂解物或全细胞提取物中。在另一个实施例中，核酸可以位于原位并且存在于其正常的细胞、细菌或病毒环境内。

靶核酸可以从任何来源获得，并且可以包含任何数量的不同组成性组分。举例来说，靶标可以是核酸(例如dna或rna)、信使rna(mrna)、转运rna(trna)、小干扰性rna(sirna)、微rna(mirna)或其它成熟小rna，并且可以包含核酸类似物或其它核酸模拟物。靶标可以经甲基化、经非甲基化或两种都经历。靶标可以是经亚硫酸氢盐处理的和非甲基化的转化为尿嘧啶的胞嘧啶。此外，应了解“靶核酸”可以指靶核酸本身以及其替代物，例如扩增产物和天然序列。

本教导的核酸样品可以从任何数量的生物来源获得，其包括但不限于病毒、古细菌、原生生物、原核生物和真核生物，例如从获自以下的生物样品获得：真核生物体，最佳哺乳动物如灵长类动物例如黑猩猩或人类；牛；狗；猫；啮齿动物，例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔子；或鸟；爬行动物；或鱼。核酸可以从不同发育阶段的细胞、组织、器官或生物体获得。核酸样品也可以从癌细胞和从动物(包括人类)获得的癌前期细胞获得。核酸也可以从细胞培养系获得，包括转化和非转化的细胞培养系。可以从各种来源提取核酸样品。这些来源包括但不限于例如衣物、土壤、纸、金属表面、空气、水、植物部分以及人类和/或动物皮肤、毛发、血液、血清、粪便、乳汁、唾液、尿液和/或其它分泌液。

应理解，核酸样品和靶核酸可以使用所属领域已知的各种程序中的任一种从生物样品和其它样品中提取，所述程序例如dna全部提取试剂盒(appliedbiosystems^tm，赛默飞费舍尔科技)、magmax^tm样品制备系统(赛默飞费舍尔科技)、targetpreprnaffpe样品制备试剂盒(美国雅培公司(abbottlaboratories))、用于ffpe的recoverall^tm总核酸分离试剂盒和purelink^tmffperna分离试剂盒(赛默飞费舍尔科技的ambion^tm)、abi6100核酸制备站和abi6700自动核酸工作站(appliedbiosystems，赛默飞费舍尔科技)等。

“生物样品”包括组织切片如活检样品和尸检样品以及为了组织学目的而采取的冷冻切片。这类样品包括血液和血液级分或产品(例如血清、血小板、红细胞等)、淋巴、骨髓、痰液、支气管肺泡灌洗液、羊膜液、毛发、皮肤、培养细胞(例如主要培养基、外植体和转化细胞)、大便、尿液等。在靶核酸制备之前，可以新制生物样品，冻结或福马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织(ffpe)。

所提供的pcr组合物与粗核酸提取方法相容，并且可以耐受从样品制备中携带的pcr抑制物。pcr组合物与粗细胞或组织裂解物相容，如那些由例如液体形式的全血、纸上干燥的全血、口腔拭子(例如口腔粘膜)、原始唾液、尿液、血清、毛囊、植物叶和ffpe制备的粗细胞或组织裂解物。

如本文所使用的术语“粗制样品”是指疑似含有核酸的生物源的样本，其未经历用于分离或纯化那些核酸的程序。举例来说，血液或尿液样品是粗制样品。此外，在含有裂解试剂的点到纸(如fta纸(可以从沃特曼(whatman)商购获得))上的血液样品也被认为是粗制样品。颊细胞的口腔拭子是粗制样品的另一个实例。粗制样品包括但不限于血液、稀释血液、纸上血液、口腔拭子和用于样品储存的衬底如fta纸上的口腔拭子。可以任选地裂解粗制样品中的细胞以产生“粗裂解物”。所属领域的技术人员将认识到各种各样的其它粗制样品或粗裂解物，本教导将促进其的分析。

在扩增或合成后，可分离扩增或合成的核酸片段以用于进一步使用或表征。此步骤通常通过按尺寸或通过任何物理或生物化学手段来分离扩增或合成的核酸片段来完成，所述手段包括凝胶电泳、毛细管电泳、层析(包括分级、亲和和免疫层析)、密度梯度离心和免疫吸附。示例性方法是通过凝胶电泳分离核酸片段，其提供了灵敏地分离多种核酸片段的快速且高度可重复手段，并允许直接、同时比较几种核酸样品中的片段。

在一个实施例中，根据标准技术如化学提取、电洗脱或物理切除，从用于识别的凝胶(参见上文)中移除一个或多个扩增或合成的核酸片段。然后可以将分离的独特核酸片段插入标准载体中，其包括适用于转染或转化多种原核(细菌)或真核生物(酵母、植物或包括人类和其它哺乳动物的动物)细胞的表达载体。可替代地，通过所述方法生成的核酸可以进行进一步表征，例如通过测序(即确定核酸片段的核苷酸序列)、通过下文所描述的方法和所属领域中标准的其它方法(参见例如美国专利第4,962,022号和第5,498,523号，所述案涉及dna测序方法)。也可以采用经典的测序方法，如sanger链终止法(sanger,f.等人《美国国家科学院院刊》74:5463-5467(1977))和maxam和gilbert化学裂解方法(maxam,a.m.和gilbert,w.《美国国家科学院院刊》74:560-564(1977))。

在一个实施例中，通过所述方法生成的核酸可以通过下一代测序进行进一步表征。如本文所使用的术语“下一代测序”或“ngs”通常是指高通量测序技术，其包括但不限于大规模平行标记测序、高通量测序、连接测序(例如solid测序)、质子离子半导体测序、dna纳米球测序、单分子测序和纳米孔测序。

用于扩增和/或测序的合适的dna聚合酶可以包括那些本文先前所公开的dna聚合酶中的任一种。在一些实施例中，这类聚合酶包括但不限于嗜热栖热菌(tth)dna聚合酶、水生栖热菌(taq)dna聚合酶、新阿波罗栖热袍菌(tne)dna聚合酶、海栖热袍菌(tma)dna聚合酶、海滨嗜热球菌(tli或vent^tm)dna聚合酶、激烈热火球菌(pfu)dna聚合酶、deepvent^tmdna聚合酶、伍氏热火球菌(pwo)dna聚合酶、热火球菌属kod2(kod)dna聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(bst)dna聚合酶、温泉芽孢杆菌(bacilluscaldophilus)(bca)dna聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(sac)dna聚合酶、嗜酸热原体(tac)dna聚合酶、黄栖热菌(tfl/tub)dna聚合酶、红色栖热菌(tru)dna聚合酶、布氏栖热菌(dynazyme^tm)dna聚合酶、嗜热自养甲烷杆菌(mth)dna聚合酶、分枝杆菌dna聚合酶(mtb、mlep)、大肠杆菌polidna聚合酶、克列诺片段、t5dna聚合酶、t7dna聚合酶和整体poli型dna聚合酶；其突变体、变异体和衍生物，和前述聚合酶的组合。

合适的核酸聚合酶可以是嗜温的或嗜热的，并且优选是嗜热的和热稳定的。如本文所使用的术语“热稳定核酸聚合酶”是指当与例如来自大肠杆菌的核苷酸聚合酶比较时对热相对稳定的并且催化核苷三磷酸的聚合的酶。通常，酶将在退火到靶序列上的引物的3'端开始合成，并且将沿着模板沿5'方向上进行，并且如果具有5'到3'核酸酶活性，那么进行水解干预、退火探针以释放标记和未标记的探针片段直到合成终止。从水生栖热菌(taq)分离的代表性热稳定酶描述于美国专利第4,889,818号中和用于在常规pcr中使用其的方法描述于saiki等人，1988，《科学》239:487中。

合适的嗜温性dna聚合酶包括poli族dna聚合酶(和其对应的克列诺片段)，其中任一种可以从生物体中分离，如大肠杆菌、流感嗜血杆菌、抗辐射奇异球菌、幽门螺杆菌、嗜热光合绿曲菌、普氏立克次氏体、梅毒密螺旋体、集胞藻属、枯草杆菌、乳酸乳球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、麻风杆菌、耻垢分枝杆菌、噬菌体l5、phi-c31、t7、t3、t5、sp01、sp02、来自酿酒酵母mip-1的线粒体和真核秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇(astatke,m.等人，1998，《分子生物学杂志(jmol.biol.)》)278,147-165)，以及从任何来源分离的poliii型dna聚合酶和其突变体、衍生物或变异体等。

在某些实施例中，核酸聚合酶具有5'→3'核酸外切酶活性。如本文所定义，“5'→3'核酸酶活性”或“5'到3'核酸酶活性”是指模板特异性核酸聚合酶的活性，其包括与一些dna聚合酶传统上相关的5'→3'核酸外切酶活性，由此以顺序方式将核苷酸从寡核苷酸的5'端移除(即大肠杆菌dna聚合酶i具有此活性，而克列诺片段不具有此活性)；或5'→3'核酸内切酶活性，其中裂解发生在来自5'端或两者的超过一个磷酸二酯键(核苷酸)。taqdna聚合酶具有dna合成依赖性，链置换5'-3'外切核酸酶活性(参见gelfand，《pcr技术中的“taqdna聚合酶”：用于dna扩增的原理和应用(”taqdnapolymerase”inpcrtechnology：principlesandapplicationsfordnaamplification)》，erlich编，纽约的stocktonpress(1989)，第2章)。在一些实施例中，本文考虑了包含逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)的方法。在这类方法中，本文所提供的组合物和反应混合物可以进一步包含具有逆转录酶活性的酶。具有逆转录酶活性的合适的酶可以是例如逆转录病毒的逆转录酶，如莫洛尼氏鼠类白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，m-mlv)逆转录酶、劳氏肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(hiv)逆转录酶、amv逆转录酶、rav逆转录酶、mav逆转录酶、aslv逆转录酶以及慢病毒逆转录酶或其具有逆转录酶活性的相应突变体、变异体或衍生物。如本文所使用的“突变体、变异体或衍生物”是指所有排列的可能存在或生成的化学物种，其仍保留所述化学物种的最终化学活性。用于本发明的一些优选酶包括rna酶h+酶，例如rna酶h+m-mlv或rna酶h+amv逆转录酶。可替代地，逆转录酶可以具有降低的、显著降低的或消除的rna酶h活性(参见例如美国专利第7,078,208号，所述案的公开内容以全文引用的方式完全并入本文中。rna酶h是进行性5'和3'核糖核酸酶，其对rna-dna杂交体的rna链具有特异性(perbal，《分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)》，纽约：wiley和sons(1984))。rna酶h活性可以通过多种测定来确定，例如在美国专利第5,244,797号，kotewicz,m.l.等人，《核酸研究》16:265(1988)和gerard,g.f.等人，focus14(5):91(1992)中所描述的那些测定。

与天然存在的逆转录酶相比，所述逆转录酶可以包含突变。举例来说，可以修饰逆转录酶以含有提供增加的逆转录酶稳定性和/或功能性的突变。合适的酶还可以包括那些其中末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)活性已降低、显著降低或消除的酶。表现出这类增加或减少的功能性的逆转录酶描述于例如美国专利第7,056,716和7,078,208中。

如本文所展示，与利用市售主混合物进行的同等pcr相比，本文所提供的组装pcr组合物可有效地缩短pcr运作时间。当添加到pcr中的核酸样品是粗裂解物和/或靶序列以低拷贝数存在时尤其如此。在一些实施例中，通过较低ct值证明这种pcr运作时间的缩短。在一些实施例中，与利用市售组合物或主混合物进行的同等pcr相比，当使用本文所提供的组装pcr组合物时，ct值低至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

如本文所使用的术语“ct”或“ct值”是指阈值循环并且表示pcr扩增测定的循环，在所述测定中来自指示扩增子产生(例如荧光)的报道子的信号首先变得具有超过背景水平的可检测性。在一些实施例中，阈值循环或“ct”是pcr扩增变为指数型时的循环数。在一个实施例中，来自报道子的信号如荧光被描述为δrn。如本文所使用的术语“drn”或“δrn”是指由背景信号(基线)中减去归一化报道子信号(rn)的差，然后其通过被动参考信号进行归一化。δrn可以由式rn⁺-rn^-来确定，其中rn⁺是用于包括所有组件(包括模板)的反应的rn值，和rn^-是用于未反应样品的值。

根据各种实施例，可以使用pcr曲线的导数确定ct值。举例来说，可以在pcr曲线上执行一阶、二阶或n阶导数法以便确定ct值。在各种实施例中，导数的特征可用于确定ct值。这些特征可以包括但不限于二阶导数的正拐点、二阶导数的负拐点、二阶导数的零交叉或一阶导数的正拐点。在各种实施例中，可以使用阈值方法和基线方法来确定ct值。举例来说，可以使用导数方法来建立pcr曲线的指数期的上限，同时可以确定pcr曲线的基线以建立pcr曲线的指数期的下限。可以根据pcr曲线的上限和下限建立阈值，根据所述阈值确定ct值。所属领域已知的用于确定ct值的其它方法例如但不限于拟合点方法的各种实施例以及s形方法的各种实施例(参见例如美国专利第6,303,305号；第6,503,720号；第6,783,934号；第7,228,237号和美国申请第2004/0096819号；所述案的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

如本文所使用的术语“退火”和“杂交”可互换使用，并且是指一种核酸与另一种核酸的互补碱基配对相互作用，其引起双链体、三链体或其它更高级的结构的形成。在一些实施例中，主要相互作用是通过watson/crick和hoogsteen型氢键联的碱特异性的，例如a/t和g/c。在某些实施例中，碱基堆积和疏水性相互作用也可以促成双链体稳定性。使核酸探针和引物与互补和基本上互补的靶序列杂交的条件是熟知的，例如描述于《实用方法-核酸杂交(nucleicacidhybridization,apracticalapproach)》，b.hames和s.higgins编，irlpress，华盛顿特区(1985)和j.wetmur和n.davidson，《分子生物学(mol.biol.)》31:349及以下(1968)中。一般来说，所述退火是否进行尤其受以下的影响：探针和互补靶序列的长度、ph、温度、一价和二价阳离子的存在情况、杂交区中的g核苷酸和c核苷酸的比例、培养基的粘度和变性剂的存在情况。所述变量影响杂交所需的时间。因此，优选退火条件将取决于特定应用。然而，在无过度实验的情况下，这类条件可以常规地由所属领域的普通技术人员确定。此外，通常将本教导的探针和引物设计成与靶序列互补以使得靶标和探针或引物发生杂交。然而，应理解，这种互补性不需要是完美的；可以存在任何数量的碱基对错配，其将干扰本教导的靶序列与单链核酸之间的杂交。然而，如果碱基对错配的数目如此之大以至于即使在最不严格的杂交条件下也不会发生杂交，所述序列不是互补的靶序列。因此，本文中的“基本上互补”是指探针或引物与靶序列充分地互补以在选定反应条件下进行杂交。

如本文所使用的术语“标记物”是指可用于提供可检测信号且可附着于核酸或蛋白质上的任何原子或分子。标记物可以提供可通过荧光、放射性、比色法、重量分析、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。在一些实施例中，可检测信号是可量化信号。

举例来说，标记物可以是具有以下情况的任何部分：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰由第一或第二标记物提供的可检测信号；或(iii)赋予捕获功能，例如疏水亲和力、抗体/抗原、离子络合。所属领域的技术人员应了解，许多不同物种的报道标记物可以单独地或与一种或多种不同标记物组合用于本教导中。示例性标记物包括但不限于荧光团、放射性同位素、量子点、色原、酶、抗原(包括但不限于表位标签、重金属、染料、磷光基团、化学发光基团、电化学检测部分、亲和标签、结合蛋白、磷光体、稀土螯合物和近红外线染料)。

合适的可检测标记物包括例如荧光素(例如5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-fam)；5-hat(羟基色胺)；6-hat；6-joe；6-羧基荧光素(6-fam)；fitc)；alexa荧光体(例如350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；bodipy^tm荧光团(例如492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-x、650/665-x、665/676、fl、flatp、fi-神经酰胺、r6gse、tmr、tmr-x缀合物、tmr-x、se、tr、tratp、tr-xse)、香豆素(例如7-氨基-4-甲基香豆素、amc、amca、amca-s、amca-x、abq、cpm甲基香豆素、香豆素鬼笔环肽、羟基香豆素、cmfda、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素am、钙黄绿素蓝、钙染料(例如钙深红、钙绿、钙橙、钙荧光白)、层叠蓝、层叠黄；cy^tm染料(例如3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色gfp、环状amp荧光传感剂(ficrhr)、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(例如gfp、egfp)、蓝色荧光蛋白(例如bfp、ebfp、ebfp2、蓝铜矿、mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、天蓝色、cypet)、黄色荧光蛋白(例如yfp、柠檬黄、venus、ypet)、fret供体/受体对(例如荧光素/四甲基罗丹明、iaedans/荧光素、edans/dabcyl、荧光素/荧光素、bodipy^tmfl/bodipy^tmfl、荧光素/qsy7和qsy9)、lysotracker^tm和lysosensor^tm(例如lysotracker^tm蓝dnd-22、lysotracker^tm蓝-白dpx、lysotracker^tm黄hck-123、lysotracker^tm绿dnd-26、lysotracker^tm红dnd-99、lysosensor^tm蓝dnd-167、lysosensor^tm绿dnd-189、lysosensor^tm绿dnd-153、lysosensor^tm黄/蓝dnd-160、lysosensor黄/蓝10,000mw葡聚糖)、俄勒冈绿(例如488、488-x、500、514)；罗丹明(例如110、123、b、b200、bb、bg、bextra、5-羧基四甲基罗丹明(5-tamra)、5gld、6-羧基罗丹明6g、丽丝胺、丽丝胺罗丹明b、鬼笔环肽、鬼笔环肽、红、rhod-2、5-rox(羧基-x-罗丹明)、磺酰罗丹明b可c、磺酰罗丹明gextra、四甲基罗丹明(tritc)、wt)、德克萨斯红、德克萨斯红-x、vic以及其它标记物，其描述于例如美国公开第2009/0197254号)，尤其是如所属领域的技术人员已知的标记物。也可以使用其它可检测标记物(参见例如美国专利申请公开第2009/0197254号)，如所属领域的技术人员所知。

荧光报道分子-猝灭分子对已经并入寡核苷酸探针中以便基于分离或以最小猝灭距离彼此靠近的荧光报道分子和猝灭分子监测生物事件。举例来说，已经研发了其中报道分子荧光的强度由于报道分子与猝灭分子的分离而增加的探针。还研发了由于猝灭分子与报道分子靠近而失去荧光的探针。这些报道-猝灭分子对探针已用于通过监测由报道分子产生的荧光信号的出现或消失来监测杂交测定和核酸扩增反应，尤其是聚合酶链式反应(pcr)。(举例来说，参见美国专利第6,030,787号)。

示例性报道-猝灭对可以选自咕吨染料，包括荧光素和罗丹明染料。这些化合物的许多合适形式可以广泛地商购获得，其苯基部分上具有取代基，所述苯基部分可用作键合位点或用作附着到寡核苷酸上的键合官能团。另一组荧光化合物是萘胺，其在α或β位置具有氨基。这类萘基氨基化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯和2-对甲苯氨基-6-萘磺酸酯。其它染料包括3-苯基-7-异氰酸根合香豆素、吖啶，如9-异硫氰酸根合吖啶和吖啶橙；n-(对(2-苯并恶唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并恶二唑、芪、芘等。

报道分子和猝灭分子优选选自荧光素和罗丹明染料。这些染料和适用于附着到寡核苷酸上的连接方法描述于许多参考文献中，例如marshall，《组织化学杂志(histochemicalj.)》，7:299-303(1975)；menchen等人，美国专利第5,188,934号；menchen等人，欧洲专利申请87310256.0；和bergot等人，国际申请pct/us90/05565。

本文所使用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所希望的主题。本公开中引用的包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍以及论著的所有文献出于任何目的以全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入文献中的任一篇与本公开中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本公开为准。

虽然已经就这些示例性实施例而言描述了本教导，但是所属领域的技术人员将容易理解，这些示例性实施例的许多变化和修改是可能的并且无需过多实验。所有这类变化和修改都在现有教导的范围内。可以根据以下实例来进一步理解本教导的方面，所述实例不应解释为以任何方式限制本教导的范围。

实例

实例1：示例性组合物

将示例性组合物配制成双重浓缩原液，其包含热稳定dna聚合酶、钾盐、镁盐、硅基消泡剂、dntp(包括dgtp和7-脱氮-dgtp、bsa、鱼明胶的组合)、缓冲溶液、热启动组分、甘油、除吐温20以外的非离子型清洁剂和被动参考染料。如下文实例中所描述，在许多测定中测试示例性pcr组合物。

实例2：利用示例性组合物进行的未纯化样品的pcr优异灵敏度

将taqman^tm拷贝数测定中的实例1的pcr组合物的性能与使用两种不同核酸样品的市售组合物taqman^tm快速发展的主混合物(“mm”；appliedbiosystems^tm，目录号4444557)的性能进行比较。对于测定和mm，根据制造商的协议进行测定，但在一组测定中用示例性组合物代替mm。

根据制造商的协议(appliedbiosystems^tm，目录号4402599)，由使用口腔拭子和dna全部提取试剂盒获得的口腔粘膜制备粗制核酸样品。简单地说，通过在参与者口腔每侧的脸颊上摩擦4n6floqswab获得口腔粘膜样品。将拭子添加到200微升裂解试剂中，并在95℃下温育3分钟。在将样品冷却到室温后，向每个裂解溶液样品中添加200微升稳定化试剂以形成具有口腔粘膜的粗裂解物。

使用2微升粗裂解物和额外量的裂解溶液进行taqman^tmrna酶p拷贝数测定。反应重复进行两次。

单组装20μlpcr含有以下组分：

1μlrna酶p测定(20×；正向和反向pcr引物和taqman^tm探针)

2μl粗裂解物

1、2、3、4或7μl裂解溶液

10μltaqman^tm快速发展的主混合物或实例1的组合物

不含rna酶的水到20μl总pcr体积

在以下热循环条件情况下使用appliedviia^tm7实时pcr系统进行pcr：

ung步骤(任选的)：50℃，2分钟

激活：95℃，20秒

(变性：95℃/1秒；

延伸：60℃/20秒)×40次循环

使用实例1的组合物或商业mm进行的每个测定的确定阈值循环数(ct)示于图1a-图1g中。实例1的组合物引起由2微升口腔拭子的粗裂解物进行的单拷贝基因rna酶p的扩增和检测，而未使用市售pcr主混合物获得信号。使用实例1的组合物，即使在额外的1、2、3或4μl裂解溶液的存在情况下也检测到rna酶p信号。这种由粗裂解物加额外的裂解溶液进行的信号检测表明反应条件允许在测定中使用额外的样品裂解物。因此，本文所提供的示例性组合物支持由粗裂解物样品进行的更强力的扩增，并且比市售主混合物对从粗制提取物中携带的pcr抑制物更耐受。

将新制原始唾液样品用作dna源以用于在拷贝数测定中比较示例性组合物与市售pcr主混合物。唾液样品未用裂解溶液或方法进行预处理。使用1-9微升原始唾液进行taqman^tmrna酶p拷贝数测定。反应重复进行两次。

单组装20μlpcr含有以下组分：

1μlrna酶p测定(20×；正向和反向pcr引物和taqman^tm探针)

10μltaqman^tm快速发展的主混合物或实例1的组合物

1-9μl原始唾液

不含rna酶的水到20μl总pcr体积

在如上所述的热循环条件情况下，pcr作为viia^tm7实时pcr系统进行。使用实例1的组合物或商业mm进行的每个测定的确定阈值循环数(ct)示于图2a-图2g中以用于不同体积的原始唾液。实例1的组合物引起由所有所测试唾液样品进行的单拷贝基因rna酶p的扩增和检测，而只有1μl唾液样品使用市售pcr主混合物产生信号。原始唾液的1、2、3、4和9μl样品中的每一个用示例性pcr组合物产生清晰的可检测响应(图2a-图2g，上组，左框)。市售pcr主混合物与超过5％反应体积的唾液不相容。用市售pcr主混合物从原始唾液粗裂解物的2、3、4或9μl样品中并没有获得信号(图2a-图2g，上组，右框)。因此，本文所提供的示例性组合物支持由原始唾液样品进行的更强力的扩增，并且比市售主混合物对从原始唾液中携带的pcr抑制物更耐受。

实例3：利用示例性组合物进行粗裂解物样品的基因分型

根据制造商的协议，使用dna全部提取试剂盒由全血制备粗制核酸样品。简单地说，在95℃下将具有全血样品的样品与裂解溶液温育在一起3分钟，然后添加稳定化溶液以产生血液粗裂解物。

cyp2c19*.g.-806c>ttaqman^tm基因分型分析(应用生物系统taqman^tmsnp基因分型测定id第c_469857_10号)是使用各2微升的血液粗裂解物和实例1的示例性pcr组合物进行的。根据制造商的协议进行基因分型测定。进行五十次pcr循环以进行测定。

由粗制血液裂解物的分析得到的基因分型曲线示于图3中。vic标记的taqman^tmmgb探针检测等位基因1(次要等位基因)并且fam标记的taqman^tm探针检测等位基因2。在图3的图表中，线表示每次pcr循环的信号强度的轨线，并且密集处显示第40次循环时的强度。这些结果显示本文所提供的示例性组合物可以用粗制核酸样品产生准确的基因分型结果。具有示例性组合物的pcr和基因分型测定耐受粗制核酸样品中存在的pcr抑制物。

实例4：利用示例性组合物比较粗裂解物和纯化dna样品

进行粗裂解物与纯化dna样品之间的拷贝数变化的比较。根据制造商的协议，使用appliedbiosystems^tmdna全部提取试剂盒由全血制备粗裂解物。按照制造商的协议(赛默飞费舍尔科技)，使用magmax^tm样品制备系统产生纯化dna样品。定量纯化dna并归一化到5ng/μl。

用来自18个全血样品的粗裂解物和纯化dna进行taqman^tm拷贝数变化测定。利用实例1的示例性pcr组合物在10μlpcr中对2μl粗裂解物或10ng纯化dna进行拷贝数变化测定hs00010003_cn，48dgvid。通过δδct方法用rna酶p基因作为归一化基因计算拷贝数，并使用appliedbiosystems^tmcopycaller^tm软件版本2.1进行拷贝数计算。图4a-图4b描绘了表示粗裂解物的拷贝数的左侧柱和表示来自相应纯化dna样品的拷贝数的右侧柱的结果。由于本文所提供的示例性pcr组合物的高抑制物耐受性，拷贝数变化结果在粗裂解物与纯化dna样品之间是可比较的。因此，本文所提供的示例性组合物在使用粗裂解物样品进行的拷贝数变化测定中表现良好。这些结果表明，本文所提供的示例性组合物可以使用粗制核酸样品产生准确的拷贝数结果。利用示例性组合物进行的pcr和拷贝数测定耐受粗制核酸样品中存在的pcr抑制物。

实例5：不同浓度的不同消泡剂的比较

购买快速green主混合物(赛默飞费舍尔科技)并根据制造商的说明书以1×浓度使用，并如下所述添加额外组分。将10μg/μl模板cdna(根据制造商的说明用安捷伦(agilent)通用人类参考rna和应用生物系统的大容量cdna逆转录试剂盒来制备)和200nm18s基因靶正向和反向引物添加到主混合物中。在将10-μl反应/孔等分到384孔微量滴定板(在96孔复制品中测试的四种不同消泡剂浓度中的每一种)中之前，将不同浓度(0％、0.01％、0.05％和0.1％)的消泡剂204(西格玛)(图5a-图5d)或消泡剂se-15(西格玛)(图6a-图6d)添加到主混合物中。在扩增之前，但是在以1000rpm电镀和离心60秒之后，目视检查每个反应孔内的气泡形成。然后根据制造商的说明书使用用于viia7实时pcr系统(应用生物系统)的默认快速循环条件进行扩增。在图5a-图5d和图6a-图6d中，图表中的水平和红色曲线表示rox被动参考染料的荧光信号，而绿色曲线在热循环期间追踪pcr靶标的green染料荧光度。

如图5a-图5d中所示，在没有添加消泡剂204的情况下，左上曲线显示在循环之前观察到87个气泡，并且那些气泡在循环0-36之间的任意时间消失(由rox荧光度的增加表示)。在添加0.01％消泡剂204的情况下，在pcr之前计数60个气泡并且似乎在反应的第一次循环之前已经消除掉。在添加0.05％和0.1％消泡剂204的情况下，在平板离心后未观察到气泡，并且不影响rox被动信号。

如图6a-图6d中所示，在没有添加消泡剂se-15的情况下，左上曲线显示在循环之前观察到92个气泡，并且那些气泡在循环0-40之间的任意时间消失(由rox荧光度的增加表示)。在添加0.01％消泡剂se-15的情况下，在pcr之前计数10个气泡，并且似乎在反应的第二次循环之前已经消除掉。在添加0.05％和0.1％消泡剂se-15的情况下，在平板离心后未观察到气泡，并且不影响rox被动信号。