本发明涉及金属配合物，具体为一种含1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺的配合物及制备方法、应用，属于化学制药领域。
背景技术：
在1965年，顺铂的合成彻底的改变了仅靠放疗来治疗癌症的现状，并且由此而衍生出的许多顺铂衍生物也已被进行了生物学评估。随着人们的不断深入研究，顺铂，卡铂和奥沙利铂三种铂类抗癌药成为全球范围内批准的金属抗癌药物，且是全球唯一以金属为基础的在临床中使用的抗癌药。金属配合物用于所有肿瘤的约50％治疗，但它们的使用往往伴随毒副作用，如肾毒性以及药剂依赖性等，关于铂类抗癌药物最主要的一个限制条件是通过细胞小分子（特别是谷胱甘肽）失活并会流出细胞。为了克服这些顺铂在制药研究中的局限性，不断地开拓新渠道成为迎接这些挑战的主要策略，包括寻求使用铂以外的金属配合物及改变配合物的基本骨架结构等，而铱表现出来的各种良好的生物活性使其进入大众视野。基于这些金属之间的化学差异，分子机制的光谱行动和潜在的适应症可以大大扩大，从而对癌细胞的影响最大化并使其不良副作用的问题最小化。因此，广泛研究过渡金属药物来对抗恶性肿瘤成为目前的发展趋势。
近几年关于抗肿瘤活性铱（ir）配合物被陆续报道，刘哲、peterj.saler等发现五甲基环戊二烯基iriii有机金属配合物作为新型抗癌活性的配合物可以作为潜在的抗癌药物。目前所合成的五甲基环戊二烯基iriii有机金属配合物大多为n^n、c^c或c^n配体的铱配合物。钌类配合物是最具发展潜力的国际上公认的抗肿瘤药物，是继铂之后最有希望成为毒性低、活性高的金属之一。目前已有上百种钌的配合物被合成出来。1987年keppler合成了在体内取得很好的效果的icr。alessio于1998年合成namfa，它是第1个进入临床的钌配合物，继namfa之后kp1019是第2种进入临床试验的钉配合物。现有技术中制备的配合物，抗癌活性仍有待提高，且没有关于半三明治结构自身发光在细胞内成像的研究。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种含1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺的配合物，该配合物为半三明治金属配合物。
本发明还提供了一种含1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺的配合物的制备方法。
本发明还提供了上述半三明治金属配合物的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种含1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺的配合物，该金属配合物的分子结构式为：
і
式（і）中，所述r1为芳基、芳胺基、芳醇基、伞花烃或卤代芳基、环戊二烯基、1.2.3.4.5-五甲基环戊二烯基、以及被卤代环烷基、卤代芳基、芳基、卤素取代的环戊二烯基；r2为氢、烷基、氨基、醇羟基、卤素或卤代烷基、卤代环烷基；m为铂系金属。
进一步的，所述m为铁、钌、锇、铂、钴、铑、铱。
进一步的，本发明合成的配合物的优化的化学结构式如下：
本发明还提供了一种上述配合物的制备方法，该方法由式(ii)所示铱二聚体与式(iii)反应得到式(i)所示配合物：
进一步的，所述配合物为配合物1-6时，具体步骤如下：
配合物1：将50.0mg铱二聚体（式（i）r1为1.2.3.4.5-五甲基环戊二烯基，r2为氢，m为金属铱），46.3mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。
配合物2：将50.0mg铱二聚体（式（i）r1为4-（2.3.4.5-四甲基环戊二烯）-1’1-联苯基，r2为氢，m为金属铱），43.6mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。
配合物3：将50.0mg钌二聚体（式（iii）r1为苯基，r2为氢，m为金属钌），63.1mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。
配合物4：将50.0mg钌二聚体（式（iii）r1为伞花烃，r2为氢，m为金属钌），57.5mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。
配合物5：将50.0mg钌二聚体（式（iii）r1为4-(1.4-环己二烯)-丙醇、r2为氢，m为金属钌），60.0mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。
配合物6：将50.0mg钌二聚体（式（iii）4-(1.4-环己二烯)-丁醇、r2为氢，m为金属钌），51.9mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。
本发明还提供了一种上述半三明治金属配合物在抗癌和细胞成像药物中的应用。
本发明制备的金属配合物中n^n配体的配位中心原子是一个电子非对称结构，氮原子为非常强的σ-供电子体，能够稳定金属；而苯基有一定的共轭作用，能够为配合物的化学和生物活性提供可变性。因此，我们合成了n^n作为两齿螯合的中性配体，一种新型的具有较高抗癌活性,同时能在细胞内成像的金属配合物。
本发明的有益效果为：
（1）本发明制备的配合物能够赋予整个配合物以高抗癌活性，线粒体靶向性，核靶向性，对癌细胞可具有选择性，对药物靶向性的研究具有重大意义。
（2）本发明以n^n作为两齿螯合的阴离子配体，合成出一种新型的具有较高抗癌活性配合物，该配合物在抗癌及细胞成像中效果好，活性高。
（3）本发明具有工艺简单、成本低廉、化学组分易于控制、重复性好并产量高等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的配合物1的核磁氢谱。
图2为本发明实施例2制备的配合物2的单晶结构。
图3为本发明实施例2制备的配合物2的核磁氢谱。
图4为本发明实施例3制备的配合物3的单晶结构。
图5为本发明实施例3制备的配合物3的核磁氢谱。
图6为本发明实施例4制备的配合物4的单晶结构。
图7为本发明实施例4制备的配合物4的核磁氢谱。
图8为本发明实施例5制备的配合物5的核磁磷谱。
图9为本发明实施例6制备的配合物6的核磁碳谱。
图10为本发明配合物在细胞内靶向细胞器的成像。
图11为本发明配合物在细胞内吸收机制的研究。
具体实施方式
本发明由下述一些代表性化合物的实施例得到进一步阐述，但这些说明并不限制本发明。
在化合物的合成中所用起始化合物是商品化产品或能够从已知合成方法制备，所有有机化合物的制备方法可从文献中获得，并且这些方法对合成化学家是基本的和显而易见的。因此，以下合成方法的描述可认为是详细的和具体的。
实施例1
将50.0mg铱二聚体（式（i）r1为1.2.3.4.5-五甲基环戊二烯基，r2为氢，m为金属铱），46.3mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。产率:52.48mg(61.3%)。
如图1所示，核磁表征为：[(η5-cp*)ir(n^n)cl]pf6(1).1hnmr(500mhz,dmso)δ8.61(d,j=4.7hz,1h),8.33(d,j=7.9hz,1h),7.98(t,j=7.0hz,1h),7.77(s,1h),7.51(ddd,j=7.5,4.8,1.1hz,1h),7.37(t,j=7.5hz,6h),7.31(t,j=7.3hz,3h),7.24–7.21(m,6h),1.75(s,15h).anal.calcd.for[(η5-cp*)ir(n^n)cl]pf6(856.3):c,49.09;h,4.12;n,3.27;found:c,49.20;h,4.02;n,3.83.ms:m/z711.34[(η5-cp*)ir(n^n)cl]+。
实施例2
将50.0mg铱二聚体（式（i）r1为4-（2.3.4.5-四甲基环戊二烯）-1’1-联苯基，r2为氢，m为金属铱），43.6mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体，配合物2的单晶结构如图2所示。产率:40.05mg（40.3%）。
如图3所示，核磁表征为：[(η5-cpxbiph)ir(n^n)cl]pf6(2).yield:40.05mg,40.3%.1hnmr(500mhz,dmso)δ13.59(d,j=9.6hz,2h),9.54(d,j=9.7hz,3h),8.80(d,j=5.4hz,2h),8.57–8.13(m,5h),8.05–7.65(m,8h),7.64–7.23(m,8h),1.83(dd,j=33.5,10.8hz,12h).anal.calcd.for[(η5-cpxbiph)ir(n^n)cl]pf6(994.47):c,55.56;h,4.16;n,2.82;found:c,54.20;h,4.32;n,2.73.ms:m/z849.7[(η5-cpxbiph)ir(n^n)cl]+。
实施例3
将50.0mg钌二聚体（式（iii）r1为苯基，r2为氢，m为金属钌），63.1mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体，配合物3的单晶结构如图4所示。产率:45.43mg(61.3%)。
如图5所示，核磁表征为：[(η6-bz)ru(n^n)cl]pf6(3).1hnmr(500mhz,dmso)δ9.63(d,j=5.3hz,1h),8.78(s,1h),8.32(d,j=7.9hz,1h),8.26(t,j=8.2hz,1h),7.89–7.86(m,1h),7.45(ddd,j=27.3,19.4,7.3hz,15h),5.61(s,6h).anal.calcd.for[(η6-bz)ir(n^n)cl]pf6(708.04):c,52.59;h,3.70;n,3.96;found:c,50.20;h,3.62;n,3.86.ms:m/z527.93[(η6-bz)ir(n^n)]+。
实施例4
将50.0mg钌二聚体（式（iii）r1为伞花烃，r2为氢，m为金属钌），57.5mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体，配合物4的单晶结构如图6所示。产率:55.31mg,72.4%。
如图7所示，核磁表征为：[(η6-p-cym)ru(n^n)cl]pf6(4).1hnmr(500mhz,cdcl3)δ9.48(s,1h),8.37(s,2h),8.06(s,2h),7.84(d,j=61.2hz,3h),7.47(dd,j=46.9,7.3hz,12h),5.83(s,1h),5.27(s,1h),4.71(s,1h),4.48(s,1h),2.43(s,1h),2.17(s,3h),1.00–0.76(m,6h).anal.calcd.for[(η6-p-cym)ir(n^n)cl]pf6(764.15):c,55.01;h,4.48;n,3.67;found:c,55.20;h,4.52;n,3.76.ms:m/z584.75[(η6-p-cym)ir(n^n)+h]+。
实施例5
将50.0mg钌二聚体（式（iii）r1为4-(1.4-环己二烯)-丙醇、r2为氢，m为金属钌），60.0mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。产率:53.51mg(69.8%)。
如图8所示，核磁表征为：[(η6-bz-pa)ru(n^n)cl]pf6(5).1hnmr(500mhz,dmso)δ9.57(d,j=5.3hz,1h),8.76(s,1h),8.35–8.21(m,3h),7.92–7.81(m,2h),7.45(ddd,j=26.9,15.6,7.3hz,13h),5.71(t,j=6.0hz,1h),5.66(d,j=6.3hz,1h),5.38(t,j=5.6hz,1h),5.03–4.96(m,2h),4.55(t,j=5.0hz,1h),2.45–2.38(m,2h),1.65(ddd,j=12.9,8.8,5.4hz,2h),1.53(ddd,j=13.5,11.1,6.7hz,2h).anal.calcd.for[(η6-bz-pa)ir(n^n)cl]pf6(766.12):c,53.30;h,4.21;n,3.66;o,2.09;found:c,54.20;h,4.32;n,3.79;o,2.12.ms:m/z586.72[(η6-bz-pa)ir(n^n)+h]+。
实施例6
将50.0mg钌二聚体（式（iii）4-(1.4-环己二烯)-丁醇、r2为氢，m为金属钌），51.9mg1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-yl)亚乙基)甲胺置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。产率:50.72mg(65.0%)。
如图9所示，核磁表征为：[(η6-bz-ba)ru(n^n)cl]pf6(6).1hnmr(500mhz,dmso)δ9.56(d,j=5.4hz,1h),8.76(s,1h),8.31(d,j=6.5hz,1h),8.26(t,j=7.7hz,1h),7.88(t,j=5.8hz,1h),7.45(ddd,j=26.8,14.7,7.3hz,13h),5.73(dd,j=13.6,7.7hz,2h),5.64(d,j=5.9hz,1h),5.40(t,j=5.6hz,1h),5.02(t,j=6.0hz,1h),4.96(d,j=6.5hz,1h),2.38–2.29(m,2h),1.64–1.27(m,6h).anal.calcd.for[(η6-bz-bair(n^n)cl]pf6(780.14):c,53.88;h,4.39;n,3.59;o,2.05;found:c,54.70;h,4.42;n,3.79;o,2.16.ms:m/z600.35[(η6-bz-bair(n^n)+h]+。
对比例1
合成配合物7[(η5-c5me5)ir(l1)cl]pf6(7).将50.0mg铱二聚体（式（i）r1为1.2.3.4.5-五甲基环戊二烯基，结构式如l1，m为金属铱），40.2mgl1置于250ml希莱克（schlenk）瓶中中，抽真空，同氮气三次，用针头加入20ml分析纯的乙醇，室温下搅拌24h，加入60mgkpf6，用旋转蒸发仪旋干，后用ch2cl2溶解，硅藻土过滤，用扩散法重结晶，得到红色晶体。产量:37.5mg,52.2%。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ9.52(s,1h),9.05(d,j=5.5hz,1h),8.37(dt,j=15.2,6.4hz,2h),8.00–7.97(m,1h),7.38–7.35(m,1h),7.30(dd,j=8.0,5.5hz,2h),2.29(s,3h),2.09(s,3h),1.42(s,15h).13cnmr(126mhz,dmso-d6)δ174.30(s),155.37(s),152.99(s),147.10(s),141.17(s),132.28(s),131.32(s),130.53(d,j=15.4hz),129.72(s),129.15(s),128.87(s),90.98(s),19.93(s),19.11(s).anal.calcd.for[(η5-c5me5)ir(l1)cl]pf6(718.13):c,40.14;h,4.07;n,3.90;found:c,40.02;h,4.02;n,3.83.ms:m/z538.61[(η5-c5me5)ir(l2)+h]+。
该对比例制备的配合物7的细胞成像效果差。
效果实施例
（一）具抗癌活性的配合物1~6对肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
(1)待测化合物的配制：
将固体配合物1~5分别溶解在dmso中，配成一定浓度的储备液，用细胞培养液进一步稀释储备液直到达到工作浓度，培养24h；
(2)细胞生长抑制实验(mtt法)：
1)取5000个子宫颈癌细胞(hela)或肺癌细胞（a549），配制成细胞悬液，接种于96孔培养板中；
2)用无药培养基预培养细胞，5％co2，310k孵育24小时，加入配制好的待测化合物，培养24h；
3)每孔加入15μl5mg/ml的mtt溶液，继续培养4小时，形成紫色结晶物质甲瓒；
4)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μl的dmso充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，酶标仪用波长为570nm测定各孔的光密度值；
5)每个实验重复三次，ic50=平均值±sem
配合物1~6及顺铂对子宫颈癌细胞(hela)及肺癌细胞（a549）生长的抑制率见表1。
表1
通过表1可以看出，配合物1~6茂环r1及金属的改变对于两种癌症细胞都表现出非常大的影响，对于a549细胞，配合物2和3的抗癌活性基本与商业化的顺铂抗癌药持平外，配合物5的抗癌活性稍微弱于顺铂，而配合物1的抗癌活性是顺铂的4倍左右。此外，当m为金属铱时r1由4-（2.3.4.5-四甲基环戊二烯）-1’1-联苯基变为1.2.3.4.5-五甲基环戊二烯基时，抗癌活性提高5倍左右；当m为金属钌时将r1位置的4-(1.4-环己二烯)-丙醇改变4-(1.4-环己二烯)-丁醇时，抗癌活性降低；对于钌与铱的比较，金属铱配合物的抗癌活性明显高于金属钌配合物。含1,1,1-三苯基-n-(1-(吡啶-2-亚甲基)甲胺配体的金属配合物抗癌活性明显优于配合物7，这说明取代基的修饰对抗癌活性会产生很大影响。
（二）细胞成像实验实验步骤：
a549细胞放在6孔板中孵化24小时，加入mtdr(线粒体染色剂)/ltdr（溶酶体染色剂）100nm,37度孵化30分钟，加入配合物1/310μｍ，共孵化30分钟后，用冷的pbs洗三次，立即在双光子激光共聚焦显微镜下观察。
实验结果得出：从图10中可以看出，配合物130分钟便进入细胞核，而配合物3首先在细胞质中，与线粒体和溶酶体有很好的共定位，在8小时后进入细胞核，与细胞毒性配合物1ic50=6.5±0.6配合物3ic50=32.0±1.2，比较可知直接靶向细胞核更能促进癌细胞凋亡，导致这一现象的原因是细胞核是控制一切代谢活动的中心。
（三）细胞吸收机制实验
a549细胞放在6孔板中孵化24小时，分别加入氯喹/cccp50μｍ,孵化60分钟，加入配合物1/310μｍ，37度共孵化30分钟后，同时4度与37度平行进行共孵化30分钟后，用冷的pbs洗三次，立即在双光子激光共聚焦显微镜下观察。
氯喹是包吞抑制剂，cccp是能量抑制剂，由图11可得包吞对细胞吸收的一直并不明显，然而当加入cccp时基本完全抑制了细胞吸收，这说明配合物是依靠能量的方式进入细胞的，小分子进入细胞主要能量依赖型（主动运输，包吞）非能量依赖型（协助扩散，自由扩散）由此可知配合物1和3都是主动运输进入细胞的。