甘油酯形式的n-3脂肪酸的酶促富集的制作方法

公开了包含甘油酯的物质组合物，该甘油酯富含n-3脂肪酸结构部分、特别是epa和dha。还公开了用于制备所公开的物质组合物的酶促方法，其可以是用于生产富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的一锅法或多步骤多酶促催化反应。现有技术以下提及的参考文献被认为作为
背景技术：
：与本发明所公开主题相关。还参考以上所列出版物中提及的出版物的全部。认可本文中以上参考文献不应推断为表示其以任何方式与本发明所公开主题的可专利性相关。发明背景概要多不饱和脂肪酸(pufa)代表一族含有两个或更多个双键的长链脂肪酸。pufa细分为两个主要的组；n-3(ω-3或omega-3)脂肪酸和n-6(ω-3或omega-6)脂肪酸。n-3脂肪酸组包括必需脂肪酸α-亚麻酸(ala，18:3n-3)及其长链代谢物，即epa(二十碳五烯酸)、dha(二十二碳六烯酸)和dpa(二十二碳五烯酸)，而n-6脂肪酸组尤其包括花生四烯酸(ara)和亚油酸。ω-3脂肪酸存在于整个动物和植物界。微生物、特别是藻类、真菌和细菌被认为是最富含这类脂肪酸的物质。这些脂肪酸典型地以酯、磷脂、醚、糖脂、鞘脂和脂蛋白的脂肪酰基形式存在于储存油甘油三酯以及膜脂中。将pufa结构部分引入甘油三酯中是储存这些脂肪酸的最有利形式，因为游离脂肪酸和短脂肪酸烷基酯如脂肪酸乙酯更容易氧化和降解。同样，将脂肪酸结构部分引入甘油三酯中是有利的，因为其容易水解成其游离形式，其当用在食品、营养品和药物中时容易在消化系统中吸收[christensen，m.s.等，am.j.clin.nutr.1995，61:56]。n-3脂肪酸的富集和分离方法已经分别或组合地应用不同方法来从天然存在的源中浓缩、分离和回收n-3脂肪酸及其衍生物(甲基或乙基酯、甘油三酯和酰胺)。这些方法主要包括低温下分步结晶、分子蒸馏、尿素络合物结晶、固定床色谱法以及使用脂肪酶。这些富集方法通常利用脂肪酸的不饱和度以及碳链长度，二者都导致在不同溶剂中的溶解度、结晶、熔点和蒸发点、极性和化学反应性方面表现出不同的物理和化学特性。通过脂肪酶催化的反应来富集n-3脂肪酸脂肪酶被定义为水解酶，其作用于水性体系中三酰甘油分子中的酯键以得到游离脂肪酸、偏甘油酯和甘油。在微水性有机体系中，该族的酶能够催化逆水解反应[medina，a.r.等，j.biotechnology，1999，70：379；shimada，y.等，j.biosci.bioeng.，2001，91(6)：529]。通常，脂肪酶根据其区域特异性分为两类，即随机脂肪酶和1,3-位特异性脂肪酶。在许多情况中，脂肪酶显露出与脂肪酸的饱和度、脂肪酰基基团的链长、脂肪酸碳链上双键的位置以及碳链上双键的几何形状(顺式/反式)相关的不同底物活性。脂肪酶催化的含pufa油的水解某些脂肪酶表达出对甘油三酯底物的脂肪酸残基类型的选择性。例如衍生自皱褶假丝酵母(candidarugosa)和柱状假丝酵母(candidacylindracea)的脂肪酶是已知的对甘油三酯中饱和以及单不饱和脂肪酸残基具有高选择性的酶。在这样的方法中，在达到一定的油水解度之后，使有机层和水性层分离。其后，有机相中的游离脂肪酸通过分子蒸馏除去，产生了甘油酯形式的n-3脂肪酸的浓缩物[美国专利申请2004/0033571a1]。据报道借助于衍生自柱状假丝酵母的脂肪酶水解金枪鱼油产生了含有44.1％n-3脂肪酸(18.5％epa、17.3％dha和3.62％dpa)的甘油酯混合物。为了获得更高含量的n-3脂肪酸如最高70％的n-3脂肪酸，可以对第一级中获得的浓缩物应用利用脂肪酶的第二级水解。还报道了多级水解可以降低n-3脂肪酸的回收率。脂肪酶催化的游离脂肪酸的选择性酯化在各种游离脂肪酸的混合物与醇的酯化反应中，已经确认一些脂肪酶对于脂肪酸的类型具有不同的特异性。这样的过程以两级进行，或是化学地(例如用苛性钠)或是用随机和非选择性脂肪酶水解所述油以获得游离脂肪酸，并且用短链醇使用偏好于某些类型的脂肪酸的脂肪酶选择性酯化第一级中获得的游离脂肪酸[shimada，y.等，(2001)ibid.；美国专利号6159523]。这种类型的两级酶促过程已经用于富集n-3脂肪酸以及富集单个脂肪酸。例如通过化学或酶水解所获得的含有epa(14％)和dha(15％)的游离脂肪酸水解物用乙醇直接酯化，以得到epa和dha乙基酯。该反应典型地由对饱和的、单不饱和以及双不饱和脂肪酸具有高选择性和对epa具有一定程度的选择性的脂肪酶如米黑毛霉(mucormiehei)脂肪酶(mml)来催化。反应可以例如当游离脂肪酸到脂肪酸乙酯的转化率达到约70％时停止，并且未酯化的脂肪酸通常含有更高浓度的dha。依照这种方法，获得了n-3脂肪酸浓缩物，其含有49％的dha和6％的epa，回收率分别是73％和10％[watanabe，y.等，j.bioscienceandbioengineering。1999，88(6)：622；us2006/0148047a1]。脂肪酶催化的含pufa油的醇解某些脂肪酶在有机介质中具有醇解活性。在这种类型的反应中，甘油三酯与乙醇或其他短链醇或脂肪酸酯与中链脂肪醇(如正己醇)直接反应。潜在地用于这类反应的脂肪酶是对某些类型的脂肪酸或脂肪酰基具有选择性的那些[watanabe等ibid.；us2005/0233427，us2006/0148047；shimada等ibid.]。两种方案通常用于通过醇解反应来富集n-3脂肪酸：a.两级醇解反应，其中在第一级中，用碱性催化剂或用非特异性脂肪酶进行鱼油甘油三酯的完全醇解以产生鱼油脂肪酸乙基酯。该反应典型地由衍生自南极假丝酵母b的脂肪酶来催化。在第二级中，使用对n-3脂肪酸具有低选择性的脂肪酶如米黑根毛霉脂肪酶使所得到的鱼油脂肪酸乙酯与长链醇如正己醇进行酯交换，以形成具有低n-3脂肪酰基含量的脂肪酸己酯和具有高n-3脂肪酰基含量的未反应的脂肪酸乙酯。该反应混合物可以用分馏处理以获得富含n-3脂肪酸乙酯的馏分。该富含n-3脂肪酸的脂肪酸乙酯馏分可以使用novozym435(固定化的南极假丝酵母脂肪酶b，novozymes，丹麦)作为催化剂在真空下并且加热直到65℃用甘油进行酯交换，以形成富含n-3脂肪酸的甘油三酯。b.使用对n-3脂肪酸酰基基团具有低选择性的脂肪酶用短链醇(如乙醇)进行鱼油的一级醇解反应，以形成富含n-3脂肪酸的甘油酯和作为酯交换反应副产物的具有低n-3脂肪酸含量的脂肪酸烷基酯。该过程通常典型地产生n-3脂肪酸为40-60％的甘油酯，且n-3脂肪酸的回收率典型地为50-70％，同时余量的n-3脂肪酸出现在副产物中。脂肪酶催化的含pufa油的酸解反应研究工作已经描述了脂肪酶催化的植物油和富含n-3脂肪酸(主要是游离脂肪酸或其乙基酯)的源的酯交换。衍生自米黑根毛霉(lipozymermim，由novozymes制造)的脂肪酶是常用于这些研究的酶。由于这种酶表现出1,3-位活性，因此在最终产物中能够实现最高66％的pufa含量[jennings，b.和akoh，c.c.，j.am.oil.chem.soc.1999，76(10)：1133]。还已经报道了含有单个n-3脂肪酸或其混合物的酶促制备的纯甘油三酯。该方法基于使用novozym(novozymes，丹麦)的含有n-3脂肪酰基的甘油或偏甘油酯与纯n-3脂肪酸或其混合物的反应。根据该方法已经制备了含有高于90％含量的n-3脂肪酸的甘油三酯的不同制剂，特别是用于药物应用[美国专利号5604119]。概述在第一方面，本公开内容提供一种用于富集作为甘油酯的n-3多不饱和脂肪酸(n-3pufa)的酶促方法，所述方法包括(a)提供n-3pufa结构部分含量是约5％至约60％w/w的油，该n-3pufa结构部分作为游离酸或作为所述油中所含的甘油酯和/或极性类脂的酰基而存在；(b)以所述油的0.2-10％w/w的量向所述油中加入水或碱性缓冲水溶液，以得到ph为约5至约9的混合物；(c)向步骤(b)中获得的混合物中加入脂肪酶，其中所述脂肪酶固定在合适的聚合物载体上，其中所述脂肪酶表现出对饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸或其脂肪酰基的高选择性，并且能够同时或连续地酯交换、水解和/或酯化所述油；(d)提供烷基醇或醇给体、特别是短链烷基醇或醇给体，和将所述醇或醇给体加入、特别是逐步加入步骤(c)中获得的所述油和所述酶制剂的混合物中，以形成包含所述油、所述脂肪酶制剂、所述水或碱性缓冲水溶液和所述醇的反应体系，其中所述油与所述醇反应，并且使得所述反应达到至少40％的所述油到脂肪酸烷基酯(faee)的转化率，低于10％的游离脂肪酸(ffa)和约15％至约60％的甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计；(e)通过从所述反应体系中除去所述反应介质来停止反应，以得到包含单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯的混合物和faee、ffa以及任选的极性类脂的产物；和(f)通过从步骤(f)中获得的产物中蒸馏出所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸来使所述甘油酯与所述faee和ffa分离，以得到包含faee和ffa的馏出物，和包含甘油酯混合物和任选的极性类脂的残留物，其中所述混合物含有比所述油更高的ω-3脂肪酸含量，且回收率高于60％。以所述油的0.2-10％w/w的量加入的所述水或碱性缓冲水溶液可以特别是以最高至所述油的0.2％、0.5％、0.75％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、6.5％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％且最高10％w/w的量加入。可以通过加入所述水或碱性缓冲水溶液来将该反应体系的ph调节到约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。在所述步骤(d)中，可以使得该反应进行直到实现至少40％、特别是至少45％、或至少50％且最高70％的所述油到脂肪酸烷基酯(faee)的转化率，低于10％、特别是2-8％的游离脂肪酸(ffa)和约15％至约60％、特别是约15％、20％、25％至约30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计。本发明所述第一方面的方法的步骤(f)中获得的包含甘油酯混合物和任选地包含极性类脂的产物含有比所述油更高的ω-3脂肪酸含量，且回收率高于60％，例如高于62％、65％、68％、70％、75％和更高。在所述第一方面的方法的具体实施方案中，从步骤(f)中的反应产物蒸馏出的该脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸的混合物包含所述油中存在的总n-3脂肪酸中低于40％、特别是低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％甚至更低的n-3脂肪酸结构部分。在本公开内容的所述第一方面的所述方法中，所述醇可以特别是乙醇或甲醇中的任何之一，和所述短烷基醇给体可以是碳酸二甲酯或碳酸二乙酯中的任何之一。在本公开内容的所述第一方面的所述方法中，所述蒸馏是分子蒸馏、短程蒸馏或薄膜蒸馏中的任何之一。在本公开内容的所述第一方面的所述方法中，所述n-3脂肪酸结构部分是dha、dpa和epa结构部分中的任何之一及其至少两种的任何混合物。在本公开内容的所述第一方面的所述方法中，所述脂肪酶衍生自以下中任何之一：南极假丝酵母a(candidaantarcticaa)(cala)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、假单胞菌属(pseudomonassp.)、雪白根霉(rhizopusniveus)、爪哇毛霉(mucorjavanicus)、米根霉(rhizopusoryzae)、南极假丝酵母b(candidaantarcticab)(calb)、黑曲霉(aspergillusniger)、卡门柏青霉(penicilliumcamembertii)、产碱杆菌属(alcaligenessp.)、伯克霍尔德菌属(burkholderiasp.)、绵毛嗜热丝胞菌(thermomyceslanuginose)或粘质色杆菌(chromobacteriumviscosum)，特别是其中所述脂肪酶衍生自南极假丝酵母a(cala)、假单胞菌属、产碱杆菌属或绵毛嗜热丝胞菌。在本公开内容的所述第一方面的所述方法中，所述脂肪酶固定在疏水性多孔聚合物树脂载体、特别是疏水性脂族或芳族树脂载体上，特定的疏水性芳族树脂是交联的二乙烯基苯(dvb)或苯乙烯或交联的苯乙烯-dvb。在本公开内容的所述第一方面的所述方法的实施方案中，步骤(f)中获得的所述甘油酯混合物可以进一步与反应混合物中(i)n-3ffa浓缩物或(ii)n-3脂肪酸短链烷基酯浓缩物中的至少之一在合适的游离形式或固定在聚合物树脂载体上的肪脂酶、特别是衍生自南极假丝酵母b(calb)的脂肪酶的存在下，在真空和30-80℃的温度下反应，以得到甘油酯混合物，并且在从反应混合物中蒸馏多余的脂肪酸乙酯和/或脂肪酸、以及副产物醇和/或水之后，大于60％、特别是大于约65％、大于约70％和最高约100％甘油三酯含有大于60％n-3脂肪酸。在本公开内容的所述第一方面的所述方法中，所述油可以是可食用油、特别是鱼油或藻类油、真菌油或合适的含有n-3脂肪酸的含油物质。在第二方面，本公开内容提供一种降低脂肪酶对某些n-3脂肪酸的选择性以便脂肪酶催化的反应(包括油源的酯交换、酯化和水解)的甘油酯产物中的n-3脂肪酸含量显著增加的方法，同时该方法减少了所述反应的副产物(当使用乙醇脂肪酸乙酯时，主要是游离脂肪酸和脂肪酸烷基酯)。根据本发明，脂肪酶选择性的改变是通过将脂肪酶固定在特定的具有疏水性和亲水性结构域二者的“混合”载体树脂上来实现的，如下所述，特别是如本发明第三方面的描述中所述。在第三方面，本公开内容提供一种将脂肪酶固定在微孔聚合物树脂上的方法，所述方法包括：(a)将所述脂肪酶溶解在合适的缓冲溶液中以得到脂肪酶溶液；(b)将适量的微孔聚合物树脂加入到所述脂肪酶溶液中以得到混合物，其中所述微孔聚合物树脂包含交替的疏水性单体和亲水性、特别是温和亲水性单体的结构域；(c)将步骤(b)中得到的混合物在混合/摇动的同时在合适的温度下保持合适的时间段，由此将所述脂肪酶固定在所述微孔聚合物树脂上；(d)过滤出所得到的固定在所述树脂上的脂肪酶，以得到固定化脂肪酶制剂；(e)任选地用合适的溶剂洗涤该固定化脂肪酶制剂；和(f)将洗涤的固定化脂肪酶制剂干燥至水低于5％w/w的水平。在所述脂肪酶固定方法中，所述树脂可以是大网络多孔聚合物，其具有交替的疏水性结构域和亲水性结构域、特别是包含疏水性脂族或芳族单体的疏水性结构域和包含丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的温和亲水性结构域，例如与甲基丙烯酸甲酯交联的二乙烯基苯。在所述脂肪酶固定方法中，所述疏水性结构域和所述温和亲水性结构域之间的重量比分别是约10:0.1至约1:10，更特别分别是10-99％至90-1％。在所述脂肪酶固定方法中，所述具有交替的疏水性结构域和亲水性结构域的大网络多孔聚合物可以是与甲基丙烯酸甲酯交联的二乙烯基苯，其中二乙烯基苯结构域与甲基丙烯酸甲酯结构域的比分别是10-99至90-1。在所述脂肪酶固定方法中，所述脂肪酶可以是如下这样的脂肪酶，其具有对作为游离脂肪酸或脂肪酰基形式的饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸的酯交换/酯化/水解的高选择性，以及对作为游离脂肪酸或作为脂肪酰基的n-3脂肪酸的酯交换/酯化/水解的低选择性。特别是，所述脂肪酶可以是衍生自以下中任何之一的脂肪酶：南极假丝酵母a(cala)、米黑根毛霉、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、南极假丝酵母b(calb)、伯克霍尔德菌属、绵毛嗜热丝胞菌或粘质色杆菌。在所述脂肪酶固定方法中，所述合适的温度可以是10-50℃，所述合适的时间可以是约0.5-48小时、特别是约6小时，所述适合于洗涤固定化脂肪酶制剂的溶剂可以是丙酮或水，和所述干燥可以在干燥器或冻干机中进行。在所述脂肪酶固定方法中，可以将所得到的固定化脂肪酶制剂干燥至水含量低于5％w/w、特别是低于2％w/w、更特别是低于1.5％w/w、具体地低于1％w/w。在所述脂肪酶固定方法中，调节所述脂肪酶在任何酯交换、酯互换(interesterification)、酯化或水解反应中对游离形式或酯化形式(如甘油酯或烷基酯)的n-3脂肪酸的选择性，特别是在保持所述脂肪酶的催化活性的同时使所述活性下降。n-3脂肪酸可以以游离形式或作为油的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯或极性类脂的脂肪酸结构部分而存在，所述油特别是可食用油、更特别是鱼油、真菌油或含有n-3脂肪酸的可食用的含油物质。通过所述固定方法制备的脂肪酶可以在经过至少10次使用同一批次的固定化酶的反应循环后保留其催化活性的至少70％。在第四方面，本公开内容提供一种固定化脂肪酶制剂，其包含固定在微孔聚合物树脂载体上的脂肪酶，其中所述大网络多孔聚合物树脂包含混合的疏水性结构域和温和亲水性结构域，其中所述疏水性结构域包含疏水性脂族或芳族单体，和所述亲水性结构域包含温和亲水性单体、特别是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯或其任意组合。在根据本公开内容的固定化脂肪酶制剂中，所述具有交替的疏水性结构域和亲水性结构域的大网络多孔聚合物可以是与甲基丙烯酸甲酯交联的二乙烯基苯，其中二乙烯基苯结构域与甲基丙烯酸甲酯结构域的比分别是10-99％至90-1％，例如但不限于10-98％至90-2％。根据本公开内容的固定化脂肪酶制剂可以表现为这样的脂肪酶，其具有对作为游离脂肪酸或脂肪酰基形式的饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸的酯交换/酯化/水解的高选择性，和对作为游离脂肪酸或作为脂肪酰基的n-3脂肪酸的酯交换/酯化/水解的低选择性。根据本公开内容的固定化脂肪酶制剂可以是衍生自以下中任何之一的脂肪酶：南极假丝酵母a(cala)、米黑根毛霉、南极假丝酵母b(calb)、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、伯克霍尔德菌属、绵毛嗜热丝胞菌或粘质色杆菌。根据本公开内容的固定化脂肪酶制剂可以在经过至少10次反应循环后保留其催化活性的至少70％。在第五方面，本公开内容提供一种制备甘油酯的混合物的方法，该甘油酯具有约30％至约80％w/w、特别是约50％-80％w/w、更特别是约50％-70％w/w、更特别是约30％、35％、40％、45％或50％至约70％、72％、75％、78％或80％的n-3多不饱和脂肪酸结构部分，所述方法包括(a)提供油，其包含n-3多不饱和脂肪酸、特别是约5％至约60％w/w的n-3多不饱和脂肪酸，所述n-3脂肪酸作为键合到所述油中的甘油酯和/或极性类脂的甘油主链上的脂肪酰基和/或作为游离脂肪酸而存在，所述油还包含游离或酯化的饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸；(b)以所述油的0.2-10％w/w的量向所述油中加入水或碱性缓冲水溶液，以得到ph为约5至约9的混合物；(c)向步骤(b)中获得的混合物中加入脂肪酶，其中将所述脂肪酶固定在聚合物树脂载体上，其中所述树脂包含交替的疏水性结构域和温和亲水性结构域，特别是包含疏水性脂族或芳族单体的疏水性结构域和包含丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的温和亲水性结构域，其中所述脂肪酶表现出对饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸或其脂肪酰基的高选择性，并且能够同时或连续地酯交换、水解和/或酯化所述油；(d)提供烷基醇或醇给体、特别是短链烷基醇或醇给体，和将所述醇或醇给体加入、特别是逐步加入步骤(c)中获得的所述油和所述酶制剂的混合物中，以形成包含所述油、所述脂肪酶制剂和所述醇的反应体系，其中所述油与所述醇反应，并且使得所述反应达到至少40％的所述油到脂肪酸烷基酯(faee)的转化率，低于10％游离脂肪酸(ffa)和约15％至约60％甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计；(e)通过从所述反应体系中除去所述反应介质来停止反应，以得到包含单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯的混合物和faee、ffa以及任选的极性类脂的产物；和(f)通过从步骤(f)中获得的产物中蒸馏出所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸来使所述甘油酯与所述faee和ffa分离，以得到包含faee和ffa的馏出物和包含甘油酯混合物的残留物，其中所述甘油酯混合物任选地进一步包含极性类脂，所述甘油酯混合物含有比所述油更高的ω-3脂肪酸含量，并且ω-3脂肪酸的回收率高于60％。在本公开内容的所述第五方面的方法中，所述水或碱性缓冲水溶液可以以所述油的0.2-10％w/w的量加入，可以特别是以最高至所述油的0.2％、0.5％、0.75％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、6.5％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％和最高10％w/w的量加入，通过加入所述水或碱性缓冲水溶液可以将反应体系的ph调节到约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。在本公开内容的所述第五方面的方法的所述步骤(d)中，可以使所述反应进行直到实现至少40％、特别是至少45％、或至少50％且最高70％的所述油到脂肪酸烷基酯(faee)的转化率，低于10％、特别是2-8％游离脂肪酸(ffa)和约15％至约60％、特别是约15％、20％、25％至约30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，步骤(f)中获得的包含甘油酯混合物和任选地包含极性类脂的产物含有比所述油更高的ω-3脂肪酸含量，并且回收率高于60％，例如高于62％、65％、68％、70％、75％和更高。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，从步骤(f)中的反应产物蒸馏出的脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸的混合物包含所述油中存在的总n-3脂肪酸中低于40％、特别是低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％且甚至更低的n-3脂肪酸结构部分。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，所述油可以是可食用油、特别是鱼油或藻类油、真菌油或合适的含有n-3脂肪酸的含油物质。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，所述醇可以特别是乙醇或甲醇中的任何之一，和所述短烷基醇给体可以是碳酸二甲酯或碳酸二乙酯中的任何之一。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，所述蒸馏是分子蒸馏、短程蒸馏或薄膜蒸馏中的任何之一。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，所述n-3脂肪酸结构部分是dha、dpa和epa结构部分中的任何之一及其至少两种的任何混合物。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，所述脂肪酶衍生自以下中任何之一：南极假丝酵母a(cala)、米黑根毛霉、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、南极假丝酵母b(calb)、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、伯克霍尔德菌属、绵毛嗜热丝胞菌或粘质色杆菌，特别是其中所述脂肪酶衍生自南极假丝酵母a(cala)、假单胞菌属、产碱杆菌属或绵毛嗜热丝胞菌。在本公开内容的所述第五方面的所述方法中，所述疏水性芳族单体是二乙烯基苯(dvb)和/或苯乙烯和其中任选的所述温和亲水性单体是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，或组合的丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯。所述疏水性单体和所述温和亲水性单体的重量比可以分别是约10:0.1至约1:10，更特别是10-99％至90-1％。在本公开内容的所述第五方面的所述方法的实施方案中，步骤(f)中获得的所述甘油酯混合物可以进一步与反应混合物中(i)n-3ffa浓缩物或(ii)n-3脂肪酸短链烷基酯浓缩物中的至少之一在合适的游离形式或固定在聚合物树脂载体上的脂肪酶、特别是衍生自南极假丝酵母b(calb)的脂肪酶的存在下，在真空和30-80℃的温度下反应，以得到甘油酯混合物，并且在从反应混合物中蒸馏多余的脂肪酸乙酯和/或脂肪酸以及副产物醇和/或水之后，大于60％、特别是大于约65％、大于约70％和最高约100％的甘油三酯含有大于60％的n-3脂肪酸。在第六方面，本公开内容提供一种n-3脂肪酸短链烷基酯、特别是n-3脂肪酸乙酯的酶促制备方法，该方法包括：(a)提供油，其包含n-3多不饱和脂肪酸、特别是约5％至约60％w/w的n-3多不饱和脂肪酸，所述n-3脂肪酸作为键合到所述油中的甘油酯和任选的极性类脂的甘油主链上的脂肪酰基和/或作为游离脂肪酸而存在，所述油还包含游离或酯化的饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸；(b)以所述油的0.2-10％w/w的量向所述油中加入水或碱性缓冲水溶液，以得到ph为约5至约9的混合物；(c)向步骤(b)中获得的混合物中加入假单胞菌属脂肪酶(ps脂肪酶)制剂，其中所述ps脂肪酶以高负载量、特别是高于10000单位所述ps脂肪酶/1g聚合物载体的量固定在聚合物树脂载体上，其中所述树脂包含交替的疏水性结构域和温和亲水性结构域、特别是包含疏水性脂族或芳族单体的疏水性结构域和包含丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的温和亲水性结构域，其中所述脂肪酶ps表现出对游离形式或当键合到甘油或极性类脂上时的饱和的、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸的高选择性，并且能够同时或连续地酯交换/酯化/水解所述脂肪酸；(d)提供短链烷基醇、特别是乙醇，和将所述醇加入、特别是逐步加入步骤(c)中获得的所述油和所述酶制剂的混合物中，以形成包含所述油、所述脂肪酶制剂、所述水或缓冲水溶液和所述醇的反应体系，其中所述油与所述醇反应，并且使所述反应达到约70％的所述油到脂肪酸烷基酯的转化率和低于10％的ffa；(e)通过除去所述第一脂肪酶制剂来停止反应，并且收集含有脂肪酸烷基酯(faee)、甘油单酯、甘油二酯和残余甘油三脂以及游离脂肪酸副产物和多余醇的反应混合物的上层有机相/馏分；(f)将步骤(e)中获得的所述有机相与短链烷基醇、特别是乙醇在固定在聚合物树脂载体上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(tl)存在下反应，其中所述树脂包含交替的疏水性结构域和温和亲水性结构域、特别是包含疏水性脂族或芳族单体的疏水性结构域和包含丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的温和亲水性结构域，和使得反应进行直到将所述油中脂肪酰基的至少97％、特别是98％、99％和最高100％转化成其低级烷基酯、特别是乙基酯；(g)通过从反应混合物中除去所述脂肪酶制剂来停止反应；和(h)通过分馏来从反应混合物中分离所述n-3多不饱和脂肪酸烷基酯浓缩物。在本公开内容的所述第六方面的方法中，用于所述ps脂肪酶和所述tl脂肪酶二者的所述树脂载体包含交替的疏水性结构域和温和亲水性结构域，所述疏水性结构域包含交联的二乙烯基苯单体、交联的苯乙烯单体或交联的苯乙烯和二乙烯基苯单体，所述温和亲水性结构域包含丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯。在本公开内容的所述第六方面的方法中，所述ps脂肪酶可以以以下的负载量固定在所述聚合物树脂载体上：约5000至约50000单位/1g所述载体、特别是约15000-30000单位/1g所述载体、更特别是约20000-25000单位/1g所述载体。在本公开内容的所述第六方面的方法中，所述疏水性树脂结构域和所述温和亲水性结构域之间的重量比可以分别是约10:0.1至约1:10。更特别地，所述疏水性树脂结构域和所述温和亲水性结构域之间的重量比可以分别是10-99％至90-1％。在本公开内容的所述第六方面的方法中，所述ps脂肪酶制剂和所述tl脂肪酶制剂在经过至少20次使用同一批次的每个所述ps脂肪酶制剂和tl脂肪酶制剂的反应循环后保持其催化活性的至少70％。在本公开内容的所述第六方面的方法中，所述上层有机相/馏分可以通过以下中任何之一来收集：重力分离、离心或将反应混合物送过填充有吸附甘油/水的树脂的柱。在本公开内容的所述第六方面的方法的实施方案中，步骤(h)中获得的该分离的3-n多不饱和脂肪酸烷基酯、特别是乙基酯浓缩物在能够将所述烷基酯浓缩物的n-3脂肪酰基结构部分酯交换成所述甘油的脂肪酶特别是衍生自南极假丝酵母b(calb)的脂肪酶的存在下可以与甘油进一步反应，其中所述脂肪酶任选地固定在合适的聚合物树脂载体上，其中反应体系包含最高至所述分离的3-n多不饱和脂肪酸烷基酯浓缩物的约1％重量的水，和使得反应进行直到在除去未反应的甘油并蒸馏多余的脂肪酸/脂肪酸烷基酯、和烷基醇特别是作为副产物的乙醇和/或水之后，形成甘油酯混合物，其包含大于总共形成的甘油酯的50％的甘油三酯。在本公开内容的所述第六方面的方法中，其上固定所述脂肪酶的聚合物树脂载体可以包含交替的疏水性结构域和温和亲水性结构域、特别是包含疏水性脂族或芳族单体、特别是二乙烯基苯和/或苯乙烯的疏水性结构域，和包含丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的温和亲水性结构域。在本公开内容的所述第六方面的方法中，所述油的所述n-3脂肪酸结构部分是dha、dpa和epa结构部分中的任何之一及其至少两种的任何混合物。所述n-3脂肪酸可以以游离形式或作为油(特别是鱼油和含油的油)的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯或极性类脂的脂肪酸结构部分而存在。附图说明为了更好地理解本文公开的主题以及为了示例该主题在实践中可以如何实施，现在将参考附图仅以非限定性实例的方式描述实施方案，附图中：图1显示了在第4次重复使用同一批次的固定化脂肪酶制剂的反应循环中，固定化绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(lipozymetl100l，novozymes，丹麦)制剂在精制鱼油和乙醇的酯交换中的催化活性曲线，其中该脂肪酶固定在不同的聚合物树脂上，每一个树脂包含各种比的二乙烯基苯(dvb)和甲基丙烯酸甲酯(mma)。所述脂肪酶制剂以粉末状形式使用。反应条件详述于表1中。图2显示了在35次使用同一批次的固定化脂肪酶制剂的连续反应循环中，在使用固定化绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(lipozymetl100l)制剂反应6小时后，精制鱼油和乙醇的酯交换/酯化转化率，其中脂肪酶固定在不同的聚合物树脂上，每一个树脂包含各种比的交替的dvb和mma结构域。该脂肪酶制剂以粉末状形式使用。反应条件详述于表1中。图3显示了在35次使用同一批次的固定化脂肪酶制剂的连续反应循环中，使用固定化假单胞菌属脂肪酶(脂肪酶psamano)制剂的精制鱼油和乙醇的酯交换/酯化转化率，其中脂肪酶固定在不同的聚合物树脂上，每一个树脂包含各种比的交替的dvb和mma结构域。该脂肪酶制剂以粉末状形式使用。反应条件详述于表1中。详细的描述本文提供了用于富集具有多不饱和脂肪酸(pufa)、具体是n-3多不饱和脂肪酸(n-3pufa或n-3脂肪酸，本文中可互换使用)、特别是dha、dpa和epa的油的新方法和工艺。本文进一步提供了甘油酯组合物，其富含n-3多不饱和脂肪酸和n-3多不饱和脂肪酸浓缩物，其主要成分是甘油三酯、甘油二酯或甘油单酯及其至少两种的任何混合物，具有连接到甘油主链上的高含量n-3多不饱和脂肪酰基结构部分。本发明公开的工艺使用各种脂肪酶制剂(包含固定化形式的一种或多种脂肪酶)用于富集具有甘油三酯或偏甘油酯形式的n-3多不饱和脂肪酸的油、特别是但不限于鱼油，如以下详细描述的。与上述传统工艺相比，本发明公开的工艺提供了一种可替代方案。本文提供了利用各种不同组合的脂肪酶催化反应和分子蒸馏用于富集具有n-3多不饱和脂肪酸的油的工艺和方法，特别是用于获得甘油酯形式的n-3多不饱和脂肪酸浓缩物，其中甘油酯的总脂肪酸结构部分中大于40％w/w的是n-3脂肪酸结构部分，具有改进的回收率，典型地大于起始材料中n-3脂肪酸初始含量的60％w/w。在第一方面，本公开内容提供一种使用固定化脂肪酶制剂(其包含脂肪酶或脂肪酶混合物，具有底物特异性和选择性，如本文所公开的)在作为n-3脂肪酸的源的油和短链醇或醇源之间的反应，其允许生产具有高含量n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯和减少含量的反应副产物脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸中的n-3多不饱和脂肪酸，由此使得所述油源富含有n-3pufa。在第二方面，本发明还提供一种用于降低脂肪酶对某些n-3脂肪酸的选择性以便脂肪酶催化的反应(包括油源的酯交换、酯化和水解)的甘油酯产物中的n-3脂肪酸含量显著增加的方法，同时其减少了该反应的副产物(当使用乙醇脂肪酸乙酯时，主要是游离脂肪酸和脂肪酸烷基酯)。根据本发明，脂肪酶选择性的改变是通过将脂肪酶固定在特定的“混合”载体树脂上来实现的，该“混合”载体树脂具有疏水性和亲水性结构域二者，如下所述。因此在第三方面，本公开内容提供一种用于将脂肪酶固定在微孔聚合物树脂上的方法，所述树脂包含：包含疏水性聚合物(在整个本说明书中，任何数目的连接单体)的疏水性结构域和包含亲水聚合物的温和亲水性结构域(在整个本说明书中，任何数目的连接单体)二者。如本文中所用的术语“温和”表示包含带酯基的单体的亲水性聚合物拉伸(stretch)或链段，其在所形成的混合树脂上不能在相邻的聚合物链之间产生氢键。本文所提供的固定在这样的“混合”疏水性-亲水性树脂上的脂肪酶可导致对饱和脂肪酸和某种程度上对某些单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸(游离脂肪酸形式或甘油酯的脂肪酰基形式)增加的酯交换/酯化活性，和对游离脂肪酸或脂肪酰基形式的n-3脂肪酸的酯交换/酯化的低选择性。这种聚合物树脂载体的“结构域”本文中也称作“链段”或“拉伸”，即疏水性聚合物的拉伸/链段，基本上与温和亲水性聚合物的拉伸/链段交替。本文提供的聚合物载体包含交替的亲水性结构域和疏水性结构域(并且也可以称作“混合载体”或“混合树脂”)。例如该“混合”聚合物载体可以是这样的载体，其具有交替的包含疏水性脂族或芳族结构域的结构域和包含温和亲水性结构域(如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯结构域或其任意混合)的结构域。该温和亲水性结构域可具有不同或相同的长度(不同数目的单体)，和因此该疏水性结构域可以具有不同或相同的长度(不同数目的单体)。在本公开内容中，使用包含与丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯交联的二乙烯基苯的大网络多孔聚合物载体是作为混合载体的一个非限定性实例来提出的。如上所述，要理解，当提及“包含温和亲水性聚合物的结构域”或“包含疏水性聚合物的结构域”时，表示任何长度/数目的连接的、特别是交联的温和亲水性单体或疏水性单体，其中拉伸不需要具有传统的“聚合物”长度，并且可以包含从1个和/或几个单体如低聚物，到许多单体如聚合物。在第四方面，本文提供脂肪酶制剂，其中脂肪酶固定在微孔聚合物树脂载体上，该树脂具有疏水性结构域和温和亲水性结构域，如上所述。这种聚合物载体包含交替的温和亲水性结构域和疏水性结构域(并且也可以称作“混合载体”或“混合树脂”)。在本公开内容的所述第三和第四方面以及整个中，混合聚合物载体可以是这样的聚合物树脂，其具有交替的疏水性脂族或芳族连接的单体的结构域和温和亲水性丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯连接的单体的结构域。该混合树脂中的温和亲水性结构域可以具有不同或相同长度(不同数目的单体)，和因此混合树脂中的疏水性结构域可以具有不同或相同长度(不同数目的单体)。在将脂肪酶固定在混合载体上的方法的具体实施方案和将脂肪酶固定在混合载体上的具体实施方案中，固定脂肪酶的载体是大网络多孔聚合物载体，其包含交替的与丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯(mma)交联的二乙烯基苯(dvb)(或不同比的二乙烯基苯和苯乙烯的混合物)的结构域。与游离脂肪酶或固定在其他载体如亲水性或疏水性载体上的脂肪酶相比，所公开的固定在混合载体上的脂肪酶制剂表现出对饱和脂肪酸和在某种程度上对单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸(游离脂肪酸形式或脂肪酰基形式)增加的酯交换/酯化活性，和对游离脂肪酸或脂肪酰基形式的n-3脂肪酸的酯交换/酯化的低选择性。术语“聚合物载体”、“聚合物基质”、“固定化载体”、“聚合物基底”、“树脂载体”、“树脂基质”、“固定化树脂”、“树脂基底”、“聚合物载体”等在本文中可互换使用，并且是指固体或半固体聚合物/树脂体，在其上可以化学地或物理地固定酶、特别是脂肪酶。本文中用作用于固定酶、特别是脂肪酶的聚合物载体的组分的术语“聚合物结构域”或“聚合物链段”或“聚合物片段”或“聚合物拉伸”等被认为表示这样的聚合物载体的部分。在第五方面，本公开内容提供一种用于酶促富集具有n-3pufa的油的方法，其主要包括使用固定在所公开的“混合”疏水性-亲水性载体(树脂)上的脂肪酶在作为n-3脂肪酸的源的油和短链醇或醇给体之间的反应，其导致与起始油源相比高含量n-3脂肪酸的甘油酯，和减少含量的酶反应副产物脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸中的n-3脂肪酸。例如根据这个方面，用于富集含有5％-60％w/w、特别是10％-30％w/w或更多的多不饱和脂肪酸、特别是dha、dpa和epa的油的方法包括步骤：(a)使用固定在具有疏水性-亲水性结构域的聚合物树脂上的脂肪酶，用醇或醇给体同时或连续地酯交换/酯化和水解含有n-3脂肪酸的油，所述脂肪酶对特定的饱和的且某种程度上对单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸或其酰基结构部分具有高选择性；和(b)除去该固定化脂肪酶制剂和从所形成的脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸(其含有低于起始材料中总n-3脂肪酸的50％w/w的n-3脂肪酸)中分离所形成的甘油酯(其含有高于起始材料中总n-3脂肪酸的50％w/w的n-3脂肪酸)，以得到富含n-3脂肪酸的甘油酯馏分。要注意在本公开内容的所有方面中，所述酯交换可以是一步直接酯交换，或其可以通过水解反应，随后是所形成的游离脂肪酸与醇的连续酯化来实现。酯化也可以是存在于反应介质中的任何游离脂肪酸与短链醇的酯化。在第六方面，本公开内容提供一种用于制备脂肪酸烷基酯、特别是脂肪酸乙酯的全酶促两步法，如以上详细的和以下实施例中所述。通常，这种方法提供n-3脂肪酸短链烷基酯、特别是n-3脂肪酸乙酯的酶制剂，其中包含n-3多不饱和脂肪酸的油与短链烷基醇、特别是乙醇在ph约5-9的水或碱性缓冲水溶液存在下，和在假单胞菌属脂肪酶(ps脂肪酶)制剂存在下反应，其中所述ps脂肪酶以高负载量、特别是高于10000单位所述ps脂肪酶/1g聚合物载体的量固定在聚合物树脂载体上，其中所述载体是根据本公开内容的混合聚合物载体。使反应进行直到实现约70％的所述油到脂肪酸烷基酯的转化率和低于10％的ffa，然后通过除去所述ps脂肪酶制剂来停止，并且收集反应混合物的上层有机相/馏分，所述反应混合物含有脂肪酸烷基酯(faee)、甘油单酯、甘油二酯和残余甘油三脂，以及游离脂肪酸副产物和多余的醇。在第二步中，所述有机相与短链烷基醇、特别是乙醇在固定在根据本公开内容的混合聚合物树脂载体上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(tl)的存在下反应，并且使得反应进行直到将所述油中脂肪酰基的至少97％w/w、特别是98％w/w、99％w/w和最高100％转化成其低级烷基酯、特别是乙基酯。该反应然后通过从反应混合物中除去所述脂肪酶制剂来停止，并且通过分馏将所获得的n-3多不饱和脂肪酸烷基酯浓缩物与反应混合物分离。如以下实施例6中所示，在这种方法中，ps脂肪酶制剂和tl脂肪酶制剂二者在经过至少20次使用同一批次的每个所述ps脂肪酶制剂和tl脂肪酶制剂的反应循环后都保持其催化活性的至少70％。在所公开的工艺/反应的所有方面的实施方案中，富含n-3pufa的甘油酯馏分可以通过如下方式从反应混合物中分离：用分子蒸馏/薄膜蒸馏处理该反应混合物，以除去富含脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸的馏分，由此在蒸馏后，富含n-3pufa的甘油酯馏分包含甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物，且n-3pufa的回收率为至少60％w/w。在所公开的工艺/反应的所有方面的实施方案中，所得到的分离的富含甘油酯馏分可以任选地进一步与n-3pufa浓缩物(主要是游离脂肪酸)或n-3pufa短链烷基酯，在例如南极假丝酵母脂肪酶b存在下或用具有类似的催化脂肪酸酯化活性的其他酶制剂(对于游离脂肪酸或脂肪酰基中的碳链的不饱和度或长度没有偏好)进行酶促反应。该酶可以以游离形式或固定在聚合物树脂上使用，以获得混合物，其主要包含进一步富含n-3脂肪酸(典型地大于60％w/w)的甘油三酯，和分别作为反应副产物的水或醇。在分别从反应混合物中除去酶和随后蒸馏水和/或醇以及任何未反应的脂肪酸或脂肪酸烷基酯之后，获得混合物，其主要包含含有大于60％w/w的n-3脂肪酸结构部分的甘油三酯。某些脂肪酶可以得到甘油酯馏分中n-3脂肪酸结构部分的回收率例如低于所用油的初始n-3脂肪酸含量的70％w/w，并且余量的n-3脂肪酸结构部分酯交换成副产物脂肪酸烷基酯混合物和水解副产物即游离脂肪酸混合物。当在所公开的工艺/反应的所有方面的实施方案中使用这样的脂肪酶时，反应混合物可以用以下的步骤进一步处理：(a)从反应混合物中除去酶，随后蒸发、特别是闪蒸，以从反应混合物中除去副产物醇和水；(b)任选地，用游离或固定形式的第二脂肪酶处理所得到的反应混合物，以催化反应组分(甘油酯)和脂肪酸烷基酯或游离脂肪酸的浓缩物之间的一锅法选择性酯化、酯交换和酯互换，以得到具有更高含量的甘油三酯形式的n-3脂肪酸的甘油酯；(c)除去酶和用分子蒸馏/薄膜蒸馏处理反应混合物以除去多余的脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸，以得到包含甘油酯混合物(主要是甘油三酯)的残留物，并且n-3脂肪酸结构部分含量高于60％。在本公开内容的所有方面和实施方案中，用于各种反应和工艺的油可以是可食用油，例如鱼油或藻类油、真菌油，或任何其他合适的含有n-3脂肪酸的含油物质。在本公开内容所有方面和实施方案中，醇可以是烷基醇，例如但不限于短链烷基醇。如本文所用的“短链烷基醇”表示c1-c6-烷基醇、特别是c1-c4-烷基醇如甲醇和乙醇。如本文所用的“短链醇给体”表示单短链烷基酯如乙酸甲酯或乙酸乙酯，或碳酸二短链烷基酯如碳酸二甲酯或碳酸二乙酯。用于本文所公开的各种反应和工艺或其不同阶段(如果存在的话)的脂肪酶可以衍生自例如任何南极假丝酵母a、南极假丝酵母b(calb)、米黑根毛霉、皱褶假丝酵母、柱状假丝酵母、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、黑曲霉、米曲霉(aspergillusoryzae)、卡门柏青霉、产碱杆菌属、伯克霍尔德菌属、特异腐质霉(humicolainsolens)、绵毛嗜热丝胞菌或粘质色杆菌。预期使用酶的混合物。术语“酶选择性”、“酶特异性”和“酶偏好”在本文中可互换使用。在本公开内容所有方面和实施方案中，用于所述反应和工艺的脂肪酶可以是游离的，或其可以固定在微孔聚合物树脂上。例如特别是在本公开内容的所述第一方面中，微孔聚合物树脂可以是包含脂族或芳族基团的疏水性微孔有机聚合物树脂，例如交联的二乙烯基苯或交联的苯乙烯和二乙烯基苯。在一些特定的方面和实施方案(如本公开内容所述第二、第三、第四、第五或第六方面)中，脂肪酶固定在“混合”微孔聚合物树脂上，该树脂通常具有交替的疏水性-亲水性结构域，如本文所公开的。由与甲基丙烯酸酯交联的二乙烯基苯制造的大网络多孔聚合物载体是可以用于本文中公开的工艺的实施方案的混合载体的一个实例。这些聚合物载体的特征在于其交替的疏水性和温和亲水性结构域，例如连接的脂族或芳族单体的疏水性结构域和连接的亲水性丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体的亲水性结构域。当提及“连接的”时，其特别被称作“交联的”。温和亲水性单体包括丙烯酸烷基酯和甲基丙烯酸烷基酯，而疏水性单体包括二乙烯基苯、苯乙烯和丙烯。本文中所公开和示例的具体组合是交替拉伸中包含不同比的二乙烯基苯和甲基丙烯酸甲酯单体的聚合物。如本公开内容的实验部分所示，使用本文公开的固定在“混合”载体上的一种或多种脂肪酶显著增加了甘油酯产物中脂肪酸结构部分形式的n-3脂肪酸的回收率。此外，当脂肪酶固定在所公开的混合载体上时，其在对游离形式或作为脂肪酰基结构部分的各种类型的脂肪酸、饱和、不饱和或多不饱和脂肪酸(例如脂肪酸烷基酯和甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯和极性类脂)的偏好方面表现出独特的催化性能。同时，与游离的、非固定形式或当固定在一些其他载体上时比较，脂肪酶制剂的选择性显著改进。用于本文公开的酯交换/酯化反应和工艺的脂肪酶可以具有对dha和epa的不同选择性，由此可以预先设计最终产物中游离脂肪酸和脂肪酸烷基酯和甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)中脂肪酰基形式的epa:dha的比。例如在期望最终的甘油酯产物中高浓度dha的情况中，选择绵毛嗜热丝胞菌[tl]脂肪酶，而对于期望最终甘油酯产物中高含量的epa和dha来说，可以使用产碱杆菌属脂肪酶(脂肪酶qlmtm)或是南极假丝酵母a脂肪酶[cala]。因此，为了具有最终一致的含有某些预定的epa和dha之比的甘油酯产物，根据本公开内容使用不同的酶体系所获得的甘油酯混合物(其含有某些已知比的epa:dha)可以用于最终甘油酯产物，以便在最终甘油酯产物中获得特定期望比的epa:dha。再进一步地，本文中公开n-3脂肪酸浓缩物，其中n-3脂肪酸基本上是其甘油酯形式的epa、dha和dpa，即作为甘油单酯、甘油二酯和/或三酸酯的脂肪酸结构部分，其中所述不同的n-3脂肪酸之间的比是预定的。这些浓缩物可以用作食品和食品补充剂中的营养成分，或用作食品添加剂，或用作药物制剂的成分。这样的添加剂或药物组合物可以以液体形式、或单位剂量形式(如凝胶胶囊)存在，其含有富含n-3脂肪酸的甘油酯混合物。甘油酯混合物是任何包含甘油三酯、甘油二酯和/或甘油单酯的混合物。可以预先设计甘油酯混合物中甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯之间的比。如公认的且如本文所用的，多不饱和脂肪酸是在其碳链中具有4个或更多个双键的脂肪酸。术语omega-3脂肪酸、ω-3脂肪酸、n-3脂肪酸、omega-3pufa、ω-3pufa和n-3pufa在本文中可互换使用。术语脂肪酰基、或脂肪酰基基团、或脂肪酸残留物或脂肪酸结构部分在本文中可互换使用，且通常是指键合的脂肪酸结构部分，例如键合到甘油酯和/或极性类脂的甘油主链上，或作为脂肪酸烷基酯的酸结构部分。在整个本发明中，除非另有指示，当以百分比提及n-3脂肪酸或脂肪酸结构部分的水平时，它们是重量百分比，并且表示为脂肪酸结构部分的总重量中n-3脂肪酸结构部分的重量分数。这样的百分比表示为可互换的x％或x％w/w或x％w/w。本文中所公开的n-3富集工艺的一些实施方案中，提供一种方法，其包括使包含5％-60％、例如10％-35％的n-3脂肪酸的油和短链醇或醇给体，在水和生物催化剂、特别是固定在上述包含疏水性和温和亲水性结构域的聚合物树脂(混合载体)上的脂肪酶存在下反应。如以下更详细描述的，归因于其固定化，生物催化剂(脂肪酶)表现出对特定的饱和脂肪酸和在某种程度上还对单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸增加的酯交换/酯化反应(其可以同时或连续地以任何次序发生)活性，和对n-3脂肪酸降低的酯交换/酯化活性。当反应停止时，除去固定化脂肪酶制剂，随后蒸发、特别是闪蒸反应介质以除去水和多余的醇，并且经由包含反应中形成的脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸的馏分的蒸馏来获得富含n-3脂肪酸的甘油酯的馏分。蒸馏可以例如是分子蒸馏或薄膜蒸馏。甘油酯分离的结构部分包含存在于起始油材料中超过60％的n-3多不饱和脂肪酸。这种分离的富含n-3脂肪酸的甘油酯馏分可以任选地用n-3游离脂肪酸浓缩物、或n-3脂肪酸短链烷基酯浓缩物在具有酯交换/酯化活性的游离的或固定化酶如南极假丝酵母脂肪酶b存在下进一步酯化/酯互换，以形成具有大于60％n-3脂肪酸的主要甘油三酯混合物，和分别作为副产物的水和短链醇。这种进一步富含n-3脂肪酸的甘油三酯馏分可以通过从反应混合物中蒸馏所形成的水/醇和残留的多余游离脂肪酸和/或脂肪酸烷基酯来获得。要注意所除去的酶是可再生的，并且可以在经过多个反应循环后重新使用。术语“连续地”和“依次地”当提及酶反应时在本文中可互换使用。在本公开内容的工艺和反应的所有方面和实施方案中，固定化酶可以以多次分批或是连续地用于固定床、填料床、流化床和搅拌釜式反应器。不受限于理论，认为在特定的方面和实施方案中，归因于其上固定脂肪酶的本文中所定义的混合聚合物树脂载体的性质，该载体包含交替的疏水性-亲水性结构域(如上详述)，酶调适为新的有利的构型，与当为游离形式、或当固定在具有疏水或亲水特性的其他类型的聚合物载体树脂上时的其活性位点空腔相比，其具有更小的活性位点空腔。与其游离形式或固定在不同聚合物树脂上的活性相比，更小的活性位点空腔可导致脂肪酶对短链脂肪酸如月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸脂肪酰基和某种程度上对单不饱和、双不饱和或三不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸和亚麻酸增加的酯交换/酯化活性率，和对游离脂肪酸形式或作为脂肪酰基结构部分的长链脂肪酰基如dpa、epa和dha降低的酯交换/酯化活性。本公开内容可因此通过将这样的脂肪酶固定在本文中公开的混合聚合物载体上来提供用于改变脂肪酶对各种类型的脂肪酰基的选择性的手段。在所有本文公开的工艺和组合物中，还可以预先设计甘油酯混合物或甘油酯浓缩物中n-3脂肪酸的最终浓度(水平)，这取决于起始n-3脂肪酸浓缩物以及酶的源。另外，如所述，目前公开的方法可以调适以通过使用对epa和dha表现出不同特异性的脂肪酶来得到最终浓缩物中预定比的epa:dha。这种特征使得能够制备“定制的”epa/dha脂肪酸浓缩物，其可以根据目标用途用于食品和营养品工业的各种共混物和混合物中。通常，根据本公开内容所产生的浓缩物中epa:dha结构部分的重量比可以是约0.01:2至5:1及其之间的任何子值。如本文使用的，术语“约”表示包括从参数(如温度、压力、浓度、产率、浓度等)特别提及的值偏离±10％。本文中无论何时表示数值范围时，该范围是指包括所述范围内的任何所述数值(分数或整数)。措词第一所示数字和第二所示数字“之间的范围”和从第一所示数字“到”第二所示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且是指包括第一和第二所示数字和在它们之间的所有分数和整数。应当注意，在通过使用给定范围来描述的各种实施方案的情况中，所述范围是仅出于方便和简要而给出的，并且不应当解释为不灵活地限制了本发明的范围。因此，范围的说明应当被认为具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。如本文所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该”包括复数形式，除非上下文明确另有指示。例如术语“式(i)的一个化合物”可以独立地包括多个式(i)的化合物，包括其混合物。在整个说明书及其后的权利要求中，除非上下文另有需要，否则词语“包含或包括(comprise)”和变型如“包含或包括(comprises)”和”包含或包括(comprising)”将理解为表示包含或包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但是不排除任何整数或步骤或整数和步骤的组。应理解，为了清楚起见而描述在分别的实施方案的上下文中的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合来提供。相反，为了简要起见而描述在单个实施方案的上下文中的本发明的各种特征也可以分别或以任何合适的子组合方式或合适地在任何其他本发明所述的实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中所述的某些特征不被认为是那些实施方案的基本特征，除非所述实施方案在没有那些要素的情形下无法实施。以下的实施例是由本发明人在以非限定性方式实施本发明的方面时所用技术的代表。应当理解，虽然这些技术是用于实践所公开的工艺和组合物的具体实施方案的示例，但是本领结构域技术人员根据本公开内容将认识到在不脱离本发明的目标范围的情形下可以做出诸多改变。实施例实施例1-固定化脂肪酶的制备在该工作中脂肪酶以游离形式或固定在不同载体上来使用，该载体包括微孔二氧化硅、各种程度的亲水和疏水特性的聚合物吸附剂，和离子交换树脂。以下是用于固定该工作中测试的不同脂肪酶的载体的列表。酶固定化程序可以如下：将衍生自所指定的不同合适源的脂肪酶(10000单位的脂肪酶)溶解在0.1m和ph7的磷酸盐缓冲溶液(10ml)中。将珠粒形式(粒度分布为100-1500微米)或粉末状形式(小于100微米)的酶载体(2g)引入酶溶液中。将该混合物在室温下摇动4-12小时。将固定在载体上的酶从溶液中过滤出。任选地，将过滤的酶用冷丙酮洗涤，并且然后在干燥器或冻干机中干燥至固定化酶制剂的水含量低于5％。该工作中所用的脂肪酶是衍生自不同源的脂肪酶：南极假丝酵母a(cala)和b(calb)、米黑根毛霉、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、伯克霍尔德菌属和绵毛嗜热丝胞菌。作为实例，将cala固定在以下所列的各种载体上，该载体具有不同的疏水-亲水特性以形成固定化脂肪酶制剂：1.具有疏水特性的活性炭(sigma)2.具有疏水特性的交联的苯乙烯-二乙烯基苯(xad1600n，rohm&haas，或vpoc1064mdph，lanxess，德国)3.与甲基丙烯酸甲酯交联的二乙烯基苯，其包含不同(交替)的疏水性和温和亲水性结构域。4.具有亲水特性的交联的酚醛缩聚树脂-弱碱性阴离子交换剂(a568，rohm&haas)5.具有亲水特性的甲基丙烯酸类聚合物(xad7hp，rohm&haas)6.具有亲水特性的硅胶60(sigma-aldrich，cas号112926-00-8)实施例2甘油酯形式的n-3脂肪酸浓缩物的制备通过混合或摇动使根据实施例1的游离形式或固定在六种不同酶载体的每一个(1g)上(在下表中以“游离”或载体号表示)的衍生自南极假丝酵母a(cala)的脂肪酶(15000单位，novocoradl，novozymes，丹麦)与精制鱼油(10g)(ffa含量低于0.3％，n-3脂肪酸水平30％，epa18％和dha12％w/w)接触，并且将乙醇(2g)以三个等量批次(每个间隔1小时)加入该反应体系(油-酶混合物)中。通过加入所需量的水或碱性缓冲水溶液来将反应混合物中的水含量调节到油的3重量％，以使得反应介质的ph为5-9。该反应在30℃下进行。反应产物通过气相色谱法以不同的时间间隔量化。下表1、2和3显示在不同时间间隔下在反应体系中产生的乙基酯馏分中的脂肪酸乙酯的分布。在搅拌48小时后，将固定化脂肪酶制剂过滤出(在使用游离脂肪酶的这个和所有以下的实施例中，其在反应结束时沉淀)，并且将反应混合物闪蒸以除去多余的水和醇，并且然后通过分子分馏(lab3tm离心蒸馏系统，myerstm，美国)在10mtorr和120℃下蒸馏以除去脂肪酸乙酯(faee)和游离脂肪酸(ffa)，并且产生鱼油甘油酯馏分，其含有超过起始材料中存在的总n-3脂肪酸的60％的n-3脂肪酸。最终的甘油酯馏分中的n-3脂肪酸含量通过以下方式来确定：甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯在处于甲醇中的14％三氟化硼溶液(sigma产品-bf3/ch3oh)存在下完全甲基化，和通过气相色谱法分析所形成的脂肪酸甲基酯。表1表示使用不同的cala制剂在反应6小时后将精制鱼油和乙醇转化为faee的酯交换/酯化反应的结果。反应条件：使含有3％水和1g固定化脂肪酶制剂(或其粗形式的等量脂肪酶单位)的精制鱼油(10g)与乙醇(2g)混合，所述乙醇以三个等量批次(每个间隔1小时)加入反应体系(油-酶混合物)中。将反应混合物在30℃下温育并且以300rpm摇动。表1表2表示使用不同的cala制剂在反应24小时后将精制鱼油和乙醇转化为faee的酯交换/酯化反应的结果。反应条件与表1相同。表2表3：表示使用不同的cala制剂在反应30小时后将精制鱼油和乙醇转化为faee的酯交换/酯化反应的结果。反应条件与表1相同。表3表1-3清楚地显示了与游离形式或当固定在其他不同载体上时的相同脂肪酶的活性相比，固定在包含温和疏水性和温和亲水性结构域的聚合物树脂上的cala(脂肪酶制剂编号3)增加了其对饱和的和单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酰基的偏好并且降低了其对n-3脂肪酰基的偏好。例如，如表1中可见，尽管在使反应进行6小时后，当使用脂肪酶制剂编号3时，faee的馏分增加到49.9％，与之相比粗(非固定化)cala是39.6％，faee馏分中n-3脂肪酸结构部分的水平是7.3％w/w，与之相比当使用粗cala时是15.9％w/w，表明大部分的n-3脂肪酸保留在甘油酯馏分中，产生了高度富含n-3脂肪酸结构部分的油。实施例3甘油酯形式的n-3脂肪酸浓缩物的制备衍生自产碱杆菌属(10000单位，脂肪酶qlmtm，meitosangyo，日本)的脂肪酶如实施例1那样为其游离形式或固定在不同的酶载体(1g)上，通过混合或摇动使各种酶制剂中的每一个与含有30％的n-3脂肪酸的ffa含量低于0.3％的精制鱼油(10g)接触，将乙醇(2g)以三个等量批次(每个间隔1小时)加入反应体系(油和酶)中。通过加入所需量的水或碱性缓冲水溶液将反应混合物中的水含量调节到油的2重量％，以使得反应介质的ph为5-9。该反应在30℃下进行。反应产物通过气相色谱法以不同的时间间隔量化。在搅拌6小时后，将固定化脂肪酶制剂过滤掉，并且将反应混合物闪蒸以除去多余的醇和水，并且然后通过分子分馏进行蒸馏以除去脂肪酸乙酯和游离脂肪酸(ffa)，并且产生鱼油甘油酯馏分，其含有超过起始材料中存在的总n-3脂肪酸的60％回收率的n-3脂肪酸。下表4显示了反应6小时后鱼油甘油酯到脂肪酸乙酯的转化率以及乙基酯馏分中的n-3含量。表4表4中所示的结果表明与表1-3所示类似的倾向，其在于固定在包含亲水性-疏水性结构域的聚合物载体上的脂肪酶在酯交换/酯化反应体系中表现出对ω-3脂肪酸基团降低的偏好。对于脂肪酶qlm/4来说低比率的ω-3/faee是可忽略的，因为反应6小时后的转化率是相对低的。实施例4甘油酯形式的n-3脂肪酸浓缩物的制备根据实施例1将衍生自绵毛嗜热丝胞菌(lipozymetl100l，novozymes，丹麦)、产碱杆菌属(脂肪酶qlmtm，mietosangyo，日本)和假单胞菌[脂肪酶ps，amanoenzymes，日本]的脂肪酶分别固定在的包含二乙烯基苯(dvb)和甲基丙烯酸甲酯(mma)(分别以10:1wt％的比)的聚合物载体上。通过混合或摇动使该脂肪酶制剂与含有30％的n-3脂肪酸的ffa含量是24％的粗鱼油(10g)和乙醇(2g)的混合物接触，乙醇以三个等量批次(每个间隔1小时)加入该反应体系中。通过加入所需量的水或碱性溶液将反应混合物中的水含量调节到油的3重量％，以使得反应介质的ph为5至约9。该反应在30℃下进行。反应产物和ffa值通过气相色谱法以不同的时间间隔量化。下表5-7显示了使用不同酶制剂将鱼油甘油酯和ffa酯交换/酯化和水解成脂肪酸乙酯的曲线。表5表示使用固定在dvb/mma聚合物树脂上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶将鱼油甘油酯和ffa酯交换/酯化和水解成faee的曲线。表5时间(h)ffa(％)faee(％)mag(％)dag(％)tag(％)023.80.02.12.771.3212.353.69.218.16.865.671.212.79.80.6243.984.66.74.70.0mag＝单酰甘油酯dag＝二酰甘油酯tag＝三酰甘油酯表6表示使用固定在dvb/mma聚合物树脂上的假单胞菌属脂肪酶将鱼油甘油酯和ffa酯交换/酯化和水解成faee的曲线。反应条件如上所述。表6时间(h)ffa(％)faee(％)mag(％)dag(％)tag(％)023.80.02.12.771.3214.650.98.818.37.467.374.99.96.51.4243.989.35.21.60表7表示使用固定在dvb/mma聚合物树脂上的产碱杆菌属脂肪酶将鱼油甘油酯和ffa酯交换/酯化和水解成faee的曲线。反应条件如上所述。表7表5-7所示的结果表明固定化脂肪酶同时或连续地催化油甘油酯和游离脂肪酸的酯交换/酯化和水解反应，以在反应24小时后主要产生脂肪酸乙酯和低ffa值(典型地低于10％)。实施例5固定在包含疏水性结构域和温和亲水性结构域的共聚物上的脂肪酶该研究中所用的聚合物和共聚物载体根据由wang和yang(wang，y.和yang，w.，2004，langmuir，第20卷，第6225-6231页)所报道的方法来合成。已经合成了具有各种比的二乙烯基苯和甲基丙烯酸甲酯的不同载体，用蒸馏水洗涤并且冻干以除去水和残留的有机溶剂。使用实施例1中所述酶固定化程序来制备在各种载体组合物上的不同脂肪酶。最终产物(固定化脂肪酶制剂)是不透明的粒径小于50微米的粉末状物质。如制造商所规定的，使用研磨到粒度小于50微米的lewatitoc1600(lanxess，德国)作为对照的包含dvb和mma的树脂载体。图1显示了在第4次重复使用同一批次的生物催化剂的反应循环中，固定在各种比的dvb和mma的不同树脂上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(lipozymetl100l，novozymes)在精制鱼油和乙醇的酯交换中的催化活性曲线。所有脂肪酶制剂是以其粉末状形式使用。反应条件见表1。图1所示的结果表明脂肪酶酯交换活性随着与温和亲水性单体含量相比疏水性单体含量的增加而得以改进，在该实施例中是dvb(疏水性)和mma(温和亲水性)。当dvb/mma的比分别是10:1时，观察到最高的脂肪酶活性。图2显示了使用固定在包含不同比的dvb/mma的不同的聚合物载体上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(lipozymetl100l)反应6小时后精制鱼油和乙醇的酯交换/酯化转化率，在35次连续反应循环中重复使用同一批次的固定化酶珠粒。反应条件见实施例1。图3显示了使用固定在包含不同比的dvb/mma的不同的聚合物载体上的假单胞菌属脂肪酶(脂肪酶psamano)的精制鱼油和乙醇的酯交换/酯化转化率，在35次连续反应循环中重复使用同一批次的固定化酶珠粒。实施例6通过使用假单胞菌属脂肪酶和随后用绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(二者均固定在dvb-mma混合聚合物载体上以用于鱼油的非选择性酯交换/酯化)来制备鱼油的脂肪酸乙酯将现有技术中已知的在鱼油和乙醇的酯交换反应中对ω-3脂肪酰基低选择性的不同脂肪酶制剂以其固定化形式用于该工作，不同的制剂含有不同量的酶/单位重量的聚合物载体。下表显示了用在不同酶浓度下的分别固定在疏水性-温和亲水性序列聚合物载体上的假单胞菌属脂肪酶(脂肪酶psamano)、产碱杆菌属脂肪酶(脂肪酶qlmtm，meitosangyo)和绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(lipozymetl100l)反应6和24小时后，酯交换反应介质的组成。表8和9表示使用以不同的酶蛋白负载量(单位酶/1g聚合物载体)固定在dvb-mma聚合物载体上的假单胞菌属脂肪酶(脂肪酶psamano)的精制鱼油和乙醇的酯交换反应6和24小时后产生的faee％的组成。表8表9表10和11表示使用以不同的酶蛋白负载量(单位酶/1g聚合物载体)固定在dvb-mma聚合物载体上的产碱杆菌属霉脂肪酶(脂肪酶qlmamano)的精制鱼油和乙醇的酯交换反应6和24小时后产生的faee％的组成。表10表11表12和13显示使用以不同的酶蛋白负载量(单位酶/1g聚合物载体)固定在dvb-mma聚合物载体上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(lipozymetl100l)的精制鱼油和乙醇的酯交换反应6和24小时后产生的faee％的组成。表12表13表8-13中所示的结果表明当聚合物载体上的酶蛋白浓度增加时，假单胞菌属脂肪酶酯交换了所有类型的脂肪酰基(包括epa和dha酰基)，并且在反应24小时后达到约95％转化率，而产碱杆菌脂肪酶(脂肪酶qlmamano)和绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶(脂肪酶tl)随着聚合物载体上酶蛋白负载量的增加保持了其对ω-3脂肪酰基的低选择性。重要地，该结果表明衍生自假单胞菌属的脂肪酶ps当以在聚合物载体上的高蛋白负载量使用时，其可以用于含ω-3脂肪酰基的油的非选择性酯交换/酯化，以获得接近完全产率的脂肪酸烷基酯、特别是脂肪酸乙酯。令人惊讶地，当进行两级方法时，其中假单胞菌脂肪酶(脂肪酶ps，amano)用于鱼油和乙醇的酯交换/酯化，达到了高于70％的转化率，和然后通过从反应混合物中除去甘油和水相来收集反应介质的上层有机相，并且在固定在二乙烯基苯/甲基丙烯酸甲酯聚合物树脂上的绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶存在下再次与乙醇反应，实现了接近于100％的转化率。在两级酶促酯交换方法中还测试了两种酶的可再循环性，并且经证实，两种脂肪酶制剂在至少20次循环后保持大于其初始酶活性的70％。这些结果表明单独使用衍生自假单胞菌属的脂肪酶或与其他类型的特征在于高酯交换/酯化催化活性和稳定性的脂肪酶(例如绵毛嗜热丝胞菌脂肪酶)组合使用对于用全酶促方法替换传统的ω-3油的化学酯交换而言将是工业上高度感兴趣的，以便获得可酯化的脂肪酸到脂肪酸乙酯的接近100％的转化率。分馏可以在所述方法结束时，在实现到脂肪酸乙酯的100％的转化率之后使用，以便获得典型地为50-70％的ω-3脂肪酸浓缩物。实施例7制备富含多不饱和脂肪酸的甘油三酯如实施例2或3所获得的含有不同比的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物(在蒸馏出乙基酯和游离脂肪酸馏分之后)与游离脂肪酸形式或faee形式的80％n-3脂肪酸浓缩物使用固定在合适的聚合物树脂上的novozym435(novozymes，丹麦)或calb进行反应。该反应在60℃下在真空下进行以从反应体系中除去所形成的水或乙醇。在达到大于70％的存在于初始甘油酯馏分中的偏甘油酯到甘油三酯的转化率之后，过滤掉固定化生物催化剂。该产物典型地包含大于总甘油酯的70％的甘油三酯，所述甘油三酯含有高于60％水平的n-3多不饱和脂肪酸，这取决于起始的脂肪酸组成。当前第1页12