过继细胞疗法中CCR2+造血干细胞介导的T细胞激活的制作方法

根据35u.s.c§119(e)，本申请要求2016年12月21日提交的美国临时申请号62/437582的权益，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持

本发明是在国立卫生研究院授予的r01ca194239的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术：

正在研究增强针对多种细胞(包括癌细胞)的cd4和cd8t细胞活性的方法，来治疗癌症和传染病。在一种策略中，用抗原刺激t淋巴细胞，并离体扩增，然后输入受试者。这是过继细胞疗法(act)的形式。在早期临床试验中已经显示某些act策略诱导了癌症消退。act可特别用于治疗免疫消融和造血干细胞移植(hsct)后出现的癌症和/或传染病。

研究用于治疗癌症的另一种方法是高剂量化学疗法，然后使用从骨髓收集的、或从骨髓中动员(mobilized)并在外周血中收集的造血干细胞(hsc)进行造血干细胞移植(hsct)。当hsct和/或hsc动员与诱导淋巴细胞减少的治疗组合时，可以增强某些基于细胞的免疫疗法的效果。在患有不同癌症的许多受试者中，单独施用hsc或hsc动员剂未显示临床效果。

发明人先前获得了独特的观察，即骨髓衍生的造血干细胞(hsc)，包括ccr2+细胞，在某些情况下可以增强免疫检查点抑制剂的疗法(pct/us16/44718，其全部内容通过引用并入本文)。

技术实现要素：

根据本公开已经发现，相对于单独的act，ccr2阳性(ccr2⁺)hsc和act一起施用显著增加过继转移的t细胞在肿瘤微环境和肿瘤引流淋巴结中的激活和ifnγ分泌。本发明人惊奇地发现，对接受过继细胞疗法(act)但未用免疫检查点抑制剂接受过免疫检查点阻断的受试者施用ccr2⁺hsc，导致act的存活增加。不希望受任何本公开理论的束缚，通过证明ccr2⁺hsc转移与act的组合导致肿瘤微环境内ifnγ阳性t细胞的增加来提供对机制的了解。

在一个方面，act平台采用来自肿瘤的总rna冲击的(pulsed)骨髓衍生的树突细胞，从而离体扩增肿瘤特异性t细胞(ttrna-t细胞)(flores等人，2015)。这些研究表明，相对于单独的act，hsc和act一起施用显著增加肿瘤微环境和肿瘤引流淋巴结中的ttrna-t细胞激活和ifnγ分泌。根据本发明，提供了一种在受试者中治疗选自癌症或传染病的疾病的方法。该方法涉及向患有所述疾病的受试者施用过继细胞疗法(act)和向所述受试者施用含有造血干细胞的制剂，其量足以有效治疗所述疾病，其中造血干细胞(hsc)富含ccr2阳性(ccr2+)细胞(或ccr2+细胞的前体)，并且其中所述受试者未接受免疫检查点抑制剂。

在实施方案中，制剂中的hsc是谱系耗尽的。在实施方案中，制剂中的hsc是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的ccr2+细胞(或ccr2+细胞的前体)。在实施方案中，制剂中的hsc是小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或甚至小于1％的ccr2阴性(ccr2-)细胞。在实施方案中，制剂中50％至100％的细胞是ccr2+细胞(或ccr2+细胞的前体)。

在实施方案中，制剂中的细胞是ccr2+细胞的前体，如cd34+hsc、cd34+cd38+hsc或醛脱氢酶(aldh)强阳性(bright)hsc所限定的，其可以产生ccr2+谱系阴性hsc。

在任何前述实施方案中，任选地所述受试者已经用放射疗法或化学疗法进行过治疗。在任何前述实施方案中，任选地所述受试者被安排接受放射疗法或化学疗法。

在任何前述实施方案中，造血干细胞的来源可以是骨髓、外周血、脐带血或诱导的多能干细胞。在任何前述实施方案中，造血干细胞的来源可以是造血祖细胞。在任何前述实施方案中，干细胞的来源可以是自体的。在任何前述实施方案中，干细胞的来源可以是同种异体的，并且供体细胞与受体是hla匹配的。

在任何前述实施方案中，过继细胞疗法可以是嵌合抗体受体(car)修饰的t细胞。在一些实施方案中，所述疗法可用于治疗本文所述的任何疾病或感染。

在任何前述实施方案中，所述疾病可以是癌症，癌症可以是黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、肥大细胞瘤、原发性肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤、淋巴瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、低级别神经胶质瘤、高级别神经胶质瘤、小儿脑癌、成神经管细胞瘤，或其转移性癌。

在实施方案中，癌症是脑、肺、乳腺或黑素瘤的转移性或难治性癌症。在实施方案中，癌症是来自非小细胞肺癌的转移性脑癌、来自黑素瘤的转移性脑癌或来自乳腺癌的转移性脑癌。在实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤、低级别神经胶质瘤、高级别神经胶质瘤、小儿脑癌或成神经管细胞瘤。

在任何前述实施方案中，所述疾病可以是传染病。在实施方案中，传染病是慢性传染病。在实施方案中，传染病是任何肝炎，腺病毒，多瘤病毒如bk，人免疫缺陷病毒(hiv)，单纯疱疹病毒(hsy)，呼吸道合胞病毒(rsv)，巨细胞病毒(cmv)，epstein-barr病毒(eby)，甲型、乙型和/或丙型流感，水泡性口炎病毒(vsv)，疱疹性口腔炎病毒(vesicularstomatitisvims，vsv)，金黄色葡萄球菌的种包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，链球菌的种包括肺炎链球菌，或移植后感染。在实施方案中，传染病是甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎。

根据本发明的另一方面，提供了对act的改进来治疗受试者。该改进涉及向所述受试者施用含有造血干细胞的制剂(即施用hst)，其中造血干细胞(hsc)富含ccr2阳性(ccr2+)细胞(或ccr2+细胞的前体)，并且其中所述受试者没有接受免疫检查点抑制剂。在实施方案中，制剂中的hsc是谱系耗尽的。在实施方案中，制剂中的hsc是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的ccr2+细胞(或ccr2+细胞的前体)。在实施方案中，制剂中的hsc是小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或甚至小于1％的ccr2阴性(ccr2-)细胞。在实施方案中，制剂中50％至100％的细胞是ccr2+细胞(或ccr2+细胞的前体)。在任何前述实施方案中，act可以治疗患有癌症或传染病的受试者。癌症和传染病可以如上所述。

根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒。该试剂盒是含有第一容器和第二容器以及使用说明书的包装，其中第一容器含有用于act的t细胞，第二容器含有hsc，其中造血干细胞(hsc)富含ccr2阳性(ccr2+)细胞(或ccr2+细胞的前体)，其中所述说明书指明不与免疫检查点抑制剂一起使用。在实施方案中，制剂中的hsc是谱系耗尽的。在实施方案中，制剂中的hsc是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的ccr2+细胞(或ccr2+细胞的前体)。在实施方案中，制剂中的hsc是小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或甚至小于1％的ccr2阴性(ccr2-)细胞。在实施方案中，制剂中50％至100％的细胞是ccr2+细胞(或ccr2+细胞的前体)。在任何前述实施方案中，t细胞和hsc可以是同基因的，也可以不是同基因的。)在任何前述实施方案中，t细胞可以是cart细胞。在任何前述实施方案中，t细胞和hsc可以是hla匹配的。

下面进一步详细描述本发明的这些和其它方面。

附图简要说明

图1a显示在恶性胶质母细胞瘤模型中当与抗pd-1组合时，ccr2+hsc可以在引流淋巴结中穿过主要(prime)宿主t细胞。

图1b显示在成神经管细胞瘤模型中当与抗pd-1组合时，ccr2+hsc可以在引流淋巴结中穿过主要宿主t细胞。

图2显示相对于单独的act，hsc与act一起施用显著增加肿瘤微环境和肿瘤引流淋巴结内的ttrna-t细胞激活和ifnγ分泌。使用rt2pcr阵列来分析rna的t细胞和b细胞激活，所述rna来自接受act+hsc与接受单独act的小鼠。

图3a-3c显示ccr2⁺hsc转移与肿瘤微环境中增加的ttrna-t细胞激活有关。图3a显示将hsc进一步分为ccr2+hsc或ccr2-hsc，并转移到接受act的荷瘤小鼠中。使用great小鼠产生用于act的肿瘤特异性t细胞。在act后一周，收获肿瘤并在组之间定量yfp(ifnγ)的相对表达。图3b显示转移后24小时，相对于ccr2-hsc，在颅内肿瘤中发现更多的ccr2+hsc。图3c显示ccr2-hsc衍生细胞和ccr2+hsc衍生细胞分离自接受act与ccr2-hsc或ccr2+hsc的小鼠的颅内肿瘤。使用流式细胞术对hsc衍生细胞进行表型分型。

图4显示ccr2⁺hsc在体外分化成apc。从小鼠骨髓中新鲜分离ccr2-hsc和ccr2+hsc，并在先前建立的树突细胞产生方案中体外培养。针对抗原呈递细胞标志物cd11c、cd80、cd86、gr1-1、mhcii，对得到的细胞进行表型分型。然后，测试来自ccr2-hsc和ccr2+hsc的所得细胞呈递肿瘤抗原的能力。肿瘤特异性效应t细胞用于靶向肿瘤rna冲击的ccr2-hsc衍生细胞、或用肿瘤rna冲击的ccr2+hsc衍生细胞。测量ifnγ作为同源抗原的t细胞识别的指示。

图5a-5c显示ccr2⁺hsc衍生细胞向颅内肿瘤内的t细胞呈递肿瘤抗原。图5a显示从接受act的荷瘤小鼠中分离出hsc衍生细胞。将效应肿瘤特异性t细胞(ttrnat细胞)用于体外功能性测定以靶向分离的hsc衍生细胞。测量ifnγ的分泌，作为同源肿瘤抗原呈递给肿瘤特异性t细胞(ttrnat细胞)的指示。图5b显示从mhci^-/-或mhcii^-/-小鼠分离的hsc被转移到晚期荷瘤小鼠中，通过great小鼠产生的肿瘤特异性t细胞，使所述小鼠接受act。act后一周，切除肿瘤并分析cd3⁺yfp⁺细胞的相对表达。图5c显示从有或没有放射的颅内肿瘤分离的hsc衍生细胞具有激活ttrna-t细胞的能力。

图6a-6b显示瘤内ccr2⁺hsc衍生细胞在外周交叉主要肿瘤特异性t细胞。图6a显示携带已建立的kr158b颅内神经胶质瘤的小鼠，接受过继细胞疗法加上gfp⁺hsc、gfp⁺ccr2^-hsc或gfp⁺ccr2⁺hsc。act后一周，使用无菌facs从肿瘤中分离gfp+细胞。然后将这些用作第二组荷瘤小鼠的“疫苗”，所述小鼠使用dsred⁺肿瘤特异性t细胞接受act。图6b显示在“疫苗”后一周收集疫苗引流淋巴结，并使用流式细胞术评估组间dsred⁺肿瘤特异性t细胞的相对扩增。

图7a显示ccr2⁺hpc细胞未能拯救清髓后(myeloablated)的宿主免于骨髓衰竭。c57bl/6小鼠接受清髓性9gytbi和新鲜分离的骨髓衍生hsc、ccr2-hsc或ccr2+hsc(所有组的每只小鼠接受10⁵个细胞)。

图7b显示ccr2⁺hsc联合过继细胞疗法提供了比单独使用大量hsc显著的存活益处。

图8显示荷瘤小鼠接受过继细胞疗法以及ccr2+hsc或ccr2-hsc。在act后一周，从肿瘤中分离hsc衍生细胞，并使用流式细胞术进行表型分析。

图9显示荷瘤小鼠接受dsred+hsc、ccr2-hsc或ccr2+hsc直接注射到肿瘤中。一周后，切除肿瘤引流的颈淋巴结，并通过流式细胞术定量dsred+的细胞相对量，以确定hsc衍生细胞是否从肿瘤渗入二级淋巴器官。接受ccr2+hsc与ccr2-hsc的组在引流淋巴结中具有显著更大量的dsred+细胞(p＝0.0480；非配对t检验)。

图10a显示使用肿瘤特异性t细胞使得c57bl/6小鼠接受act，所述肿瘤特异性t细胞由在ifnγ启动子上表达yfp的great小鼠产生。在接受hsc与act共转移的组中，在肿瘤内检测到更强的yfp表达。在含有肿瘤的全脑切片上测量平均荧光强度。

图10b显示还分离了肿瘤引流淋巴结，并使用流式细胞术分析了cd8+t细胞的yfp表达。

图11显示使用由great小鼠产生的ttrnat细胞使得荷瘤小鼠接受act，以便纵向追踪t细胞激活。随后，共转移sca1、ckit、cd133、cd38、bmpr2或ccr2限定的骨髓衍生谱系阴性hsc。细胞转移后一周，切除肿瘤并测量yfp水平以确定哪个亚群导致t细胞激活的增加。

图12显示在体外共培养功能测定中通过添加阻断抗体而阻断mhci或mhcii。hsc衍生组的平均ifnγ为802.4pg/ml，而hsc衍生+抗mhci组为161.6，p＝0.0390非配对t检验。在阻断mhcii的组中，未检测到ifnγ的显著降低。

图13a显示c57bl/6小鼠接受小脑ptc成神经管细胞瘤的肿瘤，随后是淋巴耗尽性(lymphodepletive)宿主处理(conditioning)和过继细胞疗法与大量hsc或ccr2+hsc。

图13b显示c57bl/6小鼠接受k2脑干神经胶质瘤移植到其脑干中，随后进行淋巴耗尽性宿主处理和过继细胞疗法与大量hsc或ccr2+hsc。

图14显示在过继细胞疗法之前，kr158b颅内荷瘤小鼠接受淋巴耗尽性宿主处理以及5gytbi。各群组接受大量hsc、ccr2-hsc或ccr2+hsc。接受ccr2+hsc的小鼠比接受大量hsc的小鼠具有增加的中值存活(未定义)(51天)(p＝0.0005)。

具体实施方式

通过举例说明本公开的某些方面进行以下详细描述。应当理解，在不脱离本公开的范围或精神的情况下，可以预期并且可以做出其它方面。因此，包括实施例的以下详细描述不应被视为具有限制意义。除非另有说明，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域通常采用的含义。本文提供的定义是为了便于理解本文中经常使用的某些术语，并不意味着限制本公开的范围。除非内容另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包含复数形式。除非内容另有明确规定，否则通常使用术语“或”时，包括“和/或”的含义。

过继细胞疗法(act或过继细胞转移)。过继细胞疗法是将细胞转移到患者体内从而给细胞转移免疫功能和其它特征。细胞最常见的是免疫衍生的，例如t细胞，并且可以是自体的或同种异体的。如果是同种异体的，它们通常是hla匹配的。通常，在癌症免疫疗法中，从患者中提取t细胞，任选地进行遗传修饰，并在体外培养并返回到同一患者。自体细胞而不是同种异体细胞的转移，使移植物抗宿主疾病问题最小化。例如，同种异体细胞而非自体细胞的转移使t细胞制备和储存的灵活性最大化。理想地，可以使用所谓的通用供体细胞。act可用于治疗病毒感染和/或癌症。

在免疫抑制后期间，在受试者中使用同种异体act被认为对受试者有利，具有增强免疫力的潜力，包括抗肿瘤免疫力，并且在免疫抑制后期间提高疫苗效力。已显示肿瘤特异性t细胞的act对于治疗鼠和人体系统中的实体瘤是有效的。在本公开的实施方案中，act与ccr2⁺hsc输注一起使用，其中相对于单独的act，添加ccr2⁺hsc增加了所述受试者的免疫能力。

嵌合抗原受体(car)修饰的t细胞(cart)

在一些实施方案中，用act转移的t细胞是cart。嵌合抗原受体(car)修饰的t细胞(cart)在选择性靶向特定细胞类型方面具有巨大潜力，并且利用免疫系统监测能力和针对肿瘤细胞的有效自扩增细胞毒性机制，且具有精确的特异性。该技术提供了靶向肿瘤细胞的方法，其具有单克隆抗体可变区片段的特异性，并且通过效应t细胞功能的细胞毒性影响细胞死亡。例如，抗原受体可以是scfv或任何其它单克隆抗体结构域。在一些实施方案中，抗原受体还可以是结合靶细胞的任何配体，例如天然与细胞膜蛋白结合的蛋白结合结构域。

cart疗法已成功应用于治疗多种不同的肿瘤类型，这些肿瘤对其它形式的治疗无效。cart疗法的关键在于细胞表面抗原的可用性，可以以细胞特异性方式靶向所述细胞表面抗原。存在几种选择性表达的细胞表面抗原。

在一些实施方案中，本发明部分涉及t细胞的用途，所述t细胞经遗传修饰以表达所需car(例如，含有il-15rα细胞质结构域)。表达car的t细胞在本文中称为cart细胞、cart或car修饰的t细胞。优选地，可以对细胞进行遗传修饰以在其表面上表达抗体结合结构域，从而赋予mhc非依赖性的新抗原特异性。在一些情况下，对t细胞进行遗传修饰以表达car，其将特异性抗体的抗原识别结构域与跨膜结构域和细胞质结构域组合成单个嵌合蛋白。在一些实施方案中，两种car蛋白在体内二聚化(例如，形成同源或异源二聚体)。

造血干细胞。造血干细胞(hsc)，也称为血液干细胞，是血液和骨髓中发现的未成熟细胞，可以自我更新，可以分化成各种特化细胞，如血液和免疫细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。hsc可以从骨髓中动员成循环血液。hsc促进血细胞不断更新，每天产生数十亿新血细胞。

造血干细胞移植(hsct)。造血干细胞(hsc)移植(hsct或hsc转移)是hsc的移植，hsc通常来自外周血、骨髓或脐带血。两种类型的hsct可用于受试者：自体干细胞移植，其中使用受试者自身的干细胞，或同种异体干细胞移植，其中与受体基因相似且与受体hla匹配的供体干细胞被移植到受试者。在本公开的一些实施方案中，自体干细胞用于hsct。在本公开的一些实施方案中，与所述受试者hla匹配的同种异体干细胞用于hsct。在一些实施方案中，在自体hsct中，从受试者中取出含有干细胞的样品，储存，然后将其移植回受试者。在一些实施方案中，在同种异体或自体hsct中，从受试者中取出含有ccr2+干细胞的样品，储存，然后移植到受试者中。在一些实施方案中，在同种异体或自体hsct中，从受试者中取出含有ccr2+干细胞的样品，离体培养扩增，然后移植到受试者中。在一些实施方案中，在同种异体或自体hsct中，从受试者中取出含有ccr2+干细胞的样品，针对ccr2+细胞对样品进行选择，然后将所选细胞离体培养扩增。在一些实施方案中，再次针对ccr2+细胞对扩增/培养的细胞进行选择。在一些实施方案中，储存针对ccr2+选择的细胞。在一些实施方案中，将ccr2+选择的细胞移植到受试者中。将ccr2+选择的细胞移植到接受act的受试者中。在一些实施方案中，所述受试者还接受放射或化学疗法。

造血干细胞(hsc)及其亚群。hsc代表样品中总血细胞群的一小部分，因此在向受试者施用ccr2+干细胞之前可能有利于的是增加自体或同种异体hsc的数量，用于治疗所述受试者中的疾病，例如癌症或传染病。在本公开的一些实施方案中，在将造血干细胞移植到所述受试者中用于治疗之前，收集并扩增它们。在本公开的一些实施方案中，在将造血干细胞移植到所述受试者中用于治疗之前，从样品中收集、扩增和选择它们。在一些实施方案中，在向所述受试者施用造血干细胞之前，获得含有造血干细胞的样品，并经过处理以体外扩增样品中的干细胞数量。在一些实施方案中，在向所述受试者施用造血干细胞之前，获得含有造血干细胞的样品，经过处理以在体外增加样品中干细胞的百分比。

根据本发明，造血干细胞或其祖细胞富含ccr2+细胞。在实施方案中，富集可以通过选择性地刺激干细胞的生长/扩增而不是从受试者收集的其它细胞来进行。在另一个实施方案中，可以通过从收集自受试者的其它细胞中分离干细胞来富集干细胞。这种选择可以是所谓的阳性选择或阴性选择。在一些实施方案中，在向所述受试者施用造血干细胞之前，获得含有造血干细胞的样品，并进行处理以在体外扩增样品中的干细胞数量。在一些实施方案中，在向所述受试者施用造血干细胞之前，获得含有造血干细胞的样品，并进行处理以在体外扩增样品中ccr2+干细胞或其祖细胞的数量。在一些实施方案中，在向所述受试者施用造血干细胞之前，经处理以扩增ccr2+干细胞或其祖细胞数量的样品被耗尽ccr2-细胞。

应当理解，针对ccr2⁺标志物分离或选择的hsc或其祖细胞，可另外地或替代地通过cd34⁺或lin-细胞的阳性选择来分离。还应理解，针对ccr2⁺标志物分离或选择的hsc或其祖细胞，可另外地或替代地通过阴性选择和去除ccr2-细胞来分离。在一些实施方案中，在将ccr2⁺hsc施用于受试者之前，分离和扩增ccr2⁺hsc或其祖细胞。在一些实施方案中，在将ccr2⁺hsc施用于受试者之前，分离hsc，离体选择ccr2⁺细胞或其祖细胞，并离体扩增。

在阳性选择中，基于已知在干细胞上但不在其它细胞上的标志物分离干细胞。在一些实施方案中，在阳性选择中，基于标志物ccr2⁺、cd34⁺和/或lin-分离干细胞，从而针对阳性标志物富集hsc。在实施方案中，基于标志物ccr2⁺分离干细胞。

在阴性选择中，基于此类其它细胞上的标志物鉴定并去除非干细胞的细胞，留下干细胞。在阴性选择中，hsc可以离体处理以消除ccr2⁺、cd34⁺和/或lin-细胞之外的其它细胞。

这些选择过程是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于流式细胞术分析、基于微珠的分离、磁珠分离、粘附测定和/或基于配体的选择。在一些实施方案中，基于配体的选择基于ccr2配体的存在，例如ccl2、ccl7或ccl13。

在一些实施方案中，保留少于50％的ccr2-hsc起始群体。在一些实施方案中，保留少于40％、30％、20％、15％、10％、5％、2％甚至小于1％的ccr2-hsc起始群体。在一些实施方案中，用于施用的hsc制剂包含不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的ccr2-hsc。

在一些实施方案中，可以使用间隔有增殖步骤的多个阳性选择步骤。在实施方案中，施用制剂含有至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的ccr2⁺细胞，其也可能是cd34⁺和/或lin-hsc。

本文的造血干细胞来源包括：骨髓谱系耗尽细胞(lin-)，ckit⁺纯化谱系阴性骨髓衍生细胞，sca⁺纯化谱系阴性骨髓衍生细胞，ckit⁺sca⁺纯化骨髓衍生细胞，使用g-csf从宿主骨髓中动员的，使用amd3100、普乐沙福(plerixafor)或分子1,1'-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷]从宿主骨髓中动员的，脐带血或脐带血干细胞，人白细胞抗原(hla)匹配的血液，血液或骨髓衍生的间充质干细胞，从诱导多能干细胞分化的造血干细胞，动员的外周血，外周血，用ccr2+标志物纯化的包括lin-细胞的造血干细胞亚群，谱系阴性纯化的外周血或富含cd34⁺的外周血。在本公开的一些实施方案中，hsc的来源是骨髓。在本公开的一些实施方案中，hsc的来源是自体的或同种异体的，任选地其中，来源是骨髓、外周血、脐带血或诱导的多能干细胞。

造血干细胞动员剂。在本公开的一些实施方案中，可以向受试者施用造血干细胞动员剂以帮助从受试者中分离hsc。hsc动员是指将受试者的骨髓中的hsc募集到受试者的外周血中。在本申请中，hsc动员剂包括：粒细胞集落刺激因子(g-csf)、聚乙二醇化g-csf(peg化非格司亭(pegfilgratism))、来格司亭(lenogratism)、糖基化形式的g-csf、c-x-c基序趋化因子2(cxcl2)、c-x-c趋化因子受体类型4(cxcr-4)和普乐沙福(plerixafor)。

放射疗法或化学疗法。hsct通常与化学疗法一起使用。本发明人在此(例如，图7b)显示，放射疗法增强了act和施用ccr2⁺hsc的组合治疗。在一些实施方案中，接受act和ccr2⁺hsc的所述受试者也接受放射疗法或化学疗法。

癌症。本文描述的疗法包括治疗现有的或确定的癌症，即存在并且在受试者中可检测的癌症。另外，可以考虑治疗癌前病变(例如，腺瘤性息肉或细胞发育异常)用于预防癌症的发展。根据本公开可治疗的癌症包括以下癌症：黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、肥大细胞瘤、原发性肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤、淋巴瘤、间皮瘤，或其转移性癌。在本公开的实施方案中，本公开中待治疗的癌症包括胶质母细胞瘤、低级别神经胶质瘤、高级别神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、皮质胶质母细胞瘤、小儿脑癌和成神经管细胞瘤。在本公开的实施方案中，癌症是侵入性颅内神经胶质瘤。在本公开的实施方案中，癌症是脑、肺、乳腺或黑素瘤的转移性或难治性癌症。

传染病。该公开还可用于治疗传染病。通常，条件致病性微生物可以分类为病毒、真菌、寄生虫和细菌。引起人类疾病的示例性致病性病毒生物包括(但不限于)丝状病毒、疱疹病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒、小核糖核酸病毒、乳多空病毒和胃肠炎病毒。导致严重人类疾病的示例性致病性细菌是革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(e.faecium)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)；以及革兰氏阴性菌：铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholdiacepacia)、嗜麦芽单胞菌(xanthomonasmaltophila)、大肠埃希菌(escherichiacoli)、肠杆菌属(enterobacterspp)、克雷伯氏菌肺炎(klebsiellapneumoniae)和沙门氏菌属(salmonellaspp)。引起人类疾病的示例性致病性原生动物包括(但不限于)疟疾，例如恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)和卵形疟原虫(m.ovale)；锥虫病(昏睡病)，例如克氏锥虫(trypanosomacruzei)；利什曼病，例如杜氏利什曼原虫(leischmaniadonovani)；阿米巴病，例如溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)。引起人类疾病或与人类疾病相关的示例性致病性真菌包括(但不限于)白色念珠菌(candidaalbicans)、新生肌瘤菌(histoplasmaneoformans)、球孢子菌(coccidioidesimmitis)和马尔尼菲青霉菌(penicilliummarneffei)。在实施方案中，传染病生物是涉及慢性传染病的生物。特别重要的疾病是肝炎，腺病毒，多瘤病毒如bk，人类免疫缺陷病毒(hiv)，单纯疱疹病毒(hsv)，呼吸道合胞病毒(rsv)，巨细胞病毒(cmv)，eb病毒(ebv)，甲、乙、丙型流感，水疱性口炎病毒(vsv)，疱疹性口腔炎病毒(vsv)，金黄色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，链球菌包括肺炎链球菌，以及移植后感染。

抗体。以最广泛的含义使用术语抗体，具体包括例如，单一的单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体和抗体的抗原结合片段。抗体可包括来自任何免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定结构域，例如igg1、igg2、igg3或igg4亚型、iga(包括iga1和iga2)、ige、igd或igm。

在一些实施方案中，本文使用的治疗方式可以是分离的。在生物制剂背景下，分离是指生物制剂已从其天然环境中移除或已从其天然状态改变。因此，分离不一定反映分子已从其天然环境中移除或已从其天然状态改变的程度。然而，应该理解的是，已经纯化到一定程度并且可以用于其预期治疗目的的生物制剂是“分离的”。

本文使用的抗体可用于选择性结合其靶标，例如ccr2、cd34、或用于谱系耗尽的试剂盒中使用的任何靶标。

受试者。“受试者”是指哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、羊、马、牛、猪、小鼠、大鼠、啮齿动物或山羊。在重要的实施方案中，所述受试者和/或哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述受试者未接受免疫检查点抑制剂。

治疗。“治疗”和“疗法”包括当受试者患有病症时所发生的作用，所述作用减轻病症严重性(或与病症相关的症状)或延缓或减缓病症进展(或与病症相关的症状)。这是治疗性治疗。

有效量。用有效量的本公开的溶液治疗受试者。药剂“有效量”通常是指足以引起所需生物反应的量，即治疗所述病症。如本领域普通技术人员所理解的，本文所述的药剂的有效量可以根据例如所治疗的病症、施用模式和受试者的年龄、身体组成和健康等因素而变化。

对于治疗性治疗，有效量是足以在治疗病症中提供治疗益处或减少或消除与病症相关的一种或多种症状的量。这可以包括改善总体疗法、减少或避免病症的症状或病因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。

通常，施用有效量以增强受试者的免疫应答。关于特定的疾病或病症，“增强免疫应答”意指疾病或病症的一种或多种症状(例如，癌症的一种或多种症状、或传染病的一种或多种症状)的停止发展、抑制进展、逆转其发展、或以其它方式得以减轻或改善。此外，有效量可以是这样的量，其减缓、停止或逆转受试者中癌细胞或传染病病原体的生长。

在一些实施方案中，ccr2⁺hsc的有效量是指增加act治疗益处的任何量；或是指相对于单独的act、act和化学疗法的组合或act和放射疗法的组合而言，改善用act治疗的所述受试者的病症的任何量。

示例性有效量的动员剂：以足够的量施用这些试剂以便将干细胞从骨髓动员到外周血中。特定动员剂的这种量例如为：每天1μg/kg至20μg/kgg-csf，优选每天5μg/kg或10μg/kgg-csf；1至20mg聚乙二醇化g-csf，优选6mg或12mg聚乙二醇化g-csf；每天1至20μg/kg聚乙二醇化g-csf；每天1至20μg/kg的来格司亭；每天1至40μg/m²c-x-c趋化因子受体4(cxcr-4)；每天1至40μg/m²普乐沙福。

通过本领域技术人员熟知的任何可用方法施用细胞。在实施方案中，细胞的施用通常通过输注(例如，静脉内)或注射(例如，皮下或瘤内)或植入。

时间规划。ccr2+hsc在施用时间上足够接近act以有利地影响治疗。在实施方案中，实际上，ccr2+hsc施用1至28天，例如放射疗法完成后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天，以及在过继细胞疗法之前1至14天，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。ccr2+hsc的重复输注可以同随后的act循环或肿瘤特异性疫苗接种一起施用，通常在1至6个月间隔，例如1、2、3、4、5或6个月间隔。

实施例

实施例1.骨髓衍生单核细胞群是高度异质的，并且基于各种骨髓标志物的差异表达来定义不同的亚群。

趋化因子受体ccr2在单核细胞前体细胞上表达，并且是进入cns所必需的，通常是对ccl2的趋化反应，ccl2由kr158b神经胶质瘤表达(clarkson等人，2015；sagar等人，2012；flores等人，2015)。在该研究中，观察到hsc的亚群表达ccr2(ccr2⁺hsc)在3小时内迁移至颅内肿瘤(数据未显示)。为了分离ccr2⁺hsc，使用磁珠分离试剂盒(miltenyibiotec，ca)从非荷瘤小鼠收集骨髓并耗尽谱系。然后使用生物素化的抗ccr2抗体随后用抗生物素珠缀合的抗体，通过第二磁珠消耗，进一步富集所得的谱系阴性hsc。

实施例2.确定在肿瘤中发现的hsc衍生细胞是否从颅内肿瘤渗出到肿瘤引流淋巴结并随后将肿瘤抗原呈递给外周t细胞。

从非荷瘤小鼠的骨髓中分离hsc，所述非荷瘤小鼠在β肌动蛋白启动子上表达dsred报告基因。将dsred⁺hsc进一步分为ccr2⁺hsc或ccr2^-hsc。将dsred⁺hsc、dsred⁺ccr2-hsc或dsred⁺ccr2⁺hsc直接注射到体内建立的颅内kr158b肿瘤中。一周后，收集肿瘤引流颈淋巴结，并分析dsred⁺hsc衍生细胞的存在。接受ccr2⁺hsc的组在淋巴结中具有显著更多的ccr2⁺hsc衍生细胞(相对于未分类的hsc组，p＝0.021)，证明ccr2+hsc产生优先迁移至淋巴结的细胞。为了确定从肿瘤渗到淋巴结的ccr2⁺hsc衍生细胞是否具有交叉引发(prime)宿主外周t细胞的能力，使用基于磁珠的pant细胞耗尽试剂盒(miltenyibiotec，ca)处理相同的淋巴结以分离全身t细胞。然后通过在体外将它们与肿瘤细胞靶标共培养来测试这些t细胞的抗肿瘤功能(图1a-1b)。令人惊讶的是，根据ifnγ分泌，我们发现在接受ccr2⁺hsc分泌的ifnγ的小鼠中，从其肿瘤引流淋巴结中分离的t细胞响应肿瘤靶标，而接受ccr2^-hsc或未分类hsc的那些t细胞显示出较差的t细胞激活。

实施例3.hsc和act一起施用的效果。

本发明人先前证明hsc与过继细胞疗法的共转移介导肿瘤特异性t细胞的肿瘤内迁移和植入，以及抑制kr158b神经胶质瘤中的早期肿瘤生长(flores等人，2015)。因此，他们评估了使用ccr2⁺hsc是否也增强过继细胞疗法(act)的功效。该act平台使用肿瘤总rna冲击的骨髓衍生树突细胞来离体扩增肿瘤特异性t细胞(ttrna-t细胞)¹³。该研究表明，相对于单独的act，hsc和act一起施用显著增加肿瘤微环境和肿瘤引流淋巴结中的ttrna-t细胞激活和ifnγ的分泌(图2)。

实施例4.肿瘤微环境中ccr2⁺hsc对ttrna-t细胞激活的影响。

为了确定ccr2⁺hsc对肿瘤微环境中ttrna-t细胞激活的影响，已建立颅内肿瘤的小鼠接受了great小鼠产生的ttrna-t细胞的过继转移，允许原位检测这些ttrna-t细胞的ifnγ分泌。然后小鼠静脉内施用ccr2⁺hsc或ccr2^-hsc。一周后，切除肿瘤并确定组间肿瘤内相对量的yfp⁺cd3⁺细胞。相较于接受ccr2^-hsc的小鼠，接受ccr2⁺hsc的那些显著表达更多yfp⁺cd3⁺细胞(图3a)。

实施例5.ccr2⁺hsc的迁移和分化。

为了确定ccr2⁺hsc是否迁移至颅内肿瘤，从表达dsred的小鼠中分离ccr2⁺hsc，而从泛素启动子上带有gfp报告基因的小鼠中分离ccr2^-hsc。将两种hsc群体以等量(5×10⁵个细胞)一起静脉内注射到荷瘤小鼠中，所述小鼠用5戈瑞的全身放射(5gytbi)接受宿主处理。二十四小时后，切除肿瘤并确定dsred⁺ccr2⁺hsc相对于gfp⁺ccr2^-hsc的相对量(图3b)。在24小时内，颅内肿瘤中累积的dsred⁺ccr2⁺hsc显著增加。有趣的是，一周后肿瘤内dsred⁺ccr2⁺hsc衍生细胞丧失了ccr2表达，但上调了与抗原呈递细胞相关的标志物cd11c、cd80、cd86和mhcii(图3c)。为了确定ccr2⁺hsc是否具有分化成抗原呈递细胞的潜力，从小鼠骨髓中分离出ccr2⁺hsc和ccr2^-hsc，并且使用先前建立的用于树突细胞生成的方案在体外培养两个群体(flores等人，2015)。然后对细胞进行表型分析，并测试抗原呈递能力。由ccr2⁺hsc产生的细胞上调cd11c、cd80、cd86和mhc-ii，同时具有激活抗原特异性t细胞的能力，表明它们呈递同源抗原的能力(图4)。

实施例6.由hsc衍生细胞呈递肿瘤抗原。

为了确定hsc衍生细胞是否可以在体内肿瘤微环境中向ttrna-t细胞呈递肿瘤抗原，荷瘤小鼠接受act，然后静脉内施用gfp⁺hsc。act后三周，切除肿瘤并使用facs分离gfp⁺hsc衍生细胞。然后在功能测定中将这些与ttrna-t细胞共培养。通过elisa检测的ifnγ分泌表明ttrna-t细胞识别同源抗原(图5a)。接下来我们继续确定hsc衍生细胞是否激活cd8或cd4t细胞。使用由great小鼠产生的ttrna-t细胞，使荷瘤小鼠接受act。然后从mhc-i或mhc-ii敲除小鼠中分离hsc并与act共同施用。三周后，收获颅内肿瘤并分析yfp⁺cd3⁺细胞的相对表达(图5b)。在接受mhc-1^-/-hsc的小鼠中检测到t细胞激活的显著降低，这意味着肿瘤微环境内hsc衍生细胞将肿瘤抗原呈递给cd8⁺ttrna-t细胞。

当在这些免疫疗法实验中施用hsc时，从非荷瘤小鼠中新鲜分离hsc。因此，我们询问肿瘤中hsc衍生细胞如何获得肿瘤抗原。为了确定放射是否在肿瘤内hsc衍生细胞摄取肿瘤抗原中起作用，act和gfp⁺hsc施用至携带晚期肿瘤的小鼠，其接受5gytbi或不接受放射。转移后三周，切除肿瘤并用facs分离gfp⁺hsc衍生细胞。然后将分离的gfp⁺hsc衍生细胞与ttrna-t细胞在体外共培养，以测试它们在交叉引发能力方面的可检测差异(图5c)。相较于未放射的肿瘤，当ttrna-t细胞与经放射的肿瘤所分离的hsc衍生细胞共培养时，检测到显著更多的ifnγ。

实施例7.ttrna-t细胞植入接受ccr2⁺hsc衍生细胞的受试者中。

我们组之前公开了，肿瘤rna冲击的树突细胞疫苗负责外周过继移植的ttrna-t细胞的植入和扩增(flores等人，2015)。鉴于此和上述数据，我们进行了实验以确定ccr2⁺hpc衍生细胞是否可以作为专职抗原呈递细胞(如树突细胞)在疫苗引流淋巴结中加强ttrna-t细胞植入和激活。具有确定肿瘤的小鼠组接受act和gfp⁺hsc、gfp⁺ccr2⁺hsc或gfp⁺ccr2^-hsc(图6a)。过继转移后三周，收获来自所有肿瘤的gfp⁺细胞并使用facs分离。然后将这些用作另一组接受act的荷瘤小鼠中的“疫苗”。在这些小鼠组中，使用dsred⁺ttrna-t细胞进行act，然后分别用无疫苗、树突细胞疫苗、源自肿瘤的gfp⁺hsc、gfp⁺ccr2⁺hsc衍生细胞或gfp⁺ccr2^-hsc衍生细胞进行接种。一周后，收获疫苗引流淋巴结并分析dsred⁺cd3⁺细胞以确定ttrna-t细胞的植入(图6b)。接受从肿瘤中分离的ccr2⁺hsc衍生细胞的小鼠证明了疫苗淋巴结中dsred⁺cd3⁺ttrna-t细胞的植入。

实施例8.ccr2⁺hsc对act疗效的免疫增强作用。

之前发现act的功效取决于清髓宿主的处理(flores等人，2015)。正如我们已经证明ccr2⁺hsc可以增强外周和颅内肿瘤的抗肿瘤免疫力，我们试图确定是否使用ccr2⁺hpc细胞代替我们以前使用的hsc将提供我们先前观察到的功效。在act中使用ccr2⁺hsc细胞之前，我们首先确定ccr2⁺hsc细胞是否是真正的造血干细胞，具有拯救骨髓免于清髓宿主处理的能力。初始小鼠使用9gytbi接受清髓术(ma)。各组接受仅ma、ma⁺hsc细胞、ma⁺ccr2⁺hsc细胞或ma⁺ccr2^-hsc细胞。ccr2⁺hpc细胞未能挽救清髓的宿主免于骨髓衰竭(图7a)。因此，为了确定ccr2⁺hsc的免疫增强作用是否影响act的功效，使用非清髓性(nma)5gytbi宿主处理。颅内携带kr158b肿瘤的小鼠组接受非清髓性5gytbi，然后进行act并共转移hsc、ccr2⁺hsc或ccr2^-hsc(图7b)。相比单独使用大量hsc，ccr2⁺hsc与过继细胞疗法的使用提供了显著的存活益处(p＝0.0005)。我们证明这种ccr2⁺lin-骨髓衍生细胞群体与过继性t细胞策略相结合介导增加的t细胞激活。

实施例9.ccr+造血干细胞在过继细胞疗法中介导t细胞激活

ccr2⁺hsc与过继细胞疗法的共转移导致多种脑肿瘤模型中存活益处的显著增加。我们发现静脉内施用ccr2⁺hsc优先迁移至cns肿瘤微环境，在肿瘤部位分化为cd11c⁺抗原呈递细胞(apc)，并在免疫抑制性肿瘤微环境内重编程基因表达。另外，衍生自ccr2⁺hsc的apc独特地将肿瘤衍生抗原交叉呈递给cd8⁺和cd4⁺肿瘤反应性淋巴细胞，导致瘤内t细胞激活延长和肿瘤排斥增强。

我们已经证明在肿瘤内衍生自ccr2⁺hsc的细胞可以分化成抗原呈递细胞。我们假设这些存在于颅内肿瘤中的抗原呈递细胞是否具有将肿瘤抗原呈递给引流淋巴结中的t细胞的能力。首先，为了确定在肿瘤中发现的hsc衍生细胞是否从颅内肿瘤渗出到引流淋巴结，dsred⁺hsc、dsred⁺ccr2^-hsc或dsred⁺ccr2⁺hsc在体内直接注射到已建立的颅内kr158b肿瘤中。一周后，收集引流的颈部淋巴结并分析dsred⁺细胞的存在。接受ccr2⁺hsc的组在淋巴结中具有显著更多的dsred⁺细胞(与未分类的hsc组相比p＝0.021，相对于ccr2^-hsc，p＝0.0480)(图8)。通过在体外将来自这些引流淋巴结的t细胞与靶肿瘤细胞共培养，来测试它们的抗肿瘤功能(图1a/1b)。接受颅内注射ccr2⁺hsc的小鼠表现出外周t细胞响应肿瘤抗原时ifn-γ分泌的增加，表明这些t细胞是针对肿瘤抗原引发的，可能由ccr2⁺hsc衍生细胞所引发，其在肿瘤中分化为抗原呈递细胞并渗出到引流淋巴结中。

除了检查点阻断之外，过继细胞疗法显然还对实体肿瘤有影响(rosenbergsa.raisingthebar:thecurativepotentialofhumancancerimmunotherapy.sciencetranslationalmedicine.2012；4(127):127ps8；rosenbergsa.celltransferimmunotherapyformetastaticsolidcancer--whatcliniciansneedtoknow.natrevclinoncol.2011；8(10):577-85)。在鼠和人体系统中的研究已经证明，在淋巴耗尽的宿主处理后接着进行hsc转移后，过继细胞疗法的功效得到增强(wrzesinskic,pauloscm,gattinonil,palmerdc,kaisera,yuz,rosenbergsa和restifonp.hematopoieticstemcellspromotetheexpansionandfunctionofadoptivelytransferredantitumorcd8tcells.jclininvest.2007；117(2):492-501)。我们以前证明lin-hsc与过继细胞疗法的共转移介导肿瘤特异性t细胞的迁移和植入，以及抑制kr158b神经胶质瘤的肿瘤生长(floresc,phamc,snyderd,yangs,sanchez-perezl,sayoure,cuix,kemenyh,friedmanh,bignerdd等人，novelroleofhematopoieticstemcellsinimmunologicrejectionofmalignantgliomas.oncoimmunology.2015；4(3):e994374)。我们评估了ccr2⁺hsc是否是负责增强过继细胞疗法(act)的大量hsc群体的活性成分。act使用通过总肿瘤rna冲击的骨髓衍生树突细胞(dc)离体扩增肿瘤特异性t细胞(flores,c.等人，novelroleofhematopoieticstemcellsinimmunologicrejectionofmalignantgliomas.oncoimmunology4,e994374,doi:10.4161/2162402x.2014.994374(2015))。我们发现，相对于单独的act，hsc和act一起施用显著增加肿瘤微环境内和引流淋巴结中的肿瘤特异性t细胞激活和ifn-γ分泌(p＝0.011)(图10a、10b和图2)。

为了确定ccr2+hsc对肿瘤微环境中t细胞激活的影响，已建立肿瘤的小鼠接受great小鼠产生的肿瘤特异性t细胞的过继转移，允许原位检测这些t细胞的ifn-γ分泌。小鼠接受静脉内ccr2+hsc或ccr2-hsc。切除肿瘤并确定肿瘤内yfp+cd3+细胞的相对表达。对比ccr2-hsc，接受ccr2+hsc的那些，表达显著更多的yfp+cd3+细胞(19.2％对比6.3％，p＝0.0002)(图3a)。源自lin-hsc的其它祖细胞亚群(sca-1+、c-kit+、cd133+、cd38+、bmpr2+)，评估其对激活肿瘤反应性淋巴细胞的能力，并且在增强抗肿瘤免疫方面ccr2+hsc显著优越(图11)。

为了确定这些hsc亚群是否迁移至颅内肿瘤，将dsred+ccr2+hsc和gfp+ccr2-hsc以等量(5×10⁵个细胞)静脉内注射到淋巴耗尽的荷瘤小鼠中。二十四小时后，在肿瘤中测量dsred+ccr2+hsc与gfp+ccr2-hsc的相对量。在24小时内，颅内肿瘤中累积的dsred+ccr2+hsc显著增加(p＝0.0010)。如先前所证明的，在一周后，dsred+ccr2+hsc衍生细胞丧失ccr2表达，但上调与apc、cd11c、cd80、cd86和mhc-ii相关的标志物(图3c和图8)。分离ccr2+hsc和ccr2-hsc并在树突细胞生成条件下体外培养(12)以检查分化成抗原呈递细胞。来自ccr2+hsc的抗原呈递细胞具有不同的树突细胞表型，而源自ccr2-hsc的细胞上调单核细胞抑制细胞标志物ly6g(gr1-1)的表达(图4)。此外，衍生自ccr2+hsc的细胞在体外呈递肿瘤抗原方面明显优于由ccr2-hsc产生的细胞(图4)。

为了确定hsc衍生细胞是否在肿瘤微环境中捕获和呈递肿瘤抗原，小鼠接受来自同基因gfp转基因小鼠的hsc。在过继细胞疗法后三周，使用facs从肿瘤中分离gfp+hsc衍生细胞。然后将它们与抗肿瘤ttrna-t细胞共培养并证明肿瘤衍生抗原的特异性呈递(图5a)。为了确定hsc衍生细胞是否具有将抗原呈递给cd4或cd8肿瘤特异性t细胞的能力，再次用facs分离hsc衍生细胞，并且在针对效应肿瘤特异性t细胞培养之前，使用阻断抗体阻断mhc-i或mhc-ii(图12)。阻断mhc-i后观察到ifnγ分泌显著降低。为了证实hsc衍生细胞具有将抗原呈递给t细胞的能力，然后从mhc-i或mhc-ii敲除小鼠中分离hsc并与act共同施用。三周后，收获肿瘤并分析yfp+cd3+细胞的表达(图5b)。在接受mhc-i-/-hsc与野生型hsc的小鼠中检测到t细胞激活显著降低(p＝0.0002)，表明对于cns肿瘤微环境中的体内t细胞激活，hsc衍生细胞在i类途径中交叉呈递肿瘤抗原是至关重要的。

为了进一步证明衍生自ccr2+hsc的抗原呈递细胞的独特交叉引发能力，我们从接受过继细胞疗法的小鼠的肿瘤中直接分离抗原呈递细胞，并将其用作接受dsred+肿瘤特异性t细胞的受体小鼠中的细胞疫苗。荷瘤小鼠接受过继细胞疗法和gfp+hsc、gfp+ccr2+hsc或gfp+ccr2-hsc(图6a)。在过继细胞疗法后三周，收获来自所有肿瘤的gfp+细胞并使用facs分离。然后将这些用作另一组接受过继细胞疗法的荷瘤小鼠中的“疫苗”。该组群分别接受：无疫苗、dc疫苗(ttrnadc)或自衍生自gfp+hsc、gfp+ccr2+hsc衍生细胞或gfp+ccr2-hsc衍生细胞的肿瘤微环境分离的抗原呈递细胞。收获疫苗位点引流淋巴结并分析dsred+cd3+t细胞的扩增，并证明ccr2+hsc导致体内肿瘤反应性t细胞的扩增(图6b)。总之，这些实验证明ccr2+hsc独特地产生apc，其在体内捕获肿瘤抗原，以及体外和体内将肿瘤抗原交叉呈递至cd8+t细胞。

为了确定lin-ccr2+hsc是否为真正的提供拯救而免于骨髓衰竭的造血干细胞，ccr2+hsc或ccr2-hsc静脉内施用于清髓的宿主(9gytbi)。lin-ccr2+hsc在拯救宿主免于致死放射方面效率较低，表明是祖细胞群体(图7a)。为了确定ccr2+hsc是否在靶向脑肿瘤的过继细胞疗法中负责增强干细胞转移的功效，纯化的ccr2+hsc对比ccr2-hsc与过继细胞疗法一起转移到接受非清髓处理的小鼠中(5gytbi)。ccr2+hsc在增强过继细胞疗法对神经胶质瘤和成神经管细胞瘤的功效方面显著优越(p＝0.0005)(图14)，并且提供了对脑干神经胶质瘤的相同存活益处(图13)。这些发现首次鉴定骨髓衍生祖细胞群，其具有改变肿瘤微环境和增强响应免疫检查点阻断和过继细胞疗法的能力。这些发现改变了我们对干细胞移植在治疗实体恶性肿瘤中的作用的理解，并且对解决癌症免疫疗法抗性具有相关性。

材料和方法：

小鼠.

使用雌性6至8周龄的c57bl/6小鼠(jacksonlaboratories，株系#000664)、转基因dsred小鼠(jacksonlaboratories，株系#006051)和转基因great小鼠(jacksonlaboratories，株系#017580)进行实验。研究人员遵守国家研究委员会生命科学实验动物资源护理委员会(laboratoryanimalresourcescommissiononlifesciences,nationalresearchcouncil)提出的“实验动物护理和使用指南”(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)。佛罗里达大学动物护理服务中心(universityoffloridaanimalcareservices)的设施完全获得美国实验动物管理认证协会的认可，所有研究均获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会(universityoffloridainstitutionalanimalcareandusecommittee)的批准。

rna分离。根据制造商的方案，用rneasymini试剂盒(qiagen，cat#74104)进行肿瘤细胞系的总肿瘤rna分离。

肿瘤特异性t细胞。如前所述产生肿瘤反应性ttrna-t细胞(flores等人，2015)。简而言之，从c57bl/6小鼠收获骨髓衍生树突细胞，并在gm-csf(18ng/ml，r&d，cat#415-ml/cf)和il-4(18ng/ml，r&d，cat#404-ml/cf)中培养9天。然后用从肿瘤组织分离的25ug总rna电穿孔树突细胞。用2.5×10⁵个总肿瘤rna冲击的树突细胞引发初始小鼠。一周后，收获脾细胞并使用总肿瘤rna冲击的树突细胞和il-2(50u/ml，r&d，目标#402-ml/cf)离体共培养5天。静脉内施用107个t细胞用于过继细胞疗法。

肿瘤模型。在同基因的性别匹配的c57bl/6小鼠中进行携带肿瘤的实验。kr158b(9)神经胶质瘤系(由国家癌症研究所(nationalcancerinstitute)的karlynem.reilly博士提供)经组织学验证为高级别神经胶质瘤，通过rnaseq进行基因表达分析，证明适当的单倍型背景和星形细胞瘤-相关基因的表达。通过向距离中线2mm深3mm处注射，将104个kr158b细胞植入尾状核(reillykm,loiselda,bronsonrt,mclaughlinme和jackst.nf1；trp53mutantmicedevelopglioblastomawithevidenceofstrain-specificeffects.natgenet.2000；26(1):109-13.；flores等人，2015)。ptc肿瘤细胞直接来自发展为自发性肿瘤的ptc+/-转基因小鼠。肿瘤在野生型c57bl/6小鼠体内连续传代，并通过基因表达分析验证与ptc+/-鼠成神经管细胞瘤的一致性(phamcd,floresc,yangc,pinheiroem,yearleyjh,sayourej,peiy,moorec,mclendonre,huangj等人，differentialimmunemicroenvironmentsandresponsetoimmunecheckpointblockadeamongmolecularsubtypesofmurinemedulloblastoma.clincancerres.2016；22(3):582-95)。对于使用ptc成神经管细胞瘤的实验，将1.25x10⁵个ptc细胞植入距离中线1mm深3mm的小脑中(pham等人，2016；goodrichlv,milenkovicl,higginskm和scottmp.alteredneuralcellfatesandmedulloblastomainmousepatchedmutants.science.1997；277(5329):1109-13)。对于使用脑干神经胶质瘤细胞(由orenbecher博士提供)的实验，将10⁵个细胞立体定向植入中线幕下(infratentorial)1mm深3.5mm的小鼠脑干中。

过继细胞疗法。在肿瘤注射后第5天，用x射线放射(x-rad320，precisionx射线)开始用5gy淋巴耗尽或9gy清髓术处理荷瘤小鼠。在颅内肿瘤注射后第6天，小鼠接受单次静脉注射107个自体离体扩增的ttrnat细胞(其中5x104谱系耗尽(lin-)造血干细胞和祖细胞(hsc))(miltenyibiotec，cat#130-090-858)、ccr2+lin-hsc或ccr2-lin-hsc。使用生物素化的抗小鼠ccr2抗体进行ccr2阳性选择，然后进行抗生物素微珠分离。在肿瘤注射后第7天开始，每周在耳廓后皮内注射2.5×10⁵个肿瘤rna冲击的树突细胞疫苗，共接种三个疫苗剂量。

小鼠淋巴结。从处理的小鼠的颈部区域双侧解剖淋巴结。将淋巴结机械解离，并用2％胶原酶(fisherscientific，cat#10103578001)化学消化30分钟。

脑肿瘤消化。肿瘤切除扩展到注射部位附近肿瘤块的总边界。用灭菌的剃刀刀片机械解离肿瘤，并用木瓜蛋白酶(worthington，cat#nc9809987)化学解离30分钟，然后在抗体孵育前用70μm细胞滤网过滤。

流式细胞术和抗体。在facscanto-ii上进行流式细胞术，在facsariaii上进行facs分选。如上所述离体制备细胞，并悬浮于pbs(gibco，cat#10010-049)中的2％fbs(seradigm，cat#97068-091)中。使用同种型对照，根据制造商的推荐应用以下抗体。抗cd3(bd，cat#553066)、抗cd11c(affymetrix，cat#17-0114-82)、抗cd80(affymetrix，cat#17-0801-82)、抗cd86(affymetrix，cat#17-0862-82)、抗-ly-6g/6c(bdbiosciences，cat#553129)和抗-mhcii-ia-e(affymetrix，cat#17-5321-82)。抗小鼠mhcii类(i-a/i-e)阻断抗体(affymetrix，cat#16-5321-85)和抗小鼠mhci类(h-2k)阻断抗体(affymetrix，cat#16-5957-85)。

t细胞功能测定。体外实验利用ifn-γ释放作为t细胞活性的量度，其中效应细胞和靶标以10：1的比例在96孔u-底板中共培养，一式三份。在共培养1天后，从96孔共培养板上清液收获的冷冻无细胞培养基上进行ifn-γplatinumelisa(affymetrix，cat#bms606)。

抗pd-1阻断抗体。在t细胞施用当天，开始施用抗pd-1阻断抗体(merck，mdx-400)，并且每5天持续施用总计4个剂量的10mg/kg(8)。

pcr阵列。对从治疗小鼠切除的肿瘤进行pcr分析。根据制造商的规程，如上所述解离肿瘤并分离rna，并用rt2profilerarraycancerinflammationandimmunitycrosstalk(qiagen，cat#pamm-181zd-12)或t细胞和b细胞激活(qiagen，cat#pamm-053zd-2)进行分析。

统计分析。统计由uf神经外科的生物统计学家paulkubilisms进行了评估。在prism7中分析所有实验，并如图例中所述应用测试。在该方案中描述的实验中，对于荷瘤动物，小鼠的中值存活时间为25-42天。因为我们感兴趣的是我们的实验组之间的存活和/或肿瘤大小的显著差异(增加4.5倍或更多)，每组少至7只动物足以检测给定疗法的统计学显著结果。主要感兴趣的是存活与对照组的配对比较。考虑到测试或比较的多样性，将使用0.0125的显著性水平(即bonferroni校正为0.05/4)。每个臂中有10只动物，每配对比较将具有80％的功效(power)，相对于对照臂中预期的25天中值而言，以检测实验臂中中值存活增加4.5倍。由于在我们的实验小鼠中证实的治疗效果的变化，在某些实验中需要使用10只动物(相对于7)进行充分的统计分析。由于这种统计验证，本方案中概述的所有存活结果实验使用7-10个动物的组。使用对数秩检验来比较kaplan-meier存活曲线。未配对的mann-whitney秩和检验用于体内实验的两组比较。未配对的学生t检验用于体外实验的两组比较。数据具有正态分布，并且在统计学比较的组之间方差相似。显著性确定为p<0.05。对于分析组织的生物学终点的动物研究，每组n＝5只小鼠，并且没有统计学方法用于确定样本量的大小。作者预先确定没有动物或样品被排除在分析之外。对于动物实验的随机化，按照每笼5只小鼠将小鼠圈养。在肿瘤植入后，立即将小鼠随机分到笼中。

参考文献

rosenbergsa.raisingthebar:thecurativepotentialofhumancancerimmunotherapy.sciencetranslationalmedicine.2012；4(127):127ps8.

rosenbergsa.celltransferimmunotherapyformetastaticsolidcancer--whatcliniciansneedtoknow.natrevclinoncol.2011；8(10):577-85.

clarkson,b.detal.ccr2-dependentdendriticcellaccumulationinthecentralnervoussystemduringearlyeffectorexperimentalautoimmuneencephalomyelitisisessentialforeffectortcellrestimulationinsituanddiseaseprogression.jimmunol194,531-541,doi:10.4049/jimmunol.1401320(2015).

sagar,detal.dendriticcellcnsrecruitmentcorrelateswithdiseaseseverityineaeviaccl2chemotaxisattheblood-brainbarrierthroughparacellulartransmigrationanderkactivation.jneuroinflammation9,245,doi:10.1186/1742-2094-9-245(2012).

flores,cetal.novelroleofhematopoieticstemcellsinimmunologicrejectionofmalignantgliomas.oncoimmunology4,e994374,doi:10.4161/2162402x.2014.994374(2015).

reillykm,loiselda,bronsonrt,mclaughlinmeandjackst.nf1；trp53mutantmicedevelopglioblastomawithevidenceofstrain-specificeffects.natgenet.2000；26(1):109-13.

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goodrichlv,milenkovicl,higginskmandscottmp.alteredneuralcellfatesandmedulloblastomainmousepatchedmutants.science.1997；277(5329):1109-13。

其它实施方案

本说明书中公开的所有特征可以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以取代为相同、等同或类似目的的替代特征。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用系列等同或类似特征的示例。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求内。

等同物

虽然本文已经描述和说明了若干发明实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且，这些变化和/或修改中的每一个被认为是在本文描述的发明实施例方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定应用或本发明教导使用的应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文所述的具体发明实施方案的许多等同物。因此，应该理解，前述实施方案仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明的实施方案能够以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本公开的发明实施方案涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法。此外，如果这些特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。

如本文定义和使用的所有定义，应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义、和/或定义术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用并入本文，各自所引用的主题，其在某些情况下可涵盖整个文件。

除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。

本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示由此结合的元素中的“一个或两个”，即在某些情况下元素共同存在，并且在其它情况下分开存在。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即，由此结合的“一个或多个”元素。除了“和/或”从句所具体标识的元素之外，可任选存在其它元素，而无论是与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施方案中可以仅指a(可任选包括除b之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指b(可任选包括包括除a之外的元素)；在又一个实施方案中，a和b两者(可任选包括其它元素)；等。

如本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含至少一个，但也包含多于一定数量的或列表的元素，以及可选其它未列出的项目。只有明确相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在权利要求中使用时，“由...组成”将指的是恰好包含一定数量的元素或元素列表。一般而言，在排他性术语之前，例如“任一”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”，本文所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，但不是两个”)。“基本上由......组成”用于权利要求时，应具有其在专利法领域中使用的普通含义。

如本说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元素的列表，短语“至少一个”应理解为表示从元素列表中任何一个或多个元素中选择的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个元素，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许任选地存在短语“至少一个”所指元素列表内所具体标识的元素之外的元素，无论是与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，“a和b中的至少一个”(或等同地“a或b中的至少一个”、或等同地“a和/或b中至少一个”)可以指代至少一个，任选地包括多于一个，a但不存在b(并且任选地包括除b之外的元素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个，b但不存在a(并且任选地包括除a之外的元素)；在又一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个，a，以及至少一个，任选地包括多于一个，b(和任选地包括其它元素)；等。

还应理解，除非明确相反地指出，否则本文要求保护的任何方法包括多于一个步骤或动作，方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述方法的步骤或动作的顺序。

在权利要求以及上述说明书中，所有过渡短语，例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由...组成”等应理解为开放式的，即包括但不限于。只有过渡短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述。应当理解，在替代的实施方案中，使用开放式过渡短语(例如，“包括”)的本文所述实施方案，还考虑被视为“由开放式过渡性短语所描述的特征组成”和“基本上由开放式过渡性短语所描述的特征组成”。例如，如果本公开描述“包含a和b的组合物”，则本公开还涵盖替代实施方案“由a和b组成的组合物”和“基本上由a和b组成的组合物”。