从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法与流程

本发明涉及无花果中有效成分提取技术领域，具体涉及从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法。

背景技术：

无花果属于桑科（moraceae）无花果属（ficus）的灌木或小乔木。其中法国布兰瑞克、新疆早黄、美利亚、中农红和日本紫果等无花果，均是我国无花果引进培育推广较广的优良品种，属于夏秋果兼用品种。该品种原产法国，树势中庸，果实较大，口感独特，风味香甜，几乎无病虫害，是生产绿色果品的最佳树种。我国无花果虽栽培历史悠久，但系统地开展无花果药食两用成分和技术研究工作起步较晚。自80年代初开始进行无花果的研究工作以来，随着各国科学家对无花果果品研究工作的进展，尤其对无花果药用价值和保健价值的逐步认识以及用于治疗癌症的研究进展，使人们对无花果的经济价值有了新的认识。本发明基于药食同源理论研究，即中医药认为许多食物既是食物也是药物，食物和药物同样能够防治疾病的传承，探究民“以食为药，以食代药”的功效成分，使其中中药与食物的共同有效成分或功效因子，即是食物疗法的基础，又可以用来防病治病。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法。

本发明为解决上述技术问题，所采用的技术方案是：从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法，包括以下步骤：

步骤一、取无花果果实，切片后冷冻干燥，然后在室温条件下将冻干果干用质量浓度为70%乙醇冷浸、超声辅助提取和过滤，经固液分离后，固体残渣风干并重复上述冷浸、超声辅助提取和过滤操作2-3次，然后将过滤滤液合并，放置过夜，滤去下层沉淀，将上清液蒸发浓缩后得到70%乙醇浸膏，备用；

步骤二、将步骤一得到的70%乙醇浸膏加水溶解至透明，然后在-4℃条件下冷藏陈放，冷藏陈放结束后除去不溶物，并将得到的清液分别用石油醚和乙酸乙酯进行提取，然后在50℃以下减压浓缩至得到相应浸膏，备用；

步骤三、取步骤二得到的乙酸乙酯浸膏，用乙酸乙酯再次溶解后，用硅胶柱分离纯化，湿法上样，然后依次用体积比为15:1、13:1、10:1、9:1、7:1、7:3、5:4、1:1、3:7、4:5、1:7、1:9的石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用tlc进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-8，备用；

步骤四、将步骤三得到的馏分段1运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂选用环己烷：乙酸乙酯10:1、8:2、6：4和1：1作为梯度洗脱剂依次洗脱分离，合并收集馏分10份，将馏分在室温下放置，然后将有固体析出1-3馏分进行过滤，得到一个黄色固体粉末状化合物i（呋喃香豆素）；馏分5-9合并后经小硅胶柱环己烷：乙酸乙酯8:2、6：4和1：1洗脱纯化，去除溶剂干燥后得到黄色透明胶状化合物ⅱ（3-甲基，7-甲酰酯基，4-羟基吡喃香豆素），化合物i和ⅱ的结构式如下：

；

将步骤三得到的馏分段3运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到化合物ⅲ（β-谷甾醇），化合物ⅲ的结构式如下：

将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的环己烷：丙酮溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色残渣和母液，过滤后将透明溶液浓缩至干燥，得到淡黄色胶状化合物ⅳ（双环[2,2,2]呋喃-2,5-环内酐），化合物ⅳ的结构式如下：

；

将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为10:1、9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，不断收集馏分后并将馏分在室温下放置，发现馏分3-11有固体洗出，将有固体析出的馏分合并进行离心得到白色固体，通过氯仿和甲醇重结晶，得到同分异构体化合物v（5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐）和vi（5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐）；将过滤后的母液继续放置，二次结晶被析出，收集固体合并，反复用氯仿淋洗，得到白色固体粉末状同分异构体化合物vii（5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐）和viii（5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐），化合物v、vi、vii和viii的结构式如下：

；

作为本发明从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法的进一步优化：所述步骤一中将冻干果干用其重量10-20倍的质量浓度为70%乙醇冷浸。

作为本发明从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法的进一步优化：所述步骤二中乙醇浸膏加10-20倍水溶解至透明，然后在-4℃条件下冷藏陈放12h。

有益效果

本发明从无花果中提取得到的8个化合物i-viii，其中化合物ii、iv、v、vi、vii、viii是新化合物，也是首次从无花果的果实中分离得到。这些化合物的结构除化合物iii为植物中常见的β-谷甾醇以外，化合物i和ii为香豆素类化合物，属于具有抗菌活性的天然物质，化合物iv、v、vi、vii和viii为酸酐类化合物，文献报道也是中药来源的具细胞毒活性与抑癌基因pdcd4表达的相关类化合物他们共存于无花果药食两用果品中，且经分离发现共存于该提取物的乙酸乙酯部位，这一重要信息提示了该提取部位物质成分组的组成信息。因此该发明将为揭示无花果抗癌作用提供新的循证医学的科学证据，以及无花果作为功能性食品和抗癌辅助食品开发的潜能。

附图说明

图1为化合物i的核磁共振氢谱；

图2为化合物ii的核磁共振氢谱；

图3为化合物ii的核磁共振碳谱；

图4为化合物ⅲ的核磁共振氢谱；

图5为化合物iv的核磁共振氢谱；

图6为化合物iv的核磁共振碳谱；

图7为化合物iv的核磁共振碳谱dept谱；

图8为化合物v和vi的核磁共振氢谱；

图9为化合物v和vi的核磁共振碳谱；

图10为化合物v和vi的核磁共振碳谱dept谱；

图11为化合物vii和viii的核磁共振氢谱；

图12为化合物vii和viii的核磁共振碳谱；

图13为化合物vii和viii的核磁共振碳谱dept谱。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步对本发明的技术方案进行阐述。

实施例1：

从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法：

步骤一、取无花果布兰瑞克品种果实切片后13kg，冷冻干燥；室温条件下将冻干果干用其重量10-20倍的质量浓度为70%乙醇冷浸，超声辅助提取和过滤，经固液分离后，固体残渣风干后，重复上述冷浸2-3次；将过滤滤液合并，放置过夜，滤去下层沉淀，然后上清液蒸发浓缩；得到70%乙醇浸膏，备用；

步骤二、将步骤一得到的浸膏状物加水10-20倍溶解至透明，然后在-4℃条件下冷藏陈放12h，冷藏陈放结束后除去不溶物，并将得到的清液分别用石油醚、乙酸乙酯进行提取；然后在50℃以下减压浓缩至相应浸膏，备用；

步骤三、取步骤二石油醚浸膏多为色素舍弃，取步骤二乙酸乙酯浸膏，用乙酸乙酯再次溶解后，用硅胶柱分离纯化。tlc选择石油醚：乙酸乙酯常压柱色谱进行分离，梯度洗脱。湿法上样，然后依次用体积比为15:1、13:1、10:1、9:1、7:1、7:3、5:4、1:1、3:7、4:5、1:7、1:9和乙酸乙酯部位的石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱；洗脱得到的馏分均采用tlc进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-10，备用；

步骤四、将步骤三得到的馏分段1运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂选用环己烷：乙酸乙酯10:1、8:2、6：4和1：1作为梯度洗脱剂依次洗脱分离，合并收集馏分10份，将馏分在室温下放置，然后将有固体析出1-3馏分进行过滤，得到一个黄色固体粉末状化合物i（36.0mg），被鉴定为呋喃香豆素（如图1核磁共振氢谱所示）；馏分5-9合并后经小硅胶柱环己烷：乙酸乙酯8:2、6：4和1：1洗脱纯化，去除溶剂干燥后得到黄色透明胶状化合物ⅱ(24.3mg)，化合物ii被推断是一个新化合物，被命名为3-甲基，7-甲酰酯基，4-羟基吡喃香豆素（如图2和3的核磁共振氢谱和碳谱所示）；

将步骤三得到的馏分段3（石油醚：乙酸乙酯10:1-9:1）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物ⅲ(39.0mg)，被鉴定β-谷甾醇（如图4核磁共振氢谱所示）；

将步骤三得到的馏分段5（石油醚：乙酸乙酯9:1-7:3）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色残渣和母液，过滤后将透明溶液浓缩至干燥，即的纯品化合物ⅳ(17.6mg)；经过波谱分析被推定为有一个新化合物，被命名为双环[2,2,2]呋喃-2,5-环内酐（如图5-7的核磁共振氢谱和碳谱所示）；

将步骤三得到的馏分段4（石油醚：乙酸乙酯5:4、1:1、3:7、4:5-0:1）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为10:1、9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，不断收集馏分后并将馏分在室温下放置，发现馏分3-11有固体洗出。将有固体析出的馏分合并进行离心得到白色固体；通过氯仿和甲醇重结晶，即得到白色固体粉末化合物异构体v和vi(27.0mg)；将过滤后的母液继续放置，二次结晶被析出，收集固体合并，反复用氯仿淋洗，即可得到浅黄色固体粉末化合物异构体vii和viii(13.4mg)。经红外光谱和核磁共振波谱分析，化合物v和vi、vii和viii均为新化合物，他们分别被命名为：5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐（v），和5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐（vi）；5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐（vii）和5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐（viii），如图8-13的核磁共振图谱所示。

实施例2：

从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法：

步骤一、取无花果新疆早黄品种果实切片后9kg，冷冻干燥；室温条件下将冻干果干用其重量10-20倍的质量浓度为70%乙醇冷浸，超声辅助提取和过滤，经固液分离后，固体残渣风干后，重复上述冷浸2-3次；将过滤滤液合并，放置过夜，滤去下层沉淀，然后上清液蒸发浓缩；得到70%乙醇浸膏，备用；

步骤二、将步骤一得到的浸膏状物加水10-20倍溶解至透明，然后在-4℃条件下冷藏陈放12h，冷藏陈放结束后除去不溶物，并将得到的清液分别用石油醚、乙酸乙酯进行提取；然后在50℃以下减压浓缩至相应浸膏，备用；

步骤三、取步骤二石油醚浸膏多为色素舍弃。取步骤二乙酸乙酯浸膏，用乙酸乙酯再次溶解后，用硅胶柱分离纯化。tlc选择石油醚：乙酸乙酯常压柱色谱进行分离，梯度洗脱。湿法上样，然后依次用体积比为15:1、13:1、10:1、9:1、7:1、7:3、5:4、1:1、3:7、4:5、1:7、1:9和乙酸乙酯部位的石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱；洗脱得到的馏分均采用tlc进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-8，备用；

步骤四、将步骤三得到的馏分段1运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂选用环己烷：乙酸乙酯10:1、8:2、6：4和1：1作为梯度洗脱剂依次洗脱分离，合并收集馏分10份，将馏分在室温下放置，然后将有固体析出1-3馏分进行过滤，得到一个黄色固体粉末状化合物i（28.9mg），被鉴定为呋喃香豆素（如图1核磁共振氢谱所示）；馏分5-9合并后经小硅胶柱环己烷：乙酸乙酯8:2、6：4和1：1洗脱纯化，去除溶剂干燥后得到黄色透明胶状化合物ⅱ(19.7mg)，化合物ii被推断是一个新化合物，被命名为3-甲基，7-甲酰酯基，4-羟基吡喃香豆素；

将步骤三得到的馏分段3（石油醚：乙酸乙酯10:1-9:1）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物ⅲ，被鉴定β-谷甾醇(30.0mg)；

将步骤三得到的馏分段5（石油醚：乙酸乙酯9:1-7:3）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色残渣和母液，过滤后将透明溶液浓缩至干燥，即的纯品化合物ⅳ(12.5mg)；经过波谱分析被推定为有一个新化合物，被命名为双环[2,2,2]呋喃-2,5-环内酐

将步骤三得到的馏分段4（石油醚：乙酸乙酯5:4、1:1、3:7、4:5-0:1）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为10:1、9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，不断收集馏分后并将馏分在室温下放置，发现馏分3-11有固体洗出。将有固体析出的馏分合并进行离心得到白色固体；通过氯仿和甲醇重结晶，即得到白色固体粉末化合物异构体v和vi(15.0mg)；将过滤后的母液继续放置，二次结晶被析出，收集固体合并，反复用氯仿淋洗，即可得到浅黄色固体粉末化合物异构体vii和viii(9.4mg)。经红外光谱和核磁共振波谱分析，化合物v和vi、vii和viii均为新化合物，他们分别被命名为：5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐（v），和5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐（vi）；5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐（vii）和5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐（viii）。

实施例3：

从无花果中提取环氧化合物和酸酐的方法：

步骤一、取无花果中农红品种果实切片后15kg，冷冻干燥；室温条件下将冻干果干用其重量10-20倍的质量浓度为70%乙醇冷浸，超声辅助提取和过滤，经固液分离后，固体残渣风干后，重复上述冷浸2-3次；将过滤滤液合并，放置过夜，滤去下层沉淀，然后上清液蒸发浓缩；得到70%乙醇浸膏，备用；

步骤二、将步骤一得到的浸膏状物加水10-20倍溶解至透明，然后在-4℃条件下冷藏陈放12h，冷藏陈放结束后除去不溶物，并将得到的清液分别用石油醚、乙酸乙酯进行提取；然后在50℃以下减压浓缩至相应浸膏，备用；

步骤三、取步骤二石油醚浸膏多为色素舍弃。取步骤二乙酸乙酯浸膏，用乙酸乙酯再次溶解后，用硅胶柱分离纯化。tlc选择石油醚：乙酸乙酯常压柱色谱进行分离，梯度洗脱。湿法上样，然后依次用体积比为15:1、13:1、10:1、9:1、7:1、7:3、5:4、1:1、3:7、4:5、1:7、1:9和乙酸乙酯部位的石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱；洗脱得到的馏分均采用tlc进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-10，备用；

步骤四、将步骤三得到的馏分段1运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂选用环己烷：乙酸乙酯10:1和8:2依次梯度洗脱分离，合并收集馏分，并将馏分在室温下放置，有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物粉末i(38.2mg)，被鉴定为呋喃香豆素。进一步在8:2馏分的液体干燥后，得到一个黄色透明胶状物，tlc分析为纯品，经波谱分析鉴定为化合物ⅱ(22.1mg)。化合物ii被推断是一个新化合物，被命名为3-甲基，7-甲酰酯基，4-羟基吡喃香豆素。

将步骤三得到的馏分段3（石油醚：乙酸乙酯10:1-9:1）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物ⅲ，被鉴定β-谷甾醇(42.0mg)；

将步骤三得到的馏分段5（石油醚：乙酸乙酯9:1-7:3）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色残渣和母液，过滤后将透明溶液浓缩至干燥，即的纯品化合物ⅳ(18.2mg)；经过波谱分析被推定为有一个新化合物，被命名为双环[2,2,2]呋喃-2,5-环内酐

将步骤三得到的馏分段4（石油醚：乙酸乙酯5:4、1:1、3:7、4:5-0:1）运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为10:1、9:1、7:3、1:1和3:7的环己烷：丙酮溶液，不断收集馏分后并将馏分在室温下放置，发现馏分3-11有固体洗出。将有固体析出的馏分合并进行离心得到白色固体；通过氯仿和甲醇重结晶，即得到白色固体粉末化合物异构体v和vi(27.9mg)；将过滤后的母液继续放置，二次结晶被析出，收集固体合并，反复用氯仿淋洗，即可得到浅黄色固体粉末化合物异构体vii和viii(12.0mg)。经红外光谱和核磁共振波谱分析，化合物v和vi、vii和viii均为新化合物，他们分别被命名为：5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐（v），和5，6-双【1',1"-二异丙烷基】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐（vi）；5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环内酐（vii）和5，6-双-【1'-戊烯-3',1"-（4"-甲基）-戊烯-3"】-环氧己烷基-2,3-二【2,2,1】-环庚烷二甲酸酐环外酐（viii）。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。